Extracto
pancreático adenocarcinoma ductal es un problema de salud sin resolver con casi el 75% de los pacientes diagnosticados con enfermedad avanzada y una tasa de supervivencia global a 5 años cerca de 5%. A pesar de la fuerte relación entre la mortalidad y los tumores malignos, los mecanismos detrás de difusión cáncer de páncreas y metástasis son poco conocidos. cultura patológica y de células correlativa análisis sugieren el receptor de quimiocinas CXCR4 juega un papel biológico en la progresión del cáncer de páncreas.
se investigaron in vivo
roles para el CXCR4 ligando CXCL12 en la malignidad del cáncer de páncreas. CXCR4 y CXCR7 se expresaron constantemente en el epitelio normal y canceroso pancreático ductal, líneas celulares establecidas, y las células de cáncer primario derivadas del paciente. En relación con los conductos exocrinas sanos, la expresión de CXCL12 fue reprimida patológicamente en muestras de tejido de cáncer de páncreas y líneas celulares derivadas del paciente. Para probar las consecuencias funcionales de silenciamiento CXCL12, las líneas celulares de cáncer de páncreas de forma estable fueron diseñados expressingthe de quimioquinas. En consonancia con el papel de CXCL12 como un supresor de tumores, las células que producen la quimiocina wereincreasingly adherente y la migración deficiente
in vitro
y mal metastásico
in vivo
, en comparación con las células control. el crecimiento del tumor Además, CXCL12 reintroducción redujo significativamente
in vitro, España con tumores significativamente menores
in vivo
, dando lugar a una ventaja de supervivencia pronunciada en un modelo preclínico. En conjunto, estos datos demuestran un papel supresor tumoral funcional para la expresión normal de CXCL12 en los conductos pancreáticos, regulando tanto andcellulardissemination el crecimiento del tumor a los sitios metastásicos
Visto:. Roy I, Zimmerman NP, Mackinnon AC, Tsai S, Evans DB, Dwinell MB (2014) CXCL12 expresión de quimioquinas suprime el crecimiento de cáncer pancreático humano y la metástasis. PLoS ONE 9 (3): e90400. doi: 10.1371 /journal.pone.0090400
Editor: Jeffrey K. Harrison, Universidad de Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de noviembre de 2013; Aceptado 29 de enero de 2014; Publicado: 4 Marzo 2014
Copyright: © 2014 Roy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la a más saludable Wisconsin y el Centro de cáncer MCW. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Tenemos los siguientes intereses. El Dr. Dwinell es un receptor de una patente (# 8404640) para el uso de CXCL12 en el tratamiento de los cánceres malignos y es un co-fundador de la proteína de fundición, LLC. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera nuestra adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores. El título de la patente es: "Método para el diagnóstico y tratamiento del cáncer de colon"
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) se anunrelenting forma de cáncer humano, sin técnica eficaz para el diagnóstico precoz. o tratamiento, y una incidencia casi igual a la mortalidad [1], [2]. La mayoría de los pacientes, en el momento del diagnóstico, ya tienen enfermedad localmente avanzada o metastásica, haciendo la resección quirúrgica del tumor primario de valor terapéutico limitado [3] terapias farmacéuticas para .Current PDAC son inadecuadas ya que la gran mayoría de los pacientes con cáncer de páncreas mueren de micro - o enfermedad macro-metastásico [4]. Se necesita una mejor comprensión de los mecanismos biológicos que subyacen a la agresividad del PDAC. Aunque estudios recientes han determinado los factores moleculares implicados en la progresión de [5] PDAC - [7], se sabe poco sobre los mecanismos biológicos que regulan la motilidad celular y, a su vez, la metástasis. citocinas quimiotácticas, o quimiocinas, juegan keyroles en la migración celular, y son capaces de coordinar los múltiples aspectos de la maquinaria de la migración celular. A través de la activación de sus receptores, chemokinesregulate varias facetas de la fisiología normal, incluyendo el tráfico de leucocitos, la migración de células epiteliales necesario para el cierre de heridas, la vascularización del tejido, y el desarrollo de órganos durante la embriogénesis [8] - [10]. Anteriormente, nuestro laboratorio revealedthe importancia de la expresión dual de la quimiocina CXCL12 y su cognado receptor CXCR4 en la migración de los enterocitos, cicatrización de heridas y la angiogénesis [11] - [16]
