Extracto
El tratamiento antiangiogénico es importante para el tratamiento del cáncer ginecológico. Sin embargo, el beneficio terapéutico derivado de estos tratamientos es transitoria, predominantemente debido a la activación selectiva de las vías de proangiogénicos compensatorios que conducen a un rápido desarrollo de la resistencia. El objetivo fue identificar y seleccionar potencial de señalización a la terapia anti-factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) alternativo, con vistas al desarrollo de una combinación de agentes antiangiogénicos para proporcionar beneficios terapéuticos prolongados. Hemos desarrollado un
in vivo
fenotípica modelo de resistencia preclínica de cáncer de ovario resistente a la terapia antiangiogénica. Medimos cambios dinámicos en quimiocinas secretadas y la señalización angiogénica en los tumores y el plasma en respuesta al tratamiento anti-VEGF, como tumores avanzados de la fase de respuesta inicial a la progresión de la enfermedad. En los tumores que progresaron tras el tratamiento con sorafenib, expresión de genes y proteínas niveles de quimiocinas CXC proangiogénicos y sus receptores fueron significativamente más elevada, en comparación con los tumores que responden. La quimiocina (C-X-C motivo) ligando 8 (CXCL8), también conocido como aumento de la interleucina-8 (IL-8) era dependiente del tiempo y coincidió con la dinámica de la progresión tumoral. Utilizamos SB225002, un inhibidor farmacológico de quimiocina (motivo CXC) del receptor 2 (CXCR2), para interrumpir las funciones CXC quimiocinas mediada por células de cáncer de ovario en
in vitro
ensayos de inhibición del crecimiento celular, la formación de esferoides, y la migración celular. La combinación de un inhibidor de CXCR2 con sorafenib condujo a una inhibición sinérgica del crecimiento celular
in vitro
, y la progresión tumoral estabilizado aún más tras sorafenib
in vivo
. Nuestros resultados sugieren que las quimiocinas CXCR2 mediada pueden representar una importante vía compensatoria que promueve la resistencia a la terapia antiangiogénica en el cáncer de ovario. Por lo tanto, el bloqueo simultáneo de esta vía de citoquinas proangiogénico usando inhibidores de CXCR2 y el receptor de VEGF vía (VEGFR) podría mejorar los resultados de la terapia antiangiogénica
Visto:. Devapatla B, Sharma A, S Woo (2015) CXCR2 inhibición combinada con Sorafenib mejorada antitumoral y antiangiogénica de respuesta en modelos preclínicos de cáncer de ovario. PLoS ONE 10 (9): e0139237. doi: 10.1371 /journal.pone.0139237
Editor: Domenico Ribatti, Universidad de la Escuela de Medicina de Bari, Italia
Recibido: 10 Junio, 2015; Aceptado: September 10, 2015; Publicado: 28 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Devapatla et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por los Institutos nacionales de Ciencias médicas generales de los Institutos nacionales de la Salud bajo el premio número P20GM103639. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la principal causa de muerte por cáncer ginecológico en los EE.UU. cuando son tratados con quimioterapia estándar actual de atención, la tasa de supervivencia a cinco años de la enfermedad avanzada sigue siendo baja. Los tumores de ovario son muy vascularizado; existe una correlación entre el recuento de microvascular y la agresividad biológica [1, 2]. La angiogénesis juega un papel central tanto en la función ovárica normal y el desarrollo y progresión de cáncer de ovario [3]. La angiogénesis tumoral es fundamental para el desarrollo de ascitis y la metástasis del cáncer de ovario en el espacio peritoneal [4]. Como la angiogénesis es un paso crítico en la propagación del crecimiento del tumor maligno y metástasis [5], la angiogénesis es un blanco válido en el tratamiento