Extracto
A pesar de los avances en el diagnóstico precoz y la terapia multimodal para el cáncer, la mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón han sido localmente avanzado o metastásico en el momento del diagnóstico, lo que sugiere la característica altamente progresiva de las células de cáncer de pulmón. La capacidad de invasión y metástasis mecanismos subalterno de cáncer de pulmón son todavía no se ha dilucidado. En el presente estudio, se realizó inmunohistoquímica para detectar la expresión de CXCL16-CXCR6 en tejidos de cáncer de pulmón humano. Se demostró que similar a CXCL12 y CXCR4, CXCL16 y CXCR6 también se coexpresa en los tejidos de cáncer de pulmón primario humanos. Después de confirmar la existencia funcional de la proteína CXCL16 y CXCR6 en el A549, 95D y H292 por ELSA y citometría de flujo análisis, hemos explorado aún más la importancia del eje CXCL16-CXCR6 en las funciones biológicas de las líneas celulares de cáncer de pulmón
in vitro
. Se encontró que CXCL16 no tuvo efectos sobre el PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) expresión de A549, 95D y H292 células. Sin embargo, tanto CXCL16 exógenos y CM (medio de A549, H292 95D o condicionadas) mejoró significativamente la
in vitro
viabilidad y la invasión de líneas celulares de cáncer de pulmón de tres. El anticuerpo neutralizante para CXCL16 o baja regulación de CXCR6 fue capaz de inhibir el aumento de la viabilidad y la invasividad de A549, 95D y H292 células estimuladas por CXCL16 o CM. Nuestros resultados implican que el eje CXCL16-CXCR6 está implicado en la regulación de la viabilidad y la invasión en lugar de la expresión de PCNA de células Caner pulmón, que abre la puerta para entender mejor los mecanismos de la progresión del tumor de pulmón y metástasis
Visto.: Hu W, y Liu, Zhou W, Si L, L Ren (2014) y CXCL16 CXCR6 se coexpresan en cáncer de pulmón humano
en Vivo Opiniones y mediar en la invasión de líneas celulares de cáncer de pulmón
in vitro
. PLoS ONE 9 (6): e99056. doi: 10.1371 /journal.pone.0099056
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 19 de septiembre de 2013; Aceptado: 11-may de 2014; Publicado: 4 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Hu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 81270753 (de W.-HZ), Ciencia y Proyecto de Tecnología de Wuhan 2013060602010249 (a W.-DH), Fundación de Ciencias Naturales de Ciencia y Tecnología del Ministerio de la provincia de Hubei 2010CDB05502 (a W.-DH ) y el plan de Formación de Personal del Sistema de Salud de Beijing 2013-3-021 (a W.-HZ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es un tumor maligno común, que se ubica como la primera causa de muerte tumores malignos relacionados con todo el mundo, y la incidencia de cáncer de pulmón ha ido en aumento en los últimos años en algunas grandes ciudades en china [1]. A pesar de los avances en el diagnóstico precoz y el tratamiento multimodal del cáncer, la tasa de supervivencia global a los cinco años para los pacientes más avanzados de cáncer de pulmón sigue siendo inferior al 20%. Los mecanismos que subyacen a la invasión y la metástasis de cáncer de pulmón han llamado mucho la atención de los oncólogos torácicos durante décadas de años. Algunas hipótesis y las moléculas se han propuesto, pero un conocimiento profundo de los procesos invasivos y metastásicos intrincados de las células de carcinoma es todavía una cuestión abierta.
Desde el descubrimiento de la primera quimiocina en 1987, más de 50 tipos de quimiocinas y 20 tipos de receptores de quimioquinas se han clonado e identificado. La activación de la vía de señalización de quimioquinas /receptor se ha confirmado para mediar en una serie de eventos fisiológicos y patológicos, especialmente el reclutamiento de linfocitos, así como el crecimiento del tumor y la diseminación metastásica, que proporciona la posibilidad de la dilucidación de proceso metastásico de las células malignas de la inmunología perspectivas [2], [3], [4], [5], [6].