Varios estudios han implicado a un papel para la quimioquina. receptores, en particular CXCR4 y CCR7, en la progresión del cáncer y la metástasis [9], [17] - [22]. CXCR4 expresión se ha relacionado con la malignidad de más de 20different tipos de cáncer [17], [23]. Hemos demostrado previamente que CXCL12 se expresa en células epiteliales normales de intestino y las glándulas mamarias, pero se silencia epigenetically en mama humano y el cáncer de colon [24], [25] .Este patrón de repressionresults genes CXCL12 en las células tumorales cuya quimiocina - receptor profilesmirror que de leucocitos altamente móviles, que expresan los receptores CXCR4 y cxcr7 pero no el ligando. Hemos demostrado que la re-expresión de CXCL12 disminuyó la capacidad de las células de cáncer de mama y colorrectal metástasis [24] - [26] Los estudios .Several haveextended esas conclusiones fundamentales para demostrar los efectos beneficiosos de CXCL12 autocrina de mama, pulmón, gástrico y de cabeza y cánceres del cuello [27] - [30]. La pérdida de CXCL12expression en el osteosarcoma y cáncer de mama tumor paciente specimenswas correlaciona con peor pronóstico [31] - [34]. En el cáncer de páncreas, informes contradictorios e incompletos sugieren ya sea que la expresión de CXCL12 es elevado o que CXCL12 no se expresa en la inmensa mayoría de los pacientes [35], [36]. Así, mientras un creciente cuerpo de evidencia sugiere un papel supresor de tumor de CXCL12 en la malignidad del cáncer humano, sus funciones mecánicas en PDAC siguen siendo poco conocidos.
El modelo predominante de la metástasis del cáncer es que los tumores malignos se diseminan a través de los tejidos distantes la sobre-expresión de CXCR4 [22], [37], [38], la sensibilización de las células malignas de esta manera a extenderse en respuesta a gradientes distantes de CXCL12 producidas por órganos de destino metastásicos. Este modelo también se ha utilizado para explicar PDAC metástasis, como varios informes documentan la expresión de CXCR4 por las líneas celulares de carcinoma de páncreas y tejidos humanos [39] - [42]. Sin embargo, ninguno de estos estudios han examinado rigurosamente la expresión paralela de CXCL12 o CXCR7 en el contexto de CXCR4 o definido expresión de cualquiera de los tres componentes de este eje de quimioquinas en objetivos epithelium.The pancreáticas normales de nuestro estudio fueron determinar el perfil de expresión y papel funcional del eje de CXCL12-CXCR4-cxcr7 en ambos páncreas normales y malignas sanos. Aquí, nuestros datos demuestran que mientras que se aumenta la expresión del receptor, la expresión de CXCL12 se reduce significativamente en el tejido resecado PDAC y una batería de líneas celulares de cáncer en comparación con ofpancreatic páncreas normal. CXCL12 expresión transitoria fue restaurado usando inhibidores de reintroducción repression.Stable epigenética de CXCL12 en las células PDAC impedía dirigido la migración celular y la metástasis hepática y ralentizó el crecimiento del tumor
e in vitro
in vivo
, resultando en una mayor la supervivencia en modelos preclínicos.
Materiales y Métodos
declaración de Ética
, páncreas normal, sin identificación, muestras de tejidos y células, PDAC PDAC derivados del paciente únicos exentos se obtuvieron a partir la oncología quirúrgica biorepositorio utilizando un Colegio Médico de Wisconsin (MCW) Junta InstitutionalReview#4 protocolo aprobado. Tejidos y células dentro del biobanco se obtuvieron de los pacientes tras el consentimiento informado por escrito firmado y se codifican y se aplica el anonimato, con la información de identificación personal no se comparte con los investigadores de investigación. Los estudios preclínicos de xenoinjertos de ratón se terminaron usando protocolos y procedimientos documentados en una aplicación de uso animal creado (AUA076) aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo MCW Institucional y de acuerdo con las directrices establecidas por la Oficina del Laboratorio de Bienestar Animal y de conformidad con la Guía para el Cuidado y el uso de LaboratoryAnimals. Todos los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos, recibieron alimentos y agua ad libitum, y se mantuvieron en un 10hr: 14-hr ciclo luz /oscuridad en una habitación con temperatura controlada (25 ± 2 ° C) .los animales fueron sacrificados en la terminación del estudio o después de signos de sufrimiento o la mala condición corporal según lo evaluado por personal de laboratorio experto y confirmado por los veterinarios del personal del Centro de recursos MCW Biomédica para mejorar el dolor y la angustia asociada con la formación de tumores.
líneas celulares de cáncer pancreático humano
Panc1 (CRL-1469), MiaPaca2 (CRL-1420), líneas de células Capan2 (HTB-80), y HPAFII (CRL-1997) se adquirieron de la ATCC. líneas de células Panc1 y MiaPaca2 se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS). Las líneas celulares Capan2and HPAFII se mantuvieron en 10% (v /v) FBS medio suplementado 5Aor MEM de McCoy, respectivamente. En algunos experimentos, las células cultivadas en medio normal se trataron diariamente con 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza) o tricostatina A (EMD Biosciences). líneas celulares fueron transfectadas con MiaPaca2 Firefly-luciferasa bajo selección zeocina. células MiaPaca2 de luciferasa que expresan resultantes se transfectaron posteriormente con plásmidos que codifican ya sea eGFP o CXCL12 humana, y los clones cultivados bajo condiciones de selección neomicina [26]. Las líneas celulares se des-identificarse de todos los parámetros de identificación de los pacientes que consienten individuales con cáncer de páncreas y se confirmó que eran de origen PDAC siguiente cariotipo de ADN y análisis de la expresión de proteínas.
tissuespecimens pancreáticos humanos
conductos normales y lesiones PanIN fueron aislados exclusivamente de los descartes de tejidos normales adyacentes de trasplante de órganos o de las operaciones de páncreas que no implican PDAC o otros tumores malignos exocrinas. Estado de la enfermedad de esas tissueswas normales y tumorales confirmados por un total de pathologist.A certificado por el consejo de 25 tejidos de 21 pacientes fueron utilizadas para los análisis normales. Un total de 82 tejidos de 29 pacientes diferentes se utilizaron para los análisis de tumores. De los 29 pacientes que proporcionan tejido PDAC, 11 pacientes habían recibido terapia neoadyuvante.
RT-PCR
Se aisló ARN de las células y muestras de tejido utilizando el kit RNAeasy (Qiagen) y se trató con DNasa (Ambion), convertido a cDNA, y CXCL12, CXCR4, CXCR7, y la expresión de GAPDH transcripción analizó como se ha definido anteriormente y optimizado para la eficacia en un rango lineal [24], [43] .A región de la región 5 'no traducida de el gen de la lectina de unión a manosa se amplificó para detectar contaminantes de ADN genómico [12]
inmunoanálisis
portaobjetos sin teñir se generan a partir de muestras de tumores de páncreas y CXCL12 immunostained utilizando un anticuerpo del amplificador de I +;.; D Systems (mab350 ). La citoqueratina-19 (CK19) (ab7754), CXCR4 (ab2074), CXCR7 (ab38089 & amp; ab72100), y Ki-67 (ab15580) fueron detectados utilizando anticuerpos de Abcam.Visualization se realizó utilizando anticuerpos secundarios de rábano picante conjugada con peroxidasa de y la 3,3'-diaminobenzidinePeroxidase sustrato kit (vector Labs). Para evitar la interferencia de fondo de diapositivas no se contratiñeron. los niveles de expresión de proteínas fue evaluado utilizando una escala de 4 puntos [0 = ausente, 1 = débil, 2 = mixta, y 3 = fuerte intensidad de la tinción] [44]. Los análisis se realizaron de forma independiente por un investigador ciego para el estado de la enfermedad y el protocolo de inmunotinción. Secretada proteína CXCL12 a partir del sobrenadante de células de cáncer pancreático se cultivan en medio libre de suero se detectó mediante sándwich ourpreviously establecido método ELISA usando anticuerpos de amp I +; D Systems (ratón monoclonal y CXCL12 humana (MAB350) y de cabra CXCL12 anti-humana (BAF310) [24 ] CXCR4 o CXCR7was superficie .Cell detectados utilizando los anticuerpos antes mencionados (Abcam) a lo largo de anticuerpos secundarios withFITC conjugados usando nuestro método previamente establecido [43]. brevemente, las células se cultivaron en medio de crecimiento normal, levantaron usando tampón de disociación libre de enzima, se lavó usando PBS estéril, y después se incubaron en una solución de bloqueo que contiene BSA y suero anticuerpo secundario. Después de bloquear enfriado en hielo, las células se incubaron primero con el anticuerpo primario y luego con el anticuerpo secundario conjugado con FITC. por último, se fijaron las células y se analizaron por citometría de flujo ( LSR II, BD Biosciences).
in vitro
ensayos tumorigénesis
las células se sembraron al pocillo superior con quimio-atrayentes añadidos al fondo del pozo y la migración transwell o quimioinvasión enumerado en un conjunto representativo de las imágenes tomadas después de la tinción fluorescente como se describe anteriormente [43], [45]. La membrana así superior se recubrió con colágeno en los ensayos de migración y con Matrigel (BD Biosciences) en la invasión y la migración celular assays.Panc1 HPAFII se midió después de la estimulación 24 horas en cultivos polarizados mientras que la migración de células MiaPaca2 se midió después de 6 horas.
proliferación inicial y apoptosis de líneas celulares de PDAC se definió usando el ensayo de citometría de flujo ViaCount (Millipore), o el /7 ensayo glo (Promega) .Briefly, se sembraron las células en 10% (v /v) de suero que contiene 3-caspasa medio, y una vez adherente (durante la noche) se cambiaron a medio libre de suero. Análisis del ciclo celular se realizó mediante tinción con yoduro de propidio y análisis de citometría de flujo, como se ha hecho anteriormente [43]. En algunos experimentos se cultivaron células en 1% (v /v) de medio que contenía suero después de 24 horas de starvation.Gemcitabine suero (GEM), un fármaco quimioterapéutico bien establecida en pacientes con cáncer de páncreas, se utilizó como control positivo para el crecimiento disminuido y el aumento de la apoptosis.
en vivo
estudios e imágenes de bioluminiscencia
Un modelo de inyección intraesplénico heterotópico establecida [46] fue evaluar usedto homing metastásico y la extravasación en el hígado. Seis semanas de edad ratones SCID inmunodeficientes fueron anestesiados y 1 × 10
6MiaPaCa2luciferasecells se inyectaron en la spleenthrough una escisión de la pared lateral y el crecimiento tumoral y la metástasis controlaron usando imágenes de bioluminiscencia cada 7 días utilizando un enfoque descrito previamente [26]. Después de 28 días, los ratones fueron sacrificados y la formación de tumores en el bazo y el hígado miden
ex vivo usando imágenes de bioluminiscencia. Se empleó un modelo ortotópico según lo establecido anteriormente [47], con 1 × 10
6 células inyectadas en el páncreas de ratones SCID y progresión de la enfermedad supervisados. Los ratones fueron retirados del estudio cuando thetumor tamaño alcanzó 1000 mm
3 volumen y 1 × 10
9p /seg /cm
2 /steradianradiance.Three ratones injertados con células que expresan CXCL12 fueron retirados por falta de veterinaria motivos de estudio debido a la lucha interna en forma de jaula.
Los análisis estadísticos
múltiples comparaciones entre grupos se analizaron mediante un ANOVA de una vía y un análisis de Dunnett
post-hoc y usados para identificar por pares diferencias (GraphPad Prism 4). Los análisis emparejados se calcularon utilizando un Mann-Whitney o la prueba de log-rank en su caso. La significación estadística se definió como
P
≤0.05.
Resultados
recíproco CXCL12, expresión de CXCR4, y CXCR7 en el adenocarcinoma ductal pancreático
Las funciones de CXCR4 , CXCR7 o CXCL12 en la progresión del cáncer de páncreas permanecen basan en análisis limitado sin análisis simultáneo de los tres componentes en tanto tissue.Immunostaining normal y enfermo de anticuerpos específicos de tejido de serie sectionswith, tinción CXCL12 revealedrobust en las células epiteliales ductales normales de señalización de quimioquinas, con los mismo epitheliaalso tinción positiva para CXCR4 y CXCR7 (figura 1A & amp; Fig. 2A). expresión de quimioquinas CXCL12 se restringió específicamente al compartimento ductal y ausente de las células acinares y endocrino, los cuales se tiñeron para los receptores de quimiocinas CXCR4 y cxcr7 (datos no mostrados). La incubación de las secciones paralelas con anticuerpos de control de isotipo confirmedspecificity (Fig. 2A). A continuación examinó la expresión de las lesiones pancreáticas pre-malignas, conocidas como neoplasias pancreáticas intra-epiteliales (PanINs) [48] - [51]. Como se muestra en la Figura 2C-D, CK19 + PanINsexpressed tanto CXCR4 y CXCR7. En comparación, la variable de CXCL12 tinción wasmore, con tomarkedly mixto disminución de la expresión en PanINs en comparación con conductos pancreáticos normales (Fig.2C-D). En un análisis limitado, no hay diferencias significativas en la expresión de CXCL12 podrían ser detectados entre lesiones PanIN1, PanIN2, y PanIN3.
secciones seriadas de tejido pancreático normal y enfermo se tiñeron para CXCL12, CXCR4, CXCR7, y CK19. tinción CXCL12 evidente en los conductos normales exocrinas se vio disminuida en el tejido PDAC. CXCR4 tinción aumentó en PanIN y PDAC en relación con el epitelio ductal normal. CXCR7 expresión fue variable en el epitelio normal, lesiones PanIN, y PDAC. (A) El tejido normal de un único paciente con páncreas sano representa observaciones de 25 tejidos normales diferentes a partir de 21 pacientes individuales. (B) el tejido de un paciente PDAC representa observaciones de 82 tejidos diferentes a partir de 29 pacientes diferentes. 1000 × magnificación representa recuadro insertado en 200 ×. (C) La tinción se cuantificó por puntuación ciego de secciones en serie en relación con la tinción de CK19. (***) Denota
P
≤0.001.
representativas × 200 imágenes de la misma (A) normales o (b) los tejidos adenocarcinoma ductal (PDAC) pancreáticos mostrados en 1000 aumento x en la Figura 1. imágenes de sección en serie representativos de una lesión pancreática neoplasia intestinal (PanIN) a (C) 200 × o (D) 1000 × magnificación. secciones seriadas de tejido fueron immunostained con anticuerpos frente a CK19, CXCL12, CXCR4, y CXCR7, o los controles de isotipo. n = 25 diferentes tejidos normales de 21 pacientes individuales, 82 tejidos diferentes a partir de 29 pacientes diferentes PDAC, o 19 patológicamente confirmados lesiones PanIN.
El análisis del tejido tumoral PDAC revealeda más y más pronunciada, de extinción de CXCL12 en CK-19 + células tumorales (Figura 1B, figura 2B). En el tejido tumoral heterogénea que contiene glándulas tanto malignas y normales, CXCL12 tinción fue disminuida en las células malignas, butpreserved en células ductales normales adyacentes (datos no mostrados). El análisis del tejido de serie sectionsrevealed que el tejido maligno con bajos niveles de CXCL12had un aumento recíproco en CXCR4, así como CXCR7, la tinción (Fig. 1B, Fig. 2B). La cuantificación de la intensidad de la inmunotinción CXCL12, CXCR4, y CXCR7 confirmó la disminución significativa en la expresión de CXCL12 durante progressionfrom normal a precursor PanIN al tejido maligno en el páncreas (Fig. 1C). Por el contrario, la expresión de CXCR4 fue elevada en comparación con PanINsand PDAC conductos normales (figura 1C). La puntuación de expresión CXCR7 reveló un patrón bifásico con una menor expresión se produce en la etapa de PanIN y mayor expresión recurrente en PDAC (figura 1C) .Cuando los pacientes se subdividieron en grupos que dependen de la terapia neoadyuvante o no que habían recibido, los pacientes que recibieron Los regímenes estándar de atención de gemcitabina o terapia FOLFIRINOX [52] - [54] tuvieron significativamente (
P
≤0.05) más altas para la expresión de CXCL12 (0,82 ± 0,18) en comparación con los pacientes que no recibieron terapia neoadyuvante (0,43 ± 0,09)
CXCL12 expresión y regulación epigenética en líneas celulares de cáncer de páncreas
para caracterizar mejor quimiocina -. la expresión del receptor e identificar un modelo adecuado para el estudio de la función de CXCL12 en PDAC, el paciente primaria y derivar líneas celulares de cáncer de páncreas establecidos fueron analizados a través de RT-PCR utilizando nuestros conjuntos de cebadores previamente optimizados para CXCL12, CXCR4, y CXCR7 [24], [43]. RT-PCR indica falta consistente de CXCL12 transcripción en primario derivado del paciente, así como Panc1, MiaPaca2, Capan2, y líneas celulares HPAFII (figura 3A-B). De acuerdo con el análisis inmunohistoquímico, CXCR4 ARNm se mantiene en 7of las 8 líneas celulares PDAC, mientras que la expresión CXCR7 era más variable (figura 3A-B). La citometría de flujo confirmó la localización de la superficie celular de CXCR4 y CXCR7 en líneas celulares representativas (figura 3c). Para determinar si la falta de expresión de CXCL12 refleja silenciamiento epigenético, las células fueron tratadas con dosis tituladas de la ADN metiltransferasa inhibidor de 5-aza. El inhibidor de la expresión rescató CXCL12mRNA en líneas celulares representativas (Fig.3D). El tratamiento con el inhibidor de histona desacetilasa tricostatina-Aalso restaurado expresión de CXCL12 en células Capan2 (Fig. 3E). Sobre la base de nuestras investigaciones anteriores que examinan los mecanismos específicos de promotor hipermetilación en CXCL12 colorrectal y de mama [24], [25], estos datos sugieren que la expresión de CXCL12 se regula a través de mecanismos epigenéticos en el cáncer pancreático como well.Cumulatively, thesedata indican CXCL12 gen de represión en tissueand humano una batería de nuevo y establecida línea celular PDAC lines.The células MiaPaca2 fue identificado como un modelo ideal, ya que sus CXCL12-CXCR4-cxcr7 imita el patrón de expresión que la observada en tejido PDAC humano maligno.
RT- análisis PCR reveló que (A) líneas celulares de cáncer de páncreas paciente deriva-(# 1,#2,#3,#4) o (B) líneas celulares establecidas carecían de expresión de CXCL12 y mantienen la expresión de CXCR4. CXCR7 mRNA estaba presente en 3 de 8 de detección de citometría de PDAC lines.Flow (C) de CXCR4 superficie o expresión de la proteína CXCR7. Las líneas celulares treatedseven día con una curva de concentración de (D) 5-aza-2-desoxicitidina (5-aza) restaurado expresión de CXCL12.Linestreated 4 días con una curva de concentración de (E) tricostatina A (TSA) restauró la expresión de ARNm CXCL12 en las células Capan2.
CXCL12 re-expresión en células PDAC disruptedchemotaxis humanos, el aumento potencial de adhesivo, y la disminución de la metástasis hepática
El paradigma convencional de quimioquinas mediada por la metástasis de las células cancerosas es que la expresión de CXCR4 es pro-metastásico. Este modelo se deriva de la capacidad de CXCL12 exógeno para estimular la migración de células de cáncer
en
vitro [13], [45], [55]. Como era de esperar, la medición del potencial de la migración natural de varias líneas de células pancreáticas CXCL12 deficientes reveló que las células que expresan CXCR4 PDAC migran hacia la estimulación CXCL12 aguda (Fig. 4A). Es importante destacar que las células Panc1 y MiaPaca2 migraron hacia CXCL12 en forma dependiente de la concentración bifásico consistente con el conocimiento actual de la migración quimiotáctica [55], [56]. La línea celular HPAFII que carecía de expresión en la superficie de cualquiera de CXCR4 o CXCR7 no pudo migrar en respuesta al tratamiento CXCL12 (Fig. 4A). cellsalso Panc1 invadió una matriz extracelular en respuesta a la estimulación CXCL12 exógena aguda (Fig. 4B).
células (A) Panc1 y MiaPaca2 migrado hacia gradientes exógenas de CXCL12 en un intervalo de 1 nM a 1000 nM bajo suero condiciones libres (*), (**) y (***) indican
P
≤0.05,
P
≤0.01, y
P
≤0.001, respectivamente , en comparación con las células no estimuladas (NS). HPAFII células del receptor nulo no migran en respuesta a CXCL12. (B) CXCL12 dirige quimioinvasión de células Panc1 en un tapón de Matrigel en tres dimensiones. El control positivo (+) fue de 10% de medio que contenía suero. (*), (**) Y (***) indican
P
≤0.05,
P
≤0.01, y
P
≤0.001, respectivamente, en comparación con las células no estimuladas (NS).
Creemos que la respuesta pro-metastásico de células PDAC es debido al silenciamiento de la expresión de CXCL12. Para probar esta expresión de la quimiocina se introdujo-, mediante la integración de plásmido doublestable, en células MiaPaca2. Las células fueron transfectadas de forma estable con primera luciérnaga-luciferasa y luego transfectadas con fueron generados a lo largo con un clon de control transfectadas con eGFP genes adicionales utilizando una segunda selección clones reagent.Several CXCL12 que expresan, cada uno de equivalentes que muestran niveles de actividad de la luciferasa (figura 5A-B ). Es importante destacar que la falta de producción de quimioquinas fue confirmedby ELISA en Panc1, MiaPaca2, Capan2, y las líneas celulares HPAFII (Fig. 5C). la producción de quimioquinas CXCL12 funcional en clones que expresan en comparación con clones que expresan GFP a las células MiaPaca2 fue validado por ELISA andtranswell migración de las células U937 (Fig.5C-D) células que secretan .MiaPaCa2 CXCL12demonstrated una reducción significativa en la respuesta migratoria a CXCL12 TGF-βor , ambos controladores conocidos de
in vitro
PDAC migración celular en (figura 6A-D). Dada la importancia del potencial de adhesivo en la capacidad metastásica de las células cancerosas, la adhesión celular se midió siguiente. CXCL12 células positivas fueron significativamente más adherente al cultivo de tejidos plasticcompared de quimioquinas células nulas (Fig. 6E). Estos
in vitro
datos indican que el potencial maligno general de células de cáncer pancreático, tanto en la capacidad de estas células para migrar y evadir adhesión al sustrato, se disminuye después de la reintroducción de la transcripción en células CXCL12 PDAC.
Los niveles de luciferasa en GFP control o tres diferentes (31,#2,#3) CXCL12-expresando clones MiaPaca2 como se mide mediante un espectrofotómetro (A) o IVIS-100 reproductor de imágenes biofotónico (B). Los niveles de CXCL12 se midieron por ELISA (C) en las líneas celulares establecidas PDAC así como GFP y clones MiaPaca2-luciferasa que expresan CXCL12. (D) CXCL12-secretada por transfectadas clones MiaPaca2-luciferasa#1 y#2 estimularon U937 quimiotaxis. Las células tratadas con el anticuerpo neutralizante a CXCL12 (αL12) confirmaron la especificidad de U937 quimiotaxis. Los valores de A, C, y D son la media ± SEM, n = 2-3.
(A) los ensayos de migración Transwell reveló la quimiotaxis de los clones que expresan CXCL12 redujo significativamente (# 1 y#2) en comparación con las células ligando nulos (GFP). Atrayentes eran medio libre de suero (-), 10% de suero (+) o 10 nM CXCL12 (L12) en medio libre de suero. denotar
P
≤0.01 y
P
≤0.001, respectivamente, en comparación con 10 células GFP CXCL12 estimulada nm, n = 5. (B) CXCL12 re-expresión disminuida de TGF-β (5 ng /ml) inducida por la quimiotaxis en relación con las células CXCL12 nulo. (##) Denota
P
≤0.01 comparación con las células GFP TGF-ß-estimulado, n = 4. (C) & amp; (D) Imágenes representativas de experimentos en (A) y (B), respectivamente. (E) células que expresan CXCL12 fueron significativamente más adherentes al plástico de cultivo de tejidos en comparación con las células CXCL12 nulo. Las células no tratadas = (-), anticuerpo neutralizante para la actividad CXCL12 = (αL12), y un control positivo = 1 ng /ml de EGF (+). (##) Denota
P
≤0.01 en comparación con las células control estimuladas con suero al 10%. (*), (**) Y (***) indican
P
≤0.05,
P
≤0.01 y
P
≤0.001, respectivamente, en comparación con GFP células no estimuladas, n = 7.
a continuación trató de determinar si el aumento del adhesivo y simultánea disminución de migratoryphenotypes en células PDAC se suppressmetastatic difundir
in vivo de xenoinjertos
usinga heterotópico modelo de ratón. células CXCL12 nulo CXCL12 que expresan y se inyectaron en el bazo de los ratones SCID. Más de 28 días,
in vivo
seguimiento de las células indicó que, en comparación con las células de control, hubo una alteración significativa en la capacidad de las células que expresan CXCL12 MiaPaca2 para difundir lejos del sitio inicial de inoculación (figura 7A -SEGUNDO).
Ex vivo
análisis indicó que la luminiscencia en el sitio de la inoculación del bazo se mantuvo sin cambios, mientras que los ratones inyectados con PDAC que producen CXCL12had significativamente menor carga tumoral hepática que los ratones inyectados con células de control GFP (figura 7C-E). Estos datos sugieren que CXCL12 altera específicamente la capacidad de las células de cáncer pancreático a la casa para el hígado, un órgano con alta expresión de CXCL12 y un destino común metastásico de pacientes PDAC.
(A) imágenes de bioluminiscencia representativos de ratones xenoinjertados con GFP o CXCL12-expresión de las células en la implantación (día 0) o punto final del estudio (día 28). (B) de todo el cuerpo
in vivo
luminosidad con el tiempo de GFP y CXCL12 ratones. (C)
Ex vivo
resplandor de bazo extirpado (C), lo que refleja las células tumorales en el sitio de inyección, o el destino metastásico (D), lo que refleja disminución de la metástasis hepática de células que expresan CXCL12 en relación con las células GFP . (**) Denota
P
≤0.01, n = 4-5. (E) un representante de H & amp;. E imágenes que muestra masa tumoral pronunciada en el hígado de control (GFP), en relación con experimental (CXCL12) ratones xenoinjertados proliferación celular
concomitante CXCL12, CXCR4 y CXCR7 disminución en la expresión tumoral y metástasis y supervivencia prolongada en un modelo preclínico PDAC
Anteriormente, habíamos observado que re-expresión de CXCL12 en células de cáncer colorrectal suponer un incremento de anoikis, desprendimiento de apoptosis basado [24], [43]. Hemos probado si la reintroducción de CXCL12 en células PDAC cambiaría su apoptosis o potenciales proliferativos. En condiciones libres de suero, se detectó un aumento de la apoptosis en células de cáncer pancreático CXCL12 expresan adherentes cuando se compara con los controles que expresan GFP, aunque esta respuesta se atenúa con la adición de suero (Fig. 8A-B). El uso de un modelo establecido para el estudio de apoptosis desprendimiento inducido, las células fueron cultivadas en poli HEMA [43]. Al igual que con las células adherentes, la apoptosis se incrementó en las células PDAC CXCL12-positivo no adherentes comparación con los controles, pero de nuevo la adición de suero, no se altera en la apoptosis (Fig.8C-D). El número de células se mantuvo sin cambios entre poblaciones CXCL12-positivos y negativos de células no adherentes (Fig. 8C-D).
La apoptosis de las células GFP y MiaPaca2 CXCL12-expresión se evaluó a través de la caspasa 3/7 assay.Cells glo se mueren de inanición durante 24 horas y se cultivaron en 0% de suero (a, C) o 1% de suero (B, D) que contenía medio. (A-B) la apoptosis en células que expresan CXCL12 adherentes fue elevado en comparación con cualquiera de los clones que expresan GFP en condiciones libres de suero con ningún cambio visto en 1% de suero. -GFP células werestimulated con 100 gemcitabina mu M como control. (C-D) Para medir el número de células y el desprendimiento de la apoptosis de las células basadas en suspensión, las células MiaPaca2-luciferasa fueron cultivadas en poli HEMA. Usando el reactivo de ViaCount y fluir el recuento de células por citometría, no hubo diferencia en el número de células vivas observado en no adherente CXCL12-null (GFP) o las células que expresan ya sea cuando se cultivan en 0% (C) o 1% de suero (D). La apoptosis de las células cultivadas de poli-HEMA reveló una en aumento de la caspasa-3 activa /7 restringido a las células cultivadas en condiciones libres de suero solamente (C) sin cambio observado en 1% de suero (D). La gemcitabina (GEM) se utilizó como control para la disminución del recuento de células y el aumento de la apoptosis. (*), (**) Y (***) indican
P
≤0.05,
P
≤0.01, y
P
≤0.001, respectivamente, en comparación con las células control (GFP). Los valores son medias ± SEM, n = 4-5.
Dado el cambio mínimo en anoikis sensibilidad en las células que expresan CXCL12 PDAC en condiciones de suero que contiene, próximo a prueba su potencial de crecimiento. En marcado contraste con nuestros datos en colorrectales o de los cánceres de mama humanos [24] - [26], [43], el crecimiento demográfico de CXCL12 expresar PDAC fue significativamente disminuyó en comparación con las células deficientes de quimioquinas (Fig.9). Se observó un crecimiento más lento de las células que expresan CXCL12 tanto en condiciones que contienen suero libre de suero y (figura 9A-B).