del cáncer [6] de ovario. factores proangiogénicos múltiples promueven el proceso de formación de vasos con VEGF como un actor central en la angiogénesis tumoral mediada [5]. Un número de agentes antiangiogénicos, incluyendo el anticuerpo terapéutico contra VEGF bevacizumab y inhibidores de la quinasa de objetivos múltiples de receptores de VEGF (VEGFR), se han investigado activamente o están en desarrollo como tratamientos para la enfermedad avanzada. El tratamiento con bevacizumab proporcionó un beneficio de supervivencia libre de progresión (SLP) en el cáncer de ovario avanzado cuando se administra en combinación con quimioterapia [7, 8]. Varios inhibidores de VEGFR-focalización multi-quinasa tales como nintedanib, trebananib, pazopanib, sunitinib, sorafenib, cediranib se han probado en diferentes fases de los ensayos clínicos sobre el cáncer de ovario [9]. Algunos de estos agentes, incluyendo pazopanib, nintedanib, cediranib, y trebananib, se han evaluado en ensayos clínicos de fase III aleatorizados, y todos ellos han demostrado una supervivencia libre de progresión (SLP) en beneficio [10]. Sin embargo, el beneficio terapéutico de la terapia anti-VEGF es de corta duración. La progresión tumoral es finalmente restaurada después de una respuesta inicial, lo que indica la aparición de resistencias. La comprensión de los mecanismos de escape tumoral de la terapia anti-VEGF es fundamental para encontrar estrategias para evitar la resistencia. Varios mecanismos están implicados en la resistencia adquirida a la terapia anti-VEGF, incluyendo la activación de vías alternativas para eludir la inhibición de VEGF, reanudando de este modo la angiogénesis tumoral y el crecimiento del tumor [11]. Por lo tanto, la combinación de diferentes terapias antiangiogénicas pueden ser una estrategia para proporcionar beneficios terapéuticos duradera
.
Muchos factores de crecimiento que están implicados en la invasión del cáncer de ovario son también prominente en su angiogénesis [4]. quimiocinas inflamatorias juegan un papel importante en la angiogénesis y la progresión del cáncer de ovario. Las interacciones entre las quimiocinas producidas por las células de cáncer de ovario y receptores de quimioquinas expresados por las células endoteliales y el microambiente tumoral promover el crecimiento del tumor mediante la estimulación de la angiogénesis y aumento de la migración, invasión, y la proliferación celular [12-14]. Entre los subconjuntos de quimiocinas, las quimiocinas CXC con el ácido 3-amino (Glu-Leu-Arg /ELR) motivo (ELR
+), incluyendo CXCL1, 2, y 3 (GRO-α, β y γ), CXCL5 , CXCL6, CXCL7, y CXCL8 (IL-8), son potentes reguladores de la angiogénesis y median su actividad angiogénica a través de la quimiocina CXCR2 receptor [14]. La sobreexpresión de las quimioquinas CXCR2 proangiogénicos y se correlaciona con mal pronóstico en pacientes con cáncer de ovario [12, 15-17]. Por lo tanto, ELR
+ CXC quimiocinas vías proangiogénico son una alternativa potencial para promover la angiogénesis en los tumores ováricos.
Para identificar estrategias eficaces para evitar el mecanismo por el cual el cáncer de ovario no pasa por la terapia anti-VEGF, que generó un xenotrasplante modelo de resistencia a la terapia antiangiogénica que imita estrechamente resistencia clínica a cáncer de ovario. Se identificaron los cambios en citocinas y las vías angiogénicos en tumores resistentes a las terapias antiangiogénicas, como tumores progresaron de la fase de respuesta inicial a la fase refractaria. Nuestro
in vitro
y
in vivo
resultados indicaron que la co-orientación del eje de citoquinas proangiogénico CXCR2 con la inhibición anti-VEGF es una estrategia eficaz para proporcionar beneficios terapéuticos prolongados en modelos preclínicos de ovario cáncer.