Entre las diversas quimiocinas y receptores de quimioquinas, CXCL16-CXCR6 es un par único receptor de quimiocina /quimiocina. CXCL16, también conocido como SR-PSOX, pertenece a la familia de quimioquinas CXC y existe tanto en una forma soluble y transmembrana [7], [8], [9]. Interacción entre CXCL16 y su "único receptor, CXCR6 (también llamado Bonzo, STRL33 y TYMSTR) está implicado en múltiples actividades biológicas, incluyendo el tráfico selectiva de subgrupos de linfocitos, la adhesión celular, la supervivencia celular, la regeneración muscular, el desarrollo del cerebro, la inflamación crónica y anti- inmunidad tumoral [9], [10], [11], [12], [13], [14]. En particular, estudios recientes han verificado la sobreexpresión de CXCL16 y /o CXCR6 en varios tipos de cánceres humanos y CXCL16 podría estimular el crecimiento, la migración, la invasión y la activación de AKT vía de células de cáncer de señalización a través de su "receptor CXCR6
in vitro [15], [16], [17], [18]. Nuestro estudio anterior también confirmó la expresión excesiva de proteínas CXCR6 en células de cáncer de próstata humana nativa y la activación de la vía de CXCL16-CXCR6 podría promover la migración y la invasión de PC3 y LNCaP
in vitro
[19]. Estos resultados sugieren que CXCL16-CXCR6 puede ser una novela pares ligando /receptor de quimioquinas implicados en la tumorigénesis y metástasis. Algunos grupos han empezado a prestar atención al papel de CXCL16-CXCR6 en el tumor, sin embargo, la relación entre el cáncer de pulmón CXCL16-CXCR6 y es todavía difícil de alcanzar y merece más investigaciones.
En el presente estudio, la expresión de CXCL16 y CXCR6 en los tejidos pulmonares humanos con cáncer y líneas celulares de cáncer de pulmón, A549, H292 y 95D, se determinó mediante técnicas de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, respectivamente. A continuación, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y citometría de flujo se llevaron a cabo para examinar la expresión funcional de CXCL16 y CXCR6 en tres líneas celulares de cáncer. Para aclarar aún más el papel de eje CXCL16-CXCR6 en el cáncer de pulmón, también se observó la acción de CXCL16 en PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) expresión y la capacidad invasiva de la A549, H292 y células 95D. Los efectos del gen CXCR6 También se determinaron baja regulación por la tecnología de ARN interferente pequeño (ARNip) sobre la viabilidad y capacidad de invasión de las células A549 por MTT y el ensayo de invasión. A través de la exploración del cambio de comportamiento biológico de las células de cáncer de pulmón mediadas por el eje CXCL16-CXCR6, esperamos para proporcionar información sobre una mejor comprensión de la evolución de este tumor maligno agresivo.
Materiales y Métodos
Humano Recogida de tejido
Todos los procedimientos que involucran a los participantes en el estudio fueron aprobados por el hospital Zhongnan del Comité de Ética de Investigación humana de la Universidad de Wuhan, y los participantes habían proporcionado sus consentimientos informados escritos.
cáncer de pulmón humano (33 casos) y normales (5 casos) los tejidos se obtuvieron de los pacientes sometidos a resección del lóbulo pulmonar o neumonectomía por cáncer o no cancerosas enfermedades pulmonares en el hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan, de 2003 a 2006. La identificación de los tipos de tumores fue realizado por dos patólogos profesional . De los 33 cánceres de pulmón, 13 casos fueron adenocarcinomas (AC), 12 casos fueron carcinomas escamosos (SC), 7 casos eran carcinomas adenoescamosos (ASC) y 1 caso fue el carcinoma broncoalveolar (BC). Las etapas de los tumores se estimaron de acuerdo con la séptima edición del nuevo sistema de estadificación TNM sugerido por la Asociación Internacional para el estudio del cáncer de pulmón (IASLC) en 2009. En las 33 muestras, 3, 1, 9, 8, 10 y 2 casos eran IA, IB, IIA, IIB, IIIA y IIIB, respectivamente.
Cell Cultura y
pulmón líneas celulares de cáncer A549, H292 y 95D células se obtuvieron del Banco de células de la Academia china de ciencia (Shanghai, china). Las células se cultivaron en 1640 que contiene inactivado por calor 10% de FBS (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.), 10 mM HEPES, 1 mM de sodio de ácido pirúvico, 4,5 g /L de glucosa, 100 UI /ml de penicilina y 100 mg /ml estreptomicina. Se recuperaron y se pasaron por tres veces las células, a continuación, se dejan crecer hasta la confluencia de los siguientes experimentos.
La inmunohistoquímica
El método de inmunohistoquímica se basa en nuestro procedimiento anterior [19]. Brevemente, los tejidos se fijaron rutinariamente con formalina y embebidos en parafina. La recuperación del antígeno se llevó a cabo y 0,3% H
2O
2 en solución tampón de fosfato (PBS) fue empleado para bloquear la actividad peroxidasa endógena en secciones. Después de tratar con el bloqueo de la proteína de suero para bloquear la unión no específica, las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con el ratón anti-CXCR4 humana (25 mg /ml), ratón anti-humano CXCR6 (25 g /ml), anti-ratón CXCL12 humana (20 mg /ml) y de cabra anti-CXCL16 humano (20 g /ml) anticuerpos (de R & amp; D Systems, Abingdon, Reino Unido), respectivamente. Se empleó un kit de reactivo de detección estreptavidina /biotina (Maixin Bio., Fuzhou, China) con 3, tetrahidrocloruro 30-diaminobencidina (DAB) para la detección de la señal y se usó hematoxilina de Harris como una tinción de contraste. Ratón o de cabra de isotipo IgG (10 mg /ml) (Dingguo Bio Co. Ltd, Shanghai, China) se utilizó como control negativo y los tejidos vellosos primer trimestre humanos (5 muestras) se utilizaron como control positivo (13, 19). La puntuación se realizó a ciegas utilizando un sistema de telepatología sin el conocimiento de la información clínica relacionada (por ejemplo, el grado del tumor, tamaño del tumor o el resultado clínico). Se observó que la intensidad de la inmunotinción y marcó como ninguna tinción (puntuación = 0), de color amarillo claro (puntuación = 1), de color marrón claro (puntuación = 2) o marrón (puntuación = 3). El porcentaje de células positivas se calculó como & lt; 5% (puntuación = 0), 5-25% (puntuación = 1), 26-50% (puntuación = 2), 51-75% (puntuación = 3) o & gt; 75% (puntuación = 4). La combinación de la puntuación de la intensidad de inmunotinción y el porcentaje de células positivas, clasificamos la puntuación de la siguiente manera: & lt; 2, expresión negativa; 2-3, la debilidad de expresión; 4-5, la expresión moderada y 6-7 como fuerte expresión [19].
inmunocitoquímica
Después de 70 a 80% de confluencia de las células, A549, H292 o 95D células se digirieron con 0,25 % de tripsina (Bio básico Inco., BBI, Ontario, Canadá) que contiene 0,1% de EDTA y se sembraron a una densidad de 2 × 10
5cells /pocillo en placas de 6 pocillos pre-colocados con cubreobjetos. Después se cultivaron durante 48 h, las líneas celulares de cáncer de pulmón fueron fijadas en formalina al 4% durante 20 min a temperatura ambiente, se lavaron en PBS y se permeabilizaron durante 15 minutos en 0,03% de Triton X-100-PBS, después se trató con 0,3% H
2O
2 para inactivar la actividad peroxidasa endógena. El siguiente procedimiento fue como el descrito anteriormente en el método de la inmunohistoquímica y las células trofoblásticas de cultivos primarios humanos también se utilizaron como control positivo [13], [19]. Los resultados fueron analizados por el software Image ProPlus-6,0 y la densidad de la expresión media de CXCL16 y CXCR6 en tres líneas celulares se registró. Los experimentos se repitieron tres veces.
Preparación de células cultivadas medio condicionado
El A549 aislado, 95D y H292 se sembraron en frascos de cultivo (6 ml /botella) a una densidad de 1 × 10
6 /ml, respectivamente, y se cultivaron de forma continua durante 48 h. Los sobrenadantes, a saber medio acondicionado (CM), se recogieron y se centrifugaron a 2000 g, a continuación, se almacena a -80 ° C. Los sobrenadantes de medio de cultivo sin células también se recogieron como control.
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA): perfil
digeridas A549, H292 y 95D células fueron sembradas en placas de 24 pocillos (500 l /pocillo) a una densidad de 5 × 10
5 /ml, respectivamente. Los sobrenadantes de los cultivos celulares se recogieron a las 24, 36, 48, 60, 72, 96 y 100 horas de cultivo. Cada sobrenadante recogido se almacenó a -80 ° C para el análisis ELISA. La cantidad de CXCL16 en cada sobrenadante se midió por ELISA kit CXCL16 humano (Shanghai Westang Bio-Tech Co. Ltd, Shanghai, China), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El kit de ensayo de CXCL16 demostró una sensibilidad de 40 pg /ml y una intra-ensayo coeficiente de variación de menos de 12%. Los experimentos se repitieron tres veces.
Detección de citometría de flujo para la expresión CXCR6
La expresión en la membrana de la proteína CXCR6 en A549, H292 y 95D células se detectó por citometría de flujo de acuerdo con nuestro método anterior y CXCR4 también se utilizó como control, al mismo tiempo [20]. En pocas palabras, para proteger a la localización de la membrana del receptor de quimioquinas en la mayor medida posible, las células, en confluencia de células del 70-80%, se digirieron con 0,25% de tripsina solamente durante 30-50 s, entonces arrancado suavemente y se lavó con PBS [ ,,,0],20]. Después de bloquear con 10% de FBS, las células recuperadas se incubaron con PE de ratón anti-humano (ficoeritrina) -CXCR6 anticuerpo monoclonal (1:10; R & amp; D Systems, Inc), anticuerpo monoclonal anti-humano PE-Cy5 CXCR4 ratón ( 1:05; eBioscience), isotipo de ratón PE-IgG2B (R & amp; D Systems, Inc) o el ratón PE-Cy5 isotipo IgG2a (eBioscience), en el uso recomendado por 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Después, las células se lavaron dos veces con 1 ml de PBS por centrifugación a 2000 xg durante 5 min y se analizaron mediante FACS Calibur citometría de flujo (FC500, Beckman-Coulter, EE.UU.) y el software CellQuest. Las células de 1 × 10
5 se contaron y se registró el porcentaje de células positivas. Los experimentos se repitieron tres veces.
Detección PCNA por citometría de flujo
El A549 aislado, H292 y 95D células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10
5 células /pocillo. En el 70-80% de confluencia celular, las líneas celulares de cáncer de pulmón se mueren de inanición durante 12 h, después se trataron con CXCL16 humana recombinante (100 ng /ml) (Peprotech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.) o una combinación de CXCL16 con anticuerpo neutralizante CXCL16 (100 ng /ml) (R & amp; D Systems, Inc.) para antera 48 h. A continuación, se digirieron las células y se recogieron para el siguiente examen PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular). Brevemente, las células se trataron con 70% de etanol y 0,1% de Triton X-100, cada uno por 20 min, después se incubaron con anticuerpo de ratón anti-humano PE-PCNA monoclonal (1:05; eBioscience) o el ratón PE-IgG
isotipo 2a (eBioscience) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad [21]. El siguiente procedimiento fue examinar como se describe anteriormente en el método de citometría de flujo de detección para la expresión CXCR6. Los experimentos se repitieron tres veces.
CXCR6 Silencio en células A549
Las células aisladas A549 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10
5 /ml. En el 70-80% de confluencia, estas células fueron transfectadas con phU6 /GFP /Neo de plásmido que contiene moléculas cortas de ARN de horquilla (shRNA) dirigidos contra CXCR6, con el uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las secuencias de oligonucleótidos tres shRNA fueron: (CXCR6-2819-1): 5'-GAC ctGAG AAT TCC AAG ACT T-3 '(sentido) y 5'-AAG TGG TCT AAT TGT CCT CAG-3' (antisentido ); (CXCR6-2820-2) 5'-GAT ctCAC CAT TGT CTG CTA T-3 '(sentido) y 5'-ATA ACG GAC AAT CAT GGT GAG-3' (antisentido); (CXCR6-2821-1) 5'-gcTTG CTC TGG ATC GTG ATA T-3 '(sentido) y 5'-ATA TCA CCC AGA TGA ACG AGC-3' (antisentido) (GENECHEM, Shanghai, China). Los grupos se dividieron en phU6 /GFP /Neo-CXCR6 (CXCR6 shRNA), no director siRNA oligonucleótidos control negativo (phU6 /GFP /Neo, shRNA-control) y-control en blanco (sin ningún tipo de tratamiento). Los transfectantes estables se seleccionaron por cultivo G418 a una concentración de 800 mg /ml. Los experimentos se repitieron tres veces y la eficiencia de silenciamiento se determinó por transferencia de western.
viabilidad celular Ensayo
El MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio, se aplicó Sigma Chemicals] ensayo para evaluar los efectos de CXCL16-CXCR6 sobre la viabilidad celular
in vitro
[21]. Los experimentos se dividieron en dos pasos: en primer lugar, las células aisladas a partir de A549-control en blanco, shRNA-control y CXCR6 shRNA (2819-1) se sembraron en grupos de 96 pocillos de fondo plano de microplacas con una densidad de 2 × 10
3 células /pocillo y se cultivaron durante 24, 48, 72, 96 y 120 h, respectivamente. En segundo lugar, después de hambre con 1640 sin FCS durante 12 h, las células de control en blanco, shRNA-control o CXCR6-shRNA (2819-1) grupos se trataron con medio de control (1640) o CXCL16 a una concentración de 100 ng /mL por 48 h.
se añadió reactivo MTT (20 l) a cada pocillo de microplacas de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C durante 4 h. El medio se decantó y se añadieron 100 l de DMSO para solubilizar los cristales de reactivos. La absorbencia se midió a una longitud de onda de 570 nm en un lector de microplacas automático. Las muestras se realizaron por triplicado y se repitieron los experimentos tres veces [21].
ECM invasión Ensayo
La capacidad invasiva de las líneas celulares de cáncer de pulmón se evaluó objetivamente por
in vitro
ensayo de invasión basa en nuestro método anterior [19], [20]. En pocas palabras, los insertos de cultivo celular (tamaño de poro de 8 m, diámetro 6,5 mm; Corning, Corning, NY, USA) recubiertas con matriz extracelular 10 l puro (ECM) en gel (Sigma, St. Louis, MO 63103, American) se colocaron en una placa de 24 pocillos. Los experimentos se dividen en las siguientes dos partes: En primer lugar, el A549 aislado, H292 o 95D células (1 × 10
5/200 1640 libre de suero l) se sembraron en la cámara superior, y se trata con CM, CXCL16 ( 100 ng /ml) y una combinación de CM o CXCL16 con el anticuerpo de neutralización CXCL16 (100 ng /ml). En segundo lugar, las células A549, de la pieza en bruto-control, /grupo Neo-CXCR6 phU6 /GFP /Neo y phU6 /GFP, se sembraron en la cámara superior a una densidad de (1 × 10
suero 5/200 l libre de 1640), después se trató con CXCL16 (100 ng /ml) o CM. Las cámaras inferiores se rellenaron con 800 l 1640 suministrado con FBS al 10%. Después se incubaron a 37 ° C durante 24 h, los insertos se retiran y se lavan en PBS. Luego, las células no invasora, junto con gel de ECM se retiraron de la superficie superior del filtro frotando con un bastoncillo de algodón. Los insertos fueron fijadas en formalina al 4% durante 10 min a temperatura ambiente, y se tiñeron con hematoxilina. El resultado se observó bajo un microscopio óptico (Olympus, Tokio, Japón) y se contaron las células que habían migrado a la superficie inferior. Para eliminar la variabilidad individual, los resultados fueron evaluados por dos investigadores independientes y el índice invasiva se calculó como la proporción de las células migraron del grupo de experimento a la de su propio control. Cada experimento se realizó por triplicado, y se repite tres veces.
Estadísticas
Los experimentos
in vitro
se muestra en la media ± SE. Los datos de la expresión de PCNA,
in vitro
viabilidad y la invasión de ensayo in se evaluaron con la post hoc de Dunnett
t
de prueba y prueba de Dunnett T3, cuando sea apropiado. Las diferencias fueron aceptados como significativa a
P
. & Lt; 0,05
Resultados
Proteínas La expresión de CXCL16-CXCR6 en cáncer de pulmón humano
in vivo
la inmunohistoquímica se realizó para determinar la expresión de la proteína de CXCL16 y CXCR6 en Caner humano de pulmón (33 muestras) y los tejidos normales (5 muestras). Los resultados en la Fig. 1 demostró claramente la co-expresión de la proteína CXCR6 y CXCL16 en tejidos de cáncer de pulmón humano. tinción de color marrón específico para CXCR6 y CXCL16 en el citoplasma y la membrana se pudo observar claramente en las células de cáncer de pulmón primarios, pero la tasa de expresión positiva y la intensidad de tinción de CXCR6 era más fuerte que la de CXCL16. A pesar de moderada a fuerte tinción, de color marrón para CXCL16 y CXCR6 también se observó en los tejidos pulmonares normales, pero la expresión positiva estaba restringido principalmente a las células epiteliales alveolares y células inflamatorias. No hubo evidencia para la tinción no específica con el anticuerpo control.
La inmunohistoquímica se realizó para determinar la expresión de la proteína de CXCL16-CXCR6 y CXCL12-CXCR4 en los tejidos de cáncer de pulmón primarios humanos. Los anticuerpos usados en estos experimentos eran de ratón anti-humano CXCR4 (25 g /ml), ratón CXCR6 anti-humano (25 g /ml), ratón CXCL12 anti-humano (20 g /ml) y de cabra CXCL16 anti-humano (20 /ml) anticuerpos g. Se demostró en la Fig. 1 que una tinción de color marrón específico para CXCL16-CXCR6 y CXCL12-CXCR4 en el citoplasma y la membrana de diferentes tipos patológicos humanos de células de cáncer de pulmón. De moderada a fuerte, tinción de color marrón para CXCL16 y CXCR6 también se observó en los tejidos pulmonares normales, pero la expresión positiva se limita principalmente a las células epiteliales alveolares y células inflamatorias. No hubo evidencia para la tinción no específica con el anticuerpo control. Las imágenes eran el representante de los experimentos. AC: adenocarcinomas; SC: carcinoma escamoso; BC: el carcinoma broncoalveolar; En contra: los tejidos pulmonares normales; Vellosidades: en el primer trimestre tejidos vellosos humanos, como control positivo. Ampliación, × 200.
Por otra parte, también se analizó la asociación de patrón de expresión CXCL16-CXCR6 con diferentes tipos patológicos de cáncer de pulmón. Se demostró en la Fig. 2 que de las 33 muestras de cáncer de pulmón detectados, para la expresión de proteínas CXCR6, sólo 3 casos SC fueron débilmente positivo y los demás eran todos de moderada a fuertemente positivo, mientras que para CXCL16, la intensidad de la tinción fue negativa (10), débil (8), moderada (8) y fuerte (7). De las 10 muestras de CXCL16-negativas, 7 casos pertenecen a la CA, 2 casos pertenecen a SC y 1 caso fue ASC. De las 7 muestras CXCL16-fuerte, 5 casos eran SC y 2 casos fueron ASC. El resto de los 16 débil para muestras fueron moderadas AC (6), SC (5) ASC (4) y BC (1), respectivamente (Fig. 2).
De acuerdo con la puntuación de la intensidad de inmunotinción y el porcentaje de células positivas, los resultados del análisis de la inmunoquímica se clasificaron de la siguiente manera: & lt; 2, la expresión negativa; 2-3, la debilidad de expresión; 4-5, una expresión moderada, y 6-7 como fuerte expresión. AC: adenocarcinomas; SC: carcinoma escamoso; ASC: los carcinomas adenoescamosos; BC:. El carcinoma broncoalveolar
En el presente estudio se utilizó también CXCL12-CXCR4 como control positivo y se comparó el patrón de expresión entre CXCL16-CXCR6 y CXCL12-CXCR4. Como se muestra en la Fig. 1,2 y en la Tabla 1 la mayoría de las muestras expresa CXCR4 (30/33) y CXCL12 (28/33) de proteínas, a pesar de una diferencia en la intensidad de luz de expresión. Además, en 33 muestras detectadas, hubo 30 casos que co-expresan la proteína CXCR6 y CXCR4, y 19 casos que la co-expresan CXCL16 y CXCL12 proteína.
Proteínas La expresión de CXCL16-CXCR6 en Pulmón humano líneas celulares de cáncer
Después de confirmar la co-expresión de la proteína CXCL16-CXCR6 en células de cáncer de pulmón humano nativo, además se analizó la expresión de CXCL16-CXCR6 en el cáncer de pulmón de células líneas humano A549, H292 y 95D por inmunocitoquímica. Como se muestra en la Fig. 3, la tinción de color marrón positiva tanto para CXCL16 y CXCR6 se pudo observar claramente en el citoplasma y citomembrana de A549, las células H292 y 95D, respectivamente. Aunque hubo diferencias de intensidad de la expresión en A549, 95D y H292 células, la tinción para el ligando era todo relativamente más débil de lo que es receptor en tres tipos de células. Además, el patrón de expresión de CXCL16-CXCR6 fue similar a la de CXCL12-CXCR4, la tinción específica para tanto CXCR4 y CXCL12 también puede observarse en líneas celulares de cáncer de pulmón de tres a pesar de la diferencia de la intensidad de la expresión en células diferentes.
la inmunocitoquímica se llevó a cabo para detectar la expresión de la proteína de CXCL16-CXCR6 y CXCL12-CXCR4 en líneas celulares de cáncer de pulmón humano. Los anticuerpos usados en estos experimentos eran de ratón anti-humano CXCR4 (25 g /ml), ratón CXCR6 anti-humano (25 g /ml), ratón CXCL12 anti-humano (20 g /ml) y de cabra CXCL16 anti-humano (20 /ml) anticuerpos g. Positivo tinción de color marrón tanto para CXCL16 y CXCR6 se observó claramente en el citoplasma y citomembrana de A549, las células H292 y 95D, respectivamente. Por otra parte, CXCL12 y CXCR4 fueron también co-expresan en las líneas celulares de cáncer de pulmón de tres. No tinción de fondo se observó en el control de isotipo. R: Las imágenes eran representativos de los experimentos; B: La intensidad de la expresión relativa de CXCL16-CXCR6 y CXCL12-CXCR4 en el A549, H292 y células 95D. Tro: células trofoblásticas de cultivos primarios humanos como un control positivo. Ampliación, × 200.
A continuación, un ensayo ELISA se realizó para examinar la liberación de la CXCL16 soluble en cultivadas A549, H292 y células 95D
in vitro
. Como se muestra en la Fig. 4, tres tipos de líneas celulares de cáncer de pulmón todo CXCL16 secretado espontáneamente casi a una tasa constante, pero no había una ligera diferencia en la concentración de CXCL16 en el medio de cultivo. La cantidad de CXCL16 producido por células H292 fue el más alto entre los tres tipos de células. La concentración de CXCL16 en el medio 24 horas-cultivadas de H292 ya alcanzó a 1391,9 ± 13,43 ng /ml y la concentración acumulada de CXCL16 era 2633,2 ± 9,84 y 2566,9 ± 3,1 ng /ml después del cultivo durante 96 y 120 h, respectivamente. Aunque la producción de CXCL16 por las células A549 fue relativamente inferior a la de tanto H292 y 95D células, la producción de CXCL16 estaba todavía en una manera dependiente del tiempo y la cantidad de CXCL16 fue 977,45 ± 12,85 ng /ml después de cultivo durante 120 h. Para 95D células, la concentración de CXCL16 también se correlacionó positivamente con el tiempo de cultivo y la producción de 120 h de CXCL16 fue 1165,2 ± 12,00 ng /ml.
digeridas A549, H292 y 95D células fueron sembradas en placas de 24 pocillos (500 l /pocillo) a una densidad de 5 × 10
5 /ml, respectivamente. Los sobrenadantes de los cultivos celulares se recogieron a las 24, 36, 48, 60, 72, 96 y 100 horas de cultivo. Un ensayo ELISA se realizó para examinar la liberación de la CXCL16 soluble en cultivadas A549, H292 y células 95D
in vitro
. Como se muestra en la Fig. 4, tres tipos de líneas celulares de cáncer de pulmón todo CXCL16 secretada de forma espontánea en una manera dependiente del tiempo, despites de una diferencia en la concentración de CXCL16 en el medio de cultivo. Los experimentos se repitieron tres veces. Las barras de error representan el error estándar de la media.
La citometría de flujo se utilizó para detectar la expresión en la membrana de CXCR6 en el A549, H292 y células 95D. Aunque la proporción de expresión CXCR6 por H292 células fue menor que la de los dos A549 (52,4 ± 5,79%) y 95d células (56,03 ± 11,42%), el porcentaje medio era todavía 34,87 ± 6,17 (Fig. 5). Por otra parte, también se detectó la expresión en la membrana de CXCR4 en el A549, H292 y 95D células con citometría de flujo. Se encontró que el porcentaje de células CXCR4-positivas en A549, H292 y 95D fue 25,56 ± 6,44, 46,00 ± 6,52 y 28,57 ± 1,43, respectivamente. Por lo tanto, la membrana CXCR6 y CXCR4 se coexpresan en líneas celulares de cáncer de pulmón de tres a pesar de una ligera diferencia en la proporción expresión positiva.
La citometría de flujo (FCM) se utilizó para detectar la expresión en la membrana de CXCR6 en líneas celulares de cáncer de pulmón . Las células de 1 x 10
5 fueron contados y la relación de dilución de (ficoeritrina) -CXCR6 anticuerpo monoclonal y el anticuerpo monoclonal PE-Cy5 CXCR4 eran 1:10 y 1:05, respectivamente. El histograma demostró la proporción promedio de expresión de CXCR4 y CXCR6 en A549, H292 y 95D células, respectivamente. Las imágenes FCM eran representativos de los experimentos. El porcentaje de células positivas CXCR6 de membrana en el A549, H292 y 95D fue 52,4 ± 5,80, 56,03 ± 11,42 y 34,8 ± 6,17, respectivamente. Además, la expresión en la membrana de CXCR4 también se observó en A549, H292 y 95D células al mismo tiempo. Los experimentos se repitieron tres veces y las imágenes eran representativos de los experimentos. Las barras de error representan el error estándar de la media.
Efectos de CXCL16 en la expresión de PCNA de líneas celulares de cáncer de pulmón
in vitro
Después de identificar la existencia funcional de CXCL16 y CXCR6 en A549, 95D y H292, se observó aún más el efecto de la estimulación CXCL16 en la expresión de PCNA de estas células. Como se muestra en la Fig. 6, no hubo cambios significativos en el nivel de PCNA en diferentes grupos experimentales (p & gt; 0,05, en comparación con el control). Los resultados fueron muy consistentes en líneas celulares de cáncer de pulmón y de tres eje CXCL16-CXCR6 no mostraron efectos sobre la expresión de PCNA de A549, 95D o H292.
Después en ayunas durante 12 (100 ng /ml) o una combinación de CXCL16 con anticuerpo neutralizante CXCL16 (100 ng /ml) durante 48 h antera. A continuación, los efectos de la estimulación CXCL16 en PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) se detectó expresión por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 6, no hubo cambios significativos en el nivel de PCNA en diferentes grupos experimentales (p & gt; 0,05, en comparación con el control). Las imágenes son representativas de los experimentos y los resultados fueron reproducibles y consistentes en tres líneas celulares de cáncer de pulmón. Las barras de error representan el error estándar de la media.
CXCR6 se había reducido regulado por siRNA Techonology
Eficiencia del ARN de interferencia contra CXCR6 fue validado por Western blot. Se muestra en la Fig. 7 que la proteína se expresó CXCR6 sustancialmente en las células A549 (-control del banco, sin ningún tratamiento) y la tecnología de interferencia de ARN inhibe eficazmente la expresión CXCR6 en las células A549. La eficiencia de silenciamiento de CXCR6 shRNA- (2819-1) fue el mejor, por lo tanto, en todos los experimentos posteriores, hemos utilizado este siRNA para silenciar la expresión de ARNm CXCR6.
Para silenciar la expresión génica CXCR6, se transfectaron células A549 con phU6 /GFP /Neo de plásmido que contiene ARN de horquilla corto (ARNhc) moléculas dirigidas contra CXCR6, con el uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las secuencias de oligonucleótidos tres shRNA fueron: (CXCR6-2819-1): 5'-GAC ctGAG AAT TCC AAG ACT T-3 '(sentido) y 5'-AAG TGG TCT AAT TGT CCT CAG-3' (antisentido ); (CXCR6-2820-2) 5'-GAT ctCAC CAT TGT CTG CTA T-3 '(sentido) y 5'-ATA ACG GAC AAT CAT GGT GAG-3' (antisentido); (CXCR6-2821-1) 5'-gcTTG CTC TGG ATC GTG ATA T-3 '(sentido) y 5'-ATA TCA CCC AGA TGA ACG AGC-3' (antisentido). Eficiencia del ARN de interferencia contra CXCR6 fue validado por Western blot. Se muestra en la Fig. 7 que la proteína se expresó CXCR6 sustancialmente en las células A549 (-control del banco, sin ningún tratamiento) y la tecnología de interferencia de ARN inhibe eficazmente la expresión CXCR6 en las células A549. Carril 1: control en blanco; Carril 2: control de ARN; Carril 3: CXCR6 shRNA- (2821-1); Carril 4: CXCR6 shRNA- (2820-2); Carril 5:. CXCR6 shRNA- (2819-1) guía empresas
Efectos de CXCL16-CXCR6 sobre la viabilidad celular A549
in vitro
resultados del ensayo MTT en la Fig. 8 mostraron que no hubo diferencia de la
in vitro
viabilidad entre el control en blanco y shRNA-control. Sin embargo, en comparación con el control en blanco, la viabilidad de las células A549 de la CXCR6-shRNA (2819-1) grupos disminuyeron significativamente con la prolongación del tiempo de cultivo (en comparación con el control, P & lt; 0,01 a 72, 96 y 120 h) . Por otra parte, CXCL16 recombinante humana era capaz de aumentar la
in vitro
viabilidad de las células A549 del control en blanco y shRNA-control (en comparación con el control, P & lt; 0,01), mientras que no tuvo efecto sobre la viabilidad de las células A549 de la CXCR6 las reguladas grupo (en comparación con el control, P & gt; 0,05).
se aplicó el ensayo de MTT para evaluar los efectos de CXCL16-CXCR6 sobre la viabilidad celular
in vitro
. Como se muestra en la Fig.