Extracto
El cáncer de ovario es un tumor maligno asociado con la inflamación con una alta tasa de mortalidad. CXCR2 expresión de los cánceres de ovario son agresivos con los peores resultados. Por ello, investigó los mecanismos moleculares implicados en la progresión del cáncer CXCR2 impulsada mediante la comparación de líneas celulares de cáncer de ovario positivos y negativos CXCR2. Establemente transfectadas CXCR2 SKOV-3 células tenían una tasa de crecimiento más rápido en comparación con las células control transfectadas con el vector vacío. En particular, el factor de necrosis tumoral (TNF), abundantemente expresado en el cáncer de ovario, el aumento de la proliferación celular por la disminución de la fase G0-G1 en células transfectadas CXCR2. TNF aumento de la actividad del factor nuclear-kB (NF-kB) a un mayor grado de CXCR2 células transfectadas que las células de control, así como proporcionado una mayor activación de I? B. células transfectadas expresan CXCR2 niveles más altos de sus ligandos proinflamatorios, CXCL1 /2 y mejorarse más la proliferación, la migración, la invasión y la formación de colonias. CXCR2 células positivas también se activan más de EGFR, lo que dio lugar a la activación de Akt superior. Mejorado la actividad de NF-kB en las células CXCR2 positivas se redujo por un inhibidor de PI3K /Akt en lugar de un inhibidor de Erk. CXCL1 añadió a las células positivas CXCR2 llevado a un aumento de la activación de I? B. CXCL1 también dio lugar a un número significativamente mayor de células invasoras en las células transfectadas CXCR2, que fue bloqueada por el inhibidor de NF-kB, Bay 11-7082. Además, la proliferación celular en las células mejorada CXCR2 positivos fue más sensible al anticuerpo CXCL1 o un inhibidor de NF-kB. Finalmente, CXCR2 transfección de células parentales aumentó la actividad del promotor CXCL1 a través de un sitio de NF-kB. Por lo tanto el aumento de las quimiocinas proinflamatorias CXCL1 /2, al potenciar la activación de NF-kB a través de Akt-EGFR transactivated, contribuye a la progresión del cáncer de ovario CXCR2 impulsada
Visto:. Dong YL, Kabir SM, Lee ES, Hijo DS ( 2013) CXCR2-Driven ovárico progresión del cáncer Involucra Regulación al alza de quimiocinas proinflamatorias potenciando la activación NF-kB vía EGFR-transactivated señalización Akt. PLoS ONE 8 (12): e83789. doi: 10.1371 /journal.pone.0083789
Editor: Ichiro Aoki, Escuela de Medicina de la Universidad de la Ciudad de Yokohama, Japón
Recibido: 5 de Junio, 2013; Aceptado: 8 de noviembre de 2013; Publicado: December 20, 2013
Derechos de Autor © 2013 Dong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH), Instituto Nacional de Ciencias médicas generales (NIGMS) SC1 089630 (EL) y Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) SC1AI089073 (DS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario, uno de varios tipos de cáncer asociados con la inflamación, es la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres. Es una enfermedad insidiosa porque es típicamente asintomática hasta que los tumores se han extendido más allá de los ovarios [1]. El microambiente tumoral proinflamatoria de cáncer de ovario se asocia clínicamente con diseminación tumoral peritoneal y ascitis masiva, seguida de una alta tasa de mortalidad. células de cáncer de ovario expresan altos niveles de factor de necrosis tumoral (TNF), lo que indica la importancia potencial de TNF como un regulador de la microambiente tumoral proinflamatoria en esta malignidad [2] - [4]. Particularmente, el TNF se ha demostrado que regulan las redes de quimioquinas en las células de cáncer de ovario a través de la vía de señalización del factor nuclear-kB (NF-kB) [5] - [6]. Las quimioquinas pueden ser mediadores críticos en un microambiente tumoral mediante la contribución a la progresión del cáncer y la metástasis [7] - [8]. Entre los receptores de quimioquinas, las células de cáncer de ovario con frecuencia expresan CXCR2, que ha llevado a la progresión del cáncer de ovario [9]. CXCR2 también es altamente expresado en algunos otros tipos de células cancerosas, tales como adenocarcinoma de pulmón [10], carcinoma de células escamosas de laringe [11], carcinoma endometrial [12], cáncer rectal [13], carcinoma hepatocelular [14] y el cáncer gástrico [15] . Debido a esta asociación, puede ser capaz de servir como un marcador pronóstico independiente. Por lo tanto los ratones knockout CXCR2 tienen una carga tumoral significativamente reducida en el cáncer de próstata [16], Lewis cáncer de pulmón murino [17] y modelos de tumor renal [18] en comparación con ratones de tipo salvaje CXCR2. Además, una deficiencia CXCR2 suprimió profundamente la tumorigénesis inflamación-impulsado en la piel y el intestino [19]. La ausencia de CXCR2 en el microambiente tumoral también impidió el crecimiento de células de cáncer de colon [20]. Por último, CXCL1, un ligando CXCR2, se asoció inversamente con la supervivencia libre de recurrencia en pacientes con cáncer de colon [21].
Estos hechos indican que una vía de señalización mediada por CXCR2 está estrechamente asociada con la progresión del cáncer. Aunque múltiples vías como la apoptosis, la activación de EGFR y la angiogénesis están implicados en la señalización mediada por CXCR2 [9], [16] - [20], todavía hay una gran diferencia en los mecanismos moleculares que unen entre CXCR2 y sus múltiples vías. En nuestro estudio anterior, las líneas celulares de cáncer de ovario altamente expresado CXCL1-3 y CXCL8 [5] - [6], que todos tienen una alta afinidad por CXCR2 [22]. A pesar de que estos ligandos CXCR2 son estrictamente regulados por el NF-kB señalización [5], [23], no está claro cómo CXCR2 y NF-B están involucrados mecánicamente en la progresión del cáncer de ovario. Aquí hemos utilizado líneas parentales de ovario de células de cáncer y las células transfectadas estable CXCR2 generados, así como las células de control transfectadas con el vector vacío. a continuación, definimos el impacto de la señalización de NF-kB, una vía principal proinflamatorias, sobre la contribución potencial de CXCR2 a la progresión del cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Reactivos
recombinante TNF humano, CXCL1 y un anticuerpo específico CXCL1 /2/3 pan para la neutralización se obtuvieron de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN). A CXCL1 /2 kit ELISA humano se adquirió en PeproTech (Rocky Hill, NJ). PD98059 se adquirió de EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ), AG-1478 fue de Enzo Life Sciences International, Inc., (Plymouth Meeting, PA) y Bay11-7082 y LY294002 en Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Los anticuerpos se adquirieron de la siguiente manera: CXCR2 (E-2, sc-7304) y β-actina eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) y I? B, IKK, EGFR, Erk1 /2, Akt y sus formas fosforiladas, tales como I? B (Ser32 /36), EGFR (Tyr1173), Erk1 /2 (Thr202 /Tyr204), IKK (Ser176 /180) y Akt (Ser473), eran de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Lipofectamine 2000, G418 y todos los medios de cultivo líquidos se adquirieron de Invitrogen (Grand Island, NY). Una matriz de PCR a medida para la red de quimioquinas, matriz fija de PCR para los genes relacionados con el ciclo celular, una mezcla maestra de SYBR Green, y shRNAs para el control y CXCR2 vinieron de SABiosciences de Qiagen (Frederick, MD). kits de detección de quimioluminiscencia fueron de GE Healthcare (Piscataway, NJ). Antisentido y sentido oligonucleótidos se obtuvieron de MWG Eurofins Operon (Huntsville, AL). vector de expresión de CXCR2 fue muy amablemente proporcionado por el Dr. Ann Richmond (Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN) mientras que el vector de luciferasa NF-kB vino de BD Biosciences (Palo Alto, CA). Los siRNAs de control y Akt1 se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Por último, el sistema de ensayo indicador de luciferasa,
Renilla luciferasa
-Glo ™ sistema de ensayo y el vector de PRL-TK se obtuvieron de Promega (Madison, WI).
CXCR2 Estable línea celular que expresa y Cultivos Celulares
la línea celular de cáncer de ovario humano Skov-3 se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). CXCR2 líneas celulares que expresan fueron generados por transfección estable CXCR2 o vectores vacíos en las células de cáncer de ovario Skov-3 de los padres y la selección de clones resistentes a G418. Brevemente, las células subconfluentes se transfectaron con CXCR2 o vectores vacíos utilizando Lipofectamine 2000 y luego tratados con G418 para seleccionar clones resistentes a los fármacos. Las células tratadas se cambiaron con los nuevos medios cada 3 días hasta que los clones resistentes a G418 aparecieron. La expresión de la proteína CXCR2 en los clones seleccionados fue confirmada por Western blot y análisis de imagen confocal. Dado que la expresión de CXCR2 en Skov-3 células es controvertido (5, 9), que confirmó la ausencia o, como máximo expresión de la traza de CXCR2 en los niveles de ARNm y proteínas en las células parentales usando matriz de PCR, QRT-PCR, Western blot y análisis de imagen confocal . La línea celular positiva CXCR2 se denominó SKCXCR2, y la línea celular de control negativo CXCR2, SKA. Las células de cáncer de ovario (aproximadamente 5 × 10
4 células /ml) fueron cultivadas a 37 ° C en una atmósfera saturada de agua de 95% de aire y 5% de CO
2 en 24 o placas de 6 pocillos con RPMI medio con penicilina /estreptomicina y 10% de FBS. Después de un cultivo durante la noche para permitir la unión celular a las placas, se retiró el medio y se añadió medio fresco sin FBS para eliminar cualquier efecto de los ingredientes contenidos en los sueros. Los tratamientos con los diferentes agentes se describen en detalle en los resultados.
transferencias Western
Se prepararon lisados celulares, se fraccionó en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa como se ha descrito previamente [6]. El bloqueo de proteínas no específicos se realizó por incubación de las membranas con leche descremada en polvo 5% en solución salina tamponada con Tris Tween-20 (TBST) durante 2 h a temperatura ambiente. Las transferencias se incubaron con anticuerpos primarios a una dilución 1:1,000 en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron 3 veces con TBST durante 10 min, seguido de incubación durante 1 h con peroxidasa de rábano anticuerpo secundario conjugado (1:2,500 dilución) en 5% de leche /TBST. Las membranas se aclararon a continuación 3 veces con TBST durante 10 min y las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia potenciada. Después de membrana de separación de 10 min con metanol que contiene 3% H
2O
2, β-actina se detectó con el fin de servir como control interno de carga de lisados celulares.
Cell Ensayos de proliferación
ensayos de proliferación celular se realizaron mediante la escisión de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) en un producto coloreado. Después de la incubación en una placa de 24 pocillos, cada pocillo se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego una solución de MTT (1 mg /ml de fenol exento de rojo medios de comunicación: PBS = 04:01) se añadió. Las placas se incubaron durante 3 h con protección de la luz. La solución de MTT se eliminó y se añadieron 500 l de isopropanol. Las placas se colocaron en un agitador durante 10 min a temperatura ambiente para disolver completamente el producto de color MTT. La densidad óptica se midió a 595 nm usando un lector de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA). Los valores se normalizaron a los controles no tratados.
Citometría de Flujo
Las células cancerosas se sembraron a densidades iguales y mantenido en cultivo durante 24 h. Las células se trataron a continuación por triplicado con TNF (10 ng /ml) o medio solo como control para 48 h. Las células adherentes y no adherentes se recogieron con PBS frío y se tiñeron con yoduro de propidio [50 mg /ml en 0,1% (w /v) de citrato de sodio, 0,1% (v /v) de Triton X-100] durante la noche. Después de la incubación durante la noche, las muestras se analizaron mediante un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences) y el porcentaje de células en G0 /G1, las fases G2 /M y S cuantificaron utilizando el software FloJo (Árbol Star Inc., Ashland, Oregón).
transitorias las transfecciones y luciferasa los ensayos
actividad promotora CXCL1 se realizó con generado vector KC701LUC y sus mutantes como se describió previamente [23]. células de cáncer ovárico en aproximadamente 50% de confluencia en placas de 24 pocillos se lavaron una vez con medio fresco sin aditivos y luego transfectadas transitoriamente con vectores de objetivo o Akt1 siRNA (concentración final: 10 nM) durante 24 h a 37 ° C usando solución de Lipofectamine. Se trataron células transfectadas como se describe en Resultados y se incubaron durante 6 h. Después de aclarar las células con PBS frío y la adición de tampón de lisis (Promega, Madison, WI), los lisados celulares se utilizaron para la determinación de la actividad de luciferasa usando un luminómetro de microplacas. La actividad de luciferasa, expresada como unidades relativas de luz, se normalizó a los niveles de proteína medidos o la actividad de cada control interno.
Confocal análisis de imágenes
Las células (5000 células /250 medios de comunicación l) se sembraron en portaobjetos de 8 recámara y la unión celular se dejó durante la noche. Las células en los portaobjetos con cámara se lavaron 3 veces en PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente y se bloquearon con 1% de BSA en PBS durante 30 min. El anticuerpo primario se aplicó durante 1 h a temperatura ambiente, y después se lavó con PBS durante 30 min. Los portaobjetos se lavaron 3 veces con PBS y después se incubaron con el segundo anticuerpo conjugado con Alexa Fluor 594 o Alexa Fluor 488 (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE) durante 1 h a temperatura ambiente. Por último, los portaobjetos se lavaron 3 veces con PBS, se montaron con medio que contenía DAPI (Vector Laboratories, Burlingame CA) de montaje y se observaron con un microscopio de fluorescencia (Nikon A1R láser confocal de barrido de imagen).
Array QRT-PCR y PCR
Después de aislar el ARN total y la eliminación de ADN genómico, la reacción de RT se realizó a 42 ° C durante 15 min seguido de 94 ° C durante 5 min. Una reacción de PCR en tiempo real para-ciclo celular genes o quimiocinas relacionadas se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando un Bio-Rad CFX96 (Hercules, CA) y el siguiente programa de ciclos de dos pasos: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, y 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y a 60 ° C durante 1 min. El análisis de datos se realizó sobre la base de una matriz de PCR basada en la Web de Análisis de Datos (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php) proporcionada por SABiosciences de Qiagen (Frederick, MD). Los cebadores utilizados en QRT-PCR fueron las siguientes: 5-TGC AGG GAA TTC CAC CCA AG-3 (hacia adelante) y 5-GGA TGC AGG ATT GAG ACG AG-3 (hacia atrás) para CXCL1 y 5-GCA GGG AAT CAA TCA CCT G-3 (hacia adelante) y 5-GGG GTT GAG ACA AGC TTT C-3 (hacia atrás) para CXCL2.
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
CXCL1 humano actividad /2 era medida por un CXCL1 /2 ELISA kit humana (PeproTech, Rocky Hill, NJ) según las instrucciones del fabricante. Se determinó la densidad óptica de cada pocillo, utilizando un lector de microplacas ajustado a 450 nm con corrección de longitud de onda a 570 nm.
Ensayos de migración y la invasión
Las células tumorales (2x10
5 células /ml en suero libre de medio RPMI-1640 con 1% de BSA) a ser utilizado para un ensayo de migración o invasión se sembraron en el inserto de 24 pocillos de cultivo celular Transwell (Greiner Bio-One) o en Matrigel (BD Biosciences, 1:03 diluido con PBS) revestida Transwell sistema, respectivamente. La cámara inferior contenía 0,5 ml de RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10% como un quimioatrayente. Las células se trataron como se indica en los resultados y luego se incubaron durante 24 h. Las células que permanecieron en el interior del inserto se eliminaron con un hisopo de algodón; migran o invadir las células en el filtro se fijaron con 3,7% de formaldehído y se tiñeron con cristal violeta al 0,1% seguido por lavado de las células con PBS. El número de células que migran o invasores se contó bajo el microscopio (X400) utilizando 5 campos elegidos al azar.
Formación de Colonias
Las células se suspendieron en medio RPMI que contenía 0,4% de agarosa en concentraciones de 2 × 10
3 células por pocillo de una placa de seis pocillos. Las células suspendidas se superpone sobre una capa inferior de solidificado de agarosa al 0,8% en medio RPMI con FBS al 5%, y se incubaron durante 14 días. Las colonias se tiñeron con 0,05% de cristal violeta, fotografiados, y cuantificados.
Desmontables de CXCR2 por CXCR2 shRNA
células del cáncer ovárico en aproximadamente el 50% de confluencia en placas de 24 ó 6 pocillos se lavaron una vez con 1% FBS medio fresco sin aditivos y luego transfectadas transitoriamente con el control o CXCR2 shRNA (concentración final: 1 mg /ml) durante 72 h a 37 ° C usando solución de Lipofectamine. Las células transfectadas fueron confirmados desmontables de proteína CXCR2 y se tratan como se indica en los resultados de acuerdo a diversos experimentos.
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados por el emparejado de Student
t-test y
análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) según sea apropiado. Si una significación estadística (p = 0.05) fue determinada por ANOVA, los datos fueron analizados mediante comparaciones por pares de Tukey para detectar diferencias específicas entre los tratamientos.
Resultados
CXCR2 células positivas tienen un crecimiento más rápido tarifas y son más sensibles a la proliferación de células TNF estimulada por comparación con las células negativas CXCR2
Hemos generado CXCR2 positivo (SKCXCR2) y (SKA) las líneas celulares negativas mediante la transfección de vectores de forma estable CXCR2 o vacíos en Skov-3 cáncer de ovario parental células (figuras 1A y 1B). Las tasas de crecimiento en las células SKCXCR2 y SKA fueron similares para las primeras 24 h de cultivo, pero a las 48 y 72 h, SKCXCR2 tasas de crecimiento celular fueron aproximadamente el doble en comparación con las células SKA (Figura 1C). Desde TNF es bien conocido por ser una citoquina proinflamatoria abundantemente expresado en el cáncer de ovario [2] - [4], hemos probado los efectos de TNF sobre la proliferación celular en las células SKA y SKCXCR2. Los resultados mostraron que el TNF aumentó significativamente la proliferación celular en las células SKCXCR2, pero no tuvo efecto sobre la proliferación de células SKA (Figura 1D). Basado en el análisis FACS, las células SKCXCR2 tenían una reducida fase G0-G1 y un aumento de la fase S (con un ligero aumento en la fase G2-M) en comparación con las células SKA (Figura 1E). TNF en sí, sin embargo, disminuyó claramente SKCXCR2 fase G0-G1 (con un ligero aumento en las fases S y G2-M) mientras que no tuvo efectos sobre las células SKA (Figura 1E).
(A) CXCR2 expresión de proteínas en SKA frente a las células SKCXCR2. Lisados de células enteras se prepararon y transferencias de Western llevadas a cabo utilizando anticuerpos específicos para CXCR2 y β-actina como control de carga. (B) tinción de inmunofluorescencia Representante de SKA frente a las células SKCXCR2, indicando CXCR2 niveles de expresión de proteínas (en verde). (C) La comparación de las tasas de crecimiento en el SKA frente a las células SKCXCR2. Las células se incubaron durante 0, 24, 48 y 72 h y tasas de crecimiento normalizada a 0 h densidades en cada línea celular. Los experimentos se realizaron por triplicado y todos los datos se muestran como media ± S.E. * Y ** (p = 0.05) en cada grupo de comparaciones por pares de ANOVA y de Tukey.#(P = 0.05) entre las células SKA y SKCXCR2 por el emparejado de Student
t-test
. (D) Efecto de TNF sobre la proliferación celular en SKA frente a las células SKCXCR2. Se incubaron las células con vehículo (control) o TNF (10 ng /ml) durante 48 h. Un ensayo de proliferación celular se realizó mediante MTT y los valores normalizados a controles no tratados. Los experimentos se realizaron por triplicado y todos los datos se muestran como media ± S.E. * (P = 0.05) por el estudiante de
t-test
. (E) los efectos del TNF en el ciclo celular etapas G0-G1, S y G2-M en SKA frente a las células SKCXCR2. Las células se trataron con vehículo (control) o TNF (10 ng /ml) durante 48 h. La citometría de flujo se realizaron ensayos para determinar el% de células en cada fase. Se muestran histogramas representativos. Los experimentos se llevaron a cabo 5 veces independientes y los datos en cada inserto se muestran como media ± S.E. Azul y letras rojas indican la significación (p = 0.05) en comparación con el control y el tratamiento SKA TNF, respectivamente, por
t-test.
Además, hemos probado los efectos de Student de TNF en células genes relacionados con el ciclo en SKA frente a las células SKCXCR2. células SKCXCR2 tenían encima de 50% de disminución de ciclina B1 (0,49), ciclina F (0,38), G2 ciclina (0,47) y p21 (0,25) en comparación con las células SKA. TNF no tuvo efecto significativo sobre los genes relacionados con el ciclo celular en las células de control SKA, pero dio lugar a & gt; 2 veces mayor de GADD45α en las células SKCXCR2 (Tabla S1). GADD45α se ha demostrado que es un mediador de la apoptosis inducida retinoide sintético en células de carcinoma de ovario [24]. Por lo tanto la interrupción de GADD45α se ha demostrado que la promoción de la formación del tubo y la migración de las células endoteliales [25]. La migración celular y capacidades invasivas eran de hecho mucho mayor en los fibroblastos de embriones de ratón deficientes en GADD45α [26]. Sobre la base de estas características funcionales de GADD45α, un aumento de TNF inducida en GADD45α es poco probable que se asocia con la proliferación celular en las células mejorada SKCXCR2.
CXCR2 células positivas Mejorar NF-kB de activación seguido por un aumento de CXCR2 ligandos (CXCL1 y 2), en comparación con células negativas CXCR2
como NF-kappa B es la vía de señalización primaria para las funciones de TNF, por lo que investigó si la proliferación celular inducida por TNF en células SKCXCR2 implicado señalización NF-kB. Ambos niveles basales y de TNF inducida por la actividad del promotor de NF-kappa B eran más altos en las células SKCXCR2 (Figura 2A). La tinción inmunofluorescente de manifiesto que las células tenían SKCXCR2 I? B fosforilada más en comparación con células SKA (Figura 2B). Por otro lado, la expresión de I? B fue mayor en las células SKA en comparación con células SKCXCR2 (Figura 2B). El análisis de transferencia Western demostró que las células que expresan CXCR2 tenían IKK más fosforilada y I? B (como un efecto aguas abajo directa de IKK) tanto en sus estados basales, así como en respuesta a TNF con el tiempo (Figura 2C). la activación de NF-KB mediada por CXCR2 puede implicar ligandos de quimiocinas que contienen sitios kappa B en sus promotores [5] - [6], [23]. Por lo tanto, se compararon los perfiles de red de quimioquinas en las células SKA y SKCXCR2 utilizando una matriz de PCR. Los resultados mostraron que las células tenían una SKCXCR2 & gt;. Incremento de 2 veces en las quimiocinas proinflamatorias CXCL1 y CXCL2 en comparación con las células SKA (Figura 2D)
(A) Efecto de TNF sobre las actividades de luciferasa de NF-kB en SKA y SKCXCR2 células. Después de la transfección usando NF-kB vector de luciferasa durante la noche, las células se trataron con TNF (10 ng /ml) durante 4 h. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se muestran como media ± S. E. * Y#(p = 0.05) en comparación con las células control y SKA, respectivamente, por
t-test
de Student pareada. (B) tinción de inmunofluorescencia de las células Representante SKA y SKCXCR2 que indican la activación de I? B y CXCR2 niveles de expresión de proteínas (en verde). (C) Efecto de TNF (10 ng /ml) en el tiempo (0-120 min) sobre la activación de NF-kB en las células SKA y SKCXCR2. Lisados de células enteras se prepararon y transferencias de Western llevadas a cabo utilizando anticuerpos específicos para I? B y IKK, así como sus formas fosforiladas (pIκB y PIKK). β-actina se utilizó como control de carga. comparaciones de perfiles (D) de quimioquinas en relación con las células SKCXCR2 SKA. Después de aislar el ARN total, se realizó una quimiocina humana PCR matriz. La línea de puntos indica un aumento de 2 veces; los que tienen un & gt; aumento de 2 veces y media ciclo umbral & lt; 30 son reconocidos como quimiocinas inducidas, y en este caso representan CXCL1 y 2 (*) guía empresas
CXCR2 células positivas Aumentar CXCL1 /2. , y están involucrados en la proliferación celular y aumentar la emigración, la invasión y la formación de colonias comparación con las células negativas CXCR2
se confirmó que las células producen más SKCXCR2 CXCL1 y CXCL2 que las células SKA por QRT-PCR y ELISA ensayo (Figuras 3A y 3B). Aunque las células SKCXCR2 tenían un mayor aumento de CXCL2 de CXCL1 en el ARNm (Figura 3A), por lo que la proteína total, no había más proteína CXCL1 total (Figura 3B) que CXCL2, probablemente como resultado de mayor cantidad de CXCL1 mRNA (Figura 2D ). Sobre la base de la conexión CXCR2-NF-KB-CXCL1 /2 presunta, hemos probado si CXCL1 o anticuerpo afectado a su proliferación celular de manera diferente en las células SKA y SKCXCR2. La adición de CXCL1 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular en las células SKA, pero aumentó significativamente la proliferación de células SKCXCR2 (Figura 3C). Asimismo, mientras que un anticuerpo pan para CXCL1 /2/3 no tuvo efecto sobre la proliferación celular en las células SKA disminuyó significativamente la proliferación en las células SKCXCR2 (Figura 3D). Además se confirmó que el anticuerpo reduce la cacerola CXCL1 y el ARNm en las células CXCL2 SKCXCR2 (Figura 3E). Debido a que se encontró el eje CXCL1-CXCR2 para promover la invasión del tumor gástrico [15], se compararon las capacidades de migración e invasión de células SKA y SKCXCR2. SKCXCR2 células habían mejorado las propiedades de migración e invasión en comparación con las células SKA (Figuras 3F y 3G). Con base en el aumento de la migración y la invasión de las células SKCXCR2, hemos probado, además, una formación de colonias en agar blando para detectar si había una mayor transformación maligna de las células SKCXCR2, y encontramos que las células SKCXCR2 producen más colonias que las células SKA (Figura 3H).
(a) Confirmación de CXCL1 y la expresión en células CXCL2 SKA y SKCXCR2 de QRT-PCR. Después de aislar el ARN total, QRT-PCR se realizó usando cebadores para CXCL1 y CXCL2. concentraciones (B) Celular CXCL1 y CXCL2 en células SKA y SKCXCR2 durante un período de 24 h. lisados de células enteras se prepararon y llevaron a cabo ELISA utilizando anticuerpos específicos para CXCL1 y CXCL2 y los valores se normalizaron a la proteína total. (C) Efecto de CXCL1 en la proliferación celular en las células SKA y SKCXCR2 de 48 h de incubación. (D) Efecto de anticuerpo bandeja para CXCL1 /2/3 sobre la proliferación celular en las células SKA y SKCXCR2. Las células se incubaron con IgG normal (control) y anticuerpo pan (1:100 dilución) durante 48 h. El ensayo de proliferación celular se realizó mediante MTT y los valores se normalizaron a los controles no tratados. (E) Efecto del anticuerpo bandeja para CXCL1 /2/3 sobre CXCL1 y la expresión en células CXCL2 SKCXCR2 de QRT-PCR. Después de tratar con el anticuerpo pan durante 24 h y luego el aislamiento de ARN total, QRT-PCR se realizó usando cebadores para CXCL1 y CXCL2. características de migración (F) entre las células SKA y SKCXCR2. características (G) Invasión entre las células SKA y SKCXCR2. (H) Comparación de la formación de colonias entre las células SKA y SKCXCR2. Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado y los datos se muestran como media ± S.E. * Y#(p = 0.05) calculado por el estudiante de
t-test
.
CXCR2 células positivas transactivate EGFR en un grado superior, lo que resulta en la activación de Akt que contribuye a NF kappa B Signaling
Desde que se demostró que CXCL1 puede inducir la proliferación en células de cáncer de ovario epitelial por la transactivación de EGFR [27], se comparó la transactivación de EGFR en células SKA y SKCXCR2. SKCXCR2 células tenían un mayor nivel de EGFR fosforilado, el resultado es mayor activación de Akt, pero había poco efecto sobre los niveles de Perk (Figura 4A). de formación de imágenes confocal revelaron que las células tenían SKCXCR2 Akt fosforilada más en comparación con células SKA (Figura 4B). Desde Akt y ERK vías se refieren a la supervivencia celular y la proliferación, se comprobó los efectos comparativos de los inhibidores de PI3K /Akt o Erk sobre la proliferación celular en las células SKA y SKCXCR2. Aunque AG-1478, LY294002 y PD98059 atenúa la proliferación celular tanto en células SKA y SKCXCR2, sus efectos sobre la proliferación eran mucho mayores en las células SKCXCR2 (Figura 4C). Esto nos permitió determinar si los inhibidores de EGFR afectados aguas abajo promotor de la actividad NF-kB en las células SKA y SKCXCR2. AG-1478, un inhibidor específico de EGFR quinasa, no tuvo ningún efecto significativo sobre la actividad del promotor de NF-kB en las células SKA, pero atenúa la actividad en las células CXCR2 positivos de una manera dependiente de la dosis (Figura 4D). Aunque LY294002, un inhibidor selectivo de PI3K altamente que bloquea la activación de Akt, atenuada NF-kB actividad promotora en ambos tipos de células de una manera dependiente de la dosis, que tenía un mayor efecto inhibidor sobre la actividad en las células SKCXCR2. Curiosamente, PD98059, un inhibidor de Erk específico, no tuvo ningún efecto significativo sobre la actividad del promotor de NF-kappa B en cualquiera de los tipos de células (Figura 4D). Hemos confirmado los efectos de los inhibidores específicos de EGFR, Akt y la activación de ERK (Figura 4E).
(A) Comparación de la activación de EGFR en células SKA y SKCXCR2. lisados de células enteras se prepararon y transferencias de Western llevaron a cabo utilizando anticuerpos específicos para EGFR, Akt, Erk y las formas fosforiladas (pEGFR, pAkt y Perk). Las formas no fosforiladas se utilizaron como controles de carga. (B) los patrones de tinción de inmunofluorescencia representativas que indican la activación de Akt y CXCR2 los niveles de expresión de proteínas en células SKA y SKCXCR2. (C) Efectos comparativos de AG-1478, LY294002 y PD98059 sobre la proliferación celular en las células SKA y SKCXCR2. Se incubaron las células con vehículo (control), AG-1478 (AG, 2 mM), LY294002 (LY, 2 M) o PD98059 (PD, 20 M) durante 48 h. El ensayo de proliferación celular se realizó mediante MTT y los valores se normalizaron a los controles no tratados. * Y#(p = 0.05) en comparación con los controles (C) y las células SKA, respectivamente, por el estudiante de
t-test
. efectos (D) Dependiente de la dosis de los inhibidores de EGFR aguas abajo sobre las actividades de luciferasa NF-kB en las células SKA y SKCXCR2. Después de la transfección con NF-kB vector de luciferasa durante la noche, las células fueron tratadas con AG-1478 (inhibidor de EGFR, 0, 0,5, 1 y 2 M), LY294002 (inhibidor de Akt, 0, 0,5, 1 y 2 M) o PD98059 (inhibidor de Erk , 0, 5, 10 y 20 mM) para 4 h. * Y#(p = 0.05) en comparación con los controles (0 h) y células SKA, respectivamente, por los de
t-test
Estudiante. Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado y los datos se muestran como media ± S.E. (E) La confirmación de inhibidores específicos de EGFR, Akt y la activación de ERK en las células SKA y SKCXCR2. Las células fueron tratadas con AG-1478 (2 mM), LY294002 (2 M) y PD98059 (20 mM) durante 4 h. Lisados de células enteras se prepararon y un Western blot se llevó a cabo utilizando anticuerpos específicos para EGFR, Akt, Erk y sus formas fosforiladas (pEGFR, pAkt y PERK). Las formas no fosforiladas se utilizaron como controles de carga.
CXCL1 Mejora la activación de NF-kB en células que expresan CXCR2 aumento de la actividad CXCL1 Promotor a través de un NF-kB sitio
Para aclarar la participación de señalización en el eje de CXCL1-CXCR2 NF-kB, hemos probado los efectos comparativos de CXCL1 añadido sobre la activación de NF-kB en las células SKA y SKCXCR2. CXCL1 producida I? B fosforilada en células más SKCXCR2 comparación con las células SKA (Figura 5A). Además, un anticuerpo CXCL1 /2/3 no tuvo efectos sobre la actividad del promotor de NF-kappa B en células SKA pero disminuyó significativamente esta actividad en las células SKCXCR2 (Figura 5B). Sobre la base de la participación de NF-kB en el eje de CXCL1-CXCR2, se compararon los efectos de Bay11-7082, un inhibidor específico de NF-kappa B, sobre la proliferación celular en las células SKA y SKCXCR2. Bay11-7082 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular en las células SKA pero disminuyó significativamente la proliferación en las células SKCXCR2 (Figura 5C). La inhibición fue mayor en las células SKCXCR2, probablemente debido a la mayor activación de NF-kappa B en estas células (figuras 2A-C). Además, se compararon los efectos de Bay11-7082 en una invasión de células CXCL1 inducida. Aunque CXCL1 tuvo un pequeño efecto sobre la invasión celular en las células SKA, las diferencias no fueron significativas (Figura 5D). Por otro lado, las células SKCXCR2 tenían al menos una duplicación de números de la invasión de células en respuesta a CXCL1 en comparación con los controles (Figura 5D). Bay11-7082 también bloqueó la invasión de células CXCL1 inducida en las células SKCXCR2 (Figura 5D), lo que indica la implicación de la señalización de NF-kB.
(A) Efectos comparativos de CXCL1 en la activación de NF-kB en las células SKA y SKCXCR2 . Las células se trataron con CXCL1 (100 ng /ml) y los resultados examinados de una manera dependiente del tiempo. Lisados de células enteras se prepararon y transferencias de Western llevadas a cabo utilizando anticuerpos específicos para I? B, I? B fosforilada (pIκB) y CXCR2. β-actina se utilizó como control de carga. β-actina se utilizó como control de carga. β-actina se utilizó como control de carga.