Materiales y Métodos
células y reactivos
la línea celular de cáncer de ovario Skov-3 se obtuvo de la American Type Culture Collection. A2780 y OVCAR429 células de cáncer de ovario fueron amablemente proporcionados por el Dr. Danny Dhanasekharan (Centro de Cáncer Stephenson, OUHSC). La línea celular de cáncer de ovario A2780 se obtuvo inicialmente a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). OVCAR429 son células de cáncer de ovario que han sido publicados anteriormente [18, 19]. A2780 y OVCAR429 células se mantuvieron en medio RPMI (Invitrogen). células SKOV-3 se mantuvieron en medio de McCoy 5A (Invitrogen). Los medios se suplementaron con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen) a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2. Las células humanas endoteliales de la vena umbilical (HUVEC) y medios de comunicación de las células endoteliales se adquirieron de Cell Applications (San Diego, CA). Sorafenib se obtuvo de los laboratorios de LC (Woburn, MA). SB225002 (
N
- (2-hidroxi-4-nitrofenil) -
N
'- (2-bromofenil) urea) es un inhibidor no peptídico potente y selectivo de CXCR2 (IL- 8R) receptor de quimioquinas. SB225002 se adquirió de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). preparaciones de fármacos para el sorafenib y SB225002 se realizaron de acuerdo con los métodos descritos en otra parte [20, 21].
Animales y tratamiento farmacológico
Seis semanas de edad, hembra atímicos
nu /nu
ratones desnudos fueron adquiridos de Charles River Laboratories, Inc., a través de NCI (Frederick, MD). Todos los procedimientos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC), y el protocolo fue aprobado por la universidad del centro de Oklahoma Health Sciences (OUHSC) Institucional Cuidado de Animales y el empleo (Número de protocolo: 12-154-H). Los ratones recibieron inyecciones subcutáneas de 5 × 10
6 Skov-3 células en el flanco derecho. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana usando calibradores digitales (Mitutoyo) con una precisión de ± 0,02 mm. El volumen del tumor se calculó como 4/3 π largo x ancho x altura. Los ratones fueron tratados con solución salina o sorafenib cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 80 mm
3 en volumen, 32 días después de la implantación de células tumorales. Sorafenib se administró diariamente por sonda oral a una dosis de 30 mg /kg. El tratamiento continuó hasta que los tumores crecieron a 20 mm (el máximo permitido por el crecimiento IACUC), momento en que se sacrificaron los ratones. tumores de xenoinjertos que el aumento de menos de 50% del volumen inicial del tumor al comienzo del tratamiento se consideraron tratamiento sensible, ya que esto mostró una tendencia a largo plazo hacia la estasis del tumor [22]. Se consideraron los tumores que progresaron con una tendencia a largo plazo hacia el crecimiento continuado después de una respuesta inicial al tratamiento emergente para mostrar fenotípica al tratamiento de resistencia. En varios puntos de tiempo, se utilizó la punción retro-orbital para recoger aproximadamente 30 l de sangre en tubos que contenían EDTA para determinar los perfiles de tiempo de circulación citoquinas y factores angiogénicos. Los animales fueron anestesiados antes de la recogida de sangre retro-orbital usando 2% de isoflurano en una cámara de inhalación regulado con un vaporizador calibrado. Los ratones se controlaron diariamente y sacrificados tan pronto como no había ninguna evidencia de que el ratón era de dolor por el tumor o las drogas o si la carga del tumor alcanzó 20 mm. Los criterios de valoración de eutanasia tempranos incluyen toxicidad moderada o grave, incluyendo la pérdida rápida de peso de más de 10% del peso corporal, pérdida de peso gradual de mayor que 15%, debilidad, falta de respuesta, dificultades respiratorias, graves signos neurológicos anormales, sangrado, trauma o la incapacidad de comer o beber. Después de las ocho semanas de tratamiento con fármacos, todos los ratones fueron sacrificados mediante CO
2 asfixia y someterse a autopsia. sangre y los tejidos tumorales se recogieron para los análisis descritos a continuación. El plasma se aisló y se almacena a -80 ° C hasta su análisis.
En el
in vivo
combinación de estudio, Skov-3 xenoinjertos fueron tratados con 30 mg /kg /día sorafenib hasta la aparición de resistencia fenotípica como se define anteriormente. Sorafenib animales resistentes fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos para recibir sorafenib, SB225002, o una combinación de sorafenib y SB225002. SB225002 se administró una vez al día mediante inyección intraperitoneal (IP) en una dosis de 10 mg /kg. grupo de tratamiento de combinación diaria recibió una dosis oral de 30 mg /kg sorafenib más 10 mg /kg SB225002 (IP) hasta el final del estudio.
citocinas y factor de crecimiento angiogénico ensayo multiplex
realizado un ensayo múltiple para identificar los cambios en los niveles de factores de crecimiento angiogénicos en circulación en animales de tratamiento sensibles y resistentes a. Las concentraciones plasmáticas de proteínas de crecimiento a tumores del estroma y /Host-angiogénicos que emana se determinaron por separado utilizando (Millipore, cat#MAGPMAG-24K) /factor de crecimiento de la angiogénesis paneles de perlas magnéticas humana (Millipore, cat#HAGP1MAG-12K) y de ratón, respectivamente. Se cuantificó un total de factores angiogénicos solubles humanos 17 y 24 de ratón. Una lista de los analitos cuantificados se proporciona en los métodos de reparto (S1 Archivo). Los niveles de solubles de CXC quimiocinas CXCL1, 2, 5 y 6 en las muestras de plasma de ratón se determinaron mediante un ensayo multiplex (Bio-Rad, cat#171- AK99MR2).
ensayo de inhibición de crecimiento
in vitro
inhibición del crecimiento celular se midió a través En ensayo MTS (Promega). Brevemente, 5 x 10
3 HUVEC o células SKOV-3 se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Agregamos varias concentraciones que van de 0,01 a 100 mM de sorafenib o SB225002 a 100 l de medio fresco y se incubaron las células durante el tiempo indicado. Agregamos 20 l de CellTiter 96 acuoso un reactivo solución y se incubaron las células durante 1 hora. Se midió la absorbancia a 450 nm. La viabilidad celular se calculó en relación con los controles (células tratadas con vehículo solo). Los promedios de tres repeticiones por muestra se utilizaron para el análisis.
Los efectos combinados de sorafenib y SB225002 se determinaron utilizando diversas células de cáncer de ovario y HUVECs. IC
50 valores se determinaron para ambos fármacos con cada línea celular. La concentración superior de la combinación se preparó mezclando el sorafenib y SB225002 en proporción de 1: 2 de su IC
50 para células de cáncer de ovario y de relación 1: 1 para HUVECs en función de su IC
50 valores. La dilución en serie (3x) se llevó a cabo a partir de la concentración de la parte superior para obtener un total de 5 diluciones (
n =
3 repeticiones). Las células (5000 células /pocillo) se incubaron a 37 ° C durante 48 horas. La supervivencia celular se estudió usando un ensayo MTS como se describe anteriormente. La naturaleza de los efectos combinatorios de los dos fármacos se determinó mediante el cálculo del índice de combinación valores (IC), que se caracteriza por la sinergia (CI & lt; 1), adición (CI = 1), o el antagonismo (CI & gt; 1), usando Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido).
tubo de ensayo de formación de angiogénesis
Crecimiento matriz de Matrigel reducido factor (Corning) se descongeló a 4 ° C durante la noche y luego recubierto inferior en un 96 pocillos placa (50 l por pocillo) a 37 ° C durante 30 minutos. A continuación, se añadieron 100 l de medio que contenía HUVECs (10.000 células), con o sin sorafenib, y SB225002 a cada pocillo en la parte superior de la matriz de Matrigel solidificado y se incubaron a 37 ° C durante 16 horas. Wells se fijaron en 4% de paraformaldehído y redes se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de contraste de fase. Para la cuantificación de las redes, se utilizó el software WimTube (Wimasis).
Transwell ensayo de migración
ensayos de migración celular se realizaron con insertos de 8 micras de poro transwell (Corning) como se ha descrito anteriormente [23 ]. A las cámaras inferiores, se añadieron 500 l de medio de crecimiento endotelial. Las alícuotas de 2 × 10
4 HUVEC en 200 l de medio basal endotelial fueron sembradas en las cámaras superiores. Ambas cámaras superior e inferior contenían sorafenib o SB225002 a las concentraciones indicadas. Después de que el ensayo corrió durante 24 horas a 37 ° C, las células no migradas fueron retirados de la superficie superior del filtro utilizando hisopos de algodón. Las células en la superficie inferior de la membrana se fijaron con metanol enfriado con hielo y se tiñeron con cristal violeta. Las células se contaron bajo un microscopio óptico (x 40).
esferoide ensayo
SKOV-3 esferoides de células fueron cultivadas utilizando el método de superposición de líquido [24]. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos de agarosa-recubierto que contiene 200 l de medio (2000 células /pocillo). Las células se incubaron durante 72 horas hasta que esferoides formados. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de sorafenib o SB225002. Cada dos días, reemplazamos 100 l de medio de edad con un nuevo medio y las drogas. Esferoides fueron monitoreados durante un máximo de 10 días. Los tamaños de esferoides se midieron utilizando el software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).
Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica (IHC) cuantificación de datos se describe en los métodos de soporte ( S1 File). Se utilizó anticuerpos específicos para CD-31 (Abcam, cat#ab28364) y Ki-67 (Abcam, cat#ab16667) para determinar la densidad microvascular y la proliferación de células tumorales, respectivamente. Un total expresión de CXCR2 en células tumorales y estroma se determinó en los xenoinjertos de tumores de ratón utilizando anti-CXCR2 anticuerpos (Abcam, cat#ab14935).
La expresión génica de ELR
+ CXC quimiocinas
secuenciación del transcriptoma se realizó utilizando el secuenciador Illumina Illumina MiSeq y TruSeq ARN v2 kit y protocolos (Illumina, Inc.) preparación de la muestra. Preparación de la muestra y la construcción de la biblioteca se describe en los métodos de soporte (S1 Archivo).
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con la media ± desviación estándar (SD) los valores utilizando la prueba t de Student, a menos se indique lo contrario. La significación estadística se fijó en
P Hotel & lt; 0.05. datos de combinación de drogas se analizó mediante software Calcusyn utilizando el método del efecto mediana por Chou y Talalay [25]. los datos de inmunohistoquímica fueron analizados utilizando el software ImageJ. metodologías breves se dan en los datos de apoyo. Se utilizó el software GeneSifter (Geospiza, Inc.) para analizar los datos de nuestros estudios de expresión génica en tumores de xenoinjertos.
Resultados
En vivo
resistencia del tumor al tratamiento antiangiogénico fenotípica
observó inhibición del crecimiento tumoral por hasta tres semanas de tratamiento con sorafenib (figura 1A). Después de este período de respuesta inicial, algunos tumores comenzaron progresando, como se evidencia por el aumento de tamaño del tumor a pesar del tratamiento continuado. Durante el período de tratamiento de dos meses, los ratones de xenoinjerto de 10 de 19 (53%) mostraron progresión del tumor y el nuevo crecimiento. Ninguno de los ratones se puso enfermo o muerto antes del punto final experimental. Los datos de tinción IHC reveló la firma antiangiogénico resistente típica en los tejidos tumorales (Figura 1B). la densidad de vasos del tumor (CD-31), y la proliferación celular (Ki-67) fueron significativamente mayores (2-4 veces,
P
& lt; 0,05) en los tumores que progresaron a partir del tratamiento que en los tumores de respuesta (Fig 1C), lo que sugiere que los tumores progresivos fueron capaces de reanudar la angiogénesis y por lo tanto el nuevo crecimiento del tumor.
a) Skov-3 xenoinjertos fueron tratados durante ocho semanas con 30 mg kg sorafenib a través de una sonda oral /día. Los controles se trataron con el vehículo tratamiento solo. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces a la semana y se representan como mm
3 ± SEM. De los 19 ratones, 10 desarrollaron resistencia al tratamiento con sorafenib. Las líneas negras, rojas y verdes indican las medias de las progresiones de volumen del tumor de control, SR, SS y ratones, respectivamente. Una diferencia significativa en el volumen del tumor (*
P
& lt; 0,05) se observó entre los grupos sensibles y-resistentes al tratamiento, a partir de la quinta semana de tratamiento. SS = sorafenib sensible; y SR = sorafenib resistente. B) Representante inmunotinción para CD-31 (fila superior), y Ki-67 (fila inferior) en el control, sorafenib y minúsculas (SS), y los tumores resistentes a sorafenib (SR). C) densidad de los vasos (CD-31) y el índice de proliferación (Ki-67) fueron significativamente superiores en los tumores resistentes a sorafenib en comparación con los tumores de sorafenib y minúsculas.
Los cambios dinámicos de factores angiogénicos circulantes en respuesta al tratamiento anti-VEGF
para identificar los cambios en la señalización de citoquinas y angiogénico secretado, se compararon las concentraciones circulantes de factores angiogénicos en muestras de plasma obtenidas de ratones de tratamiento sensibles y resistentes a. Las muestras fueron obtenidas durante los que responden (2-3 semanas después del tratamiento) y las fases refractarios (6-8 semanas después del tratamiento). Debido a la vasculatura tumoral en xenoinjertos está formado por células progenitoras endoteliales de ratón, se utilizó paneles angiogénicos múltiplex para ratones y seres humanos, para distinguir el origen.
Durante las tres primeras semanas de tratamiento, no hubo diferencias significativas entre el concentraciones de proteínas angiogénicas en ningún grupo (Fig 2A). Cuando surgió la resistencia fenotípica 6-8 semanas post-tratamiento, diferencias en los factores angiogénicos eran evidentes entre los grupos. Varios factores angiogénicos ratón originados, incluyendo el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) -2, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), KC, y la prolactina, se upregulated en el grupo de sorafenib resistente, pero no en el grupo sorafenib sensible (Fig 2A) . Durante la fase de refractario, CXCL8 secretada-tumor (IL-8) niveles aumentó & gt; 4 pliegues (
P Hotel & lt; 0,05). Sorafenib en los tumores resistentes a
A) Doblar los cambios en los factores angiogénicos que circula entre los grupos de tratamiento resistente y sensibles durante el receptivo (2-3 semana) y fases resistente (6-8 semanas) en ratones tratados con sorafenib. Tanto ratón (estroma) y (células tumorales) humana factores angiogénicos solubles se cuantificaron mediante un ensayo multiplex. factores angiogénicos única que se detectaron tanto de ratón y humanos matrices se representan como Log
2 veces los cambios de resistente al tratamiento contra xenoinjertos de tratamiento y minúsculas. Significativo (
P Hotel & lt; 0,05) cambios entre fases sensibles y resistentes se indican con asterisco (*). B) Comparación dependiente del tiempo de plasma IL-8 de concentración (pg /ml ± S.D.) entre resistente al tratamiento (SR) y sensible a los grupos (SS) de ratones tratados con sorafenib. perfiles de tiempo de plasma de IL-8 fueron de conformidad con la progresión tumoral de los tumores fenotípicas-resistente y sensible. Durante el tratamiento, se recogió semanalmente por el método de muestreo escalonada plasma, y IL-8 niveles se midieron por ensayo múltiple. C) análisis de secuenciación de Illumina de ELR humanos y de ratón
+
CXC
la expresión génica de quimioquinas. ELR humana
+
CXC
análisis de la expresión génica de quimioquinas mostró que
CXCL6
expresión fue significativamente mayor en el grupo de resistentes (2,5 veces más alta,
P Hotel & lt; 0,05) que en el grupo sensible. No se observó diferencia significativa entre los grupos sorafenib-sensibles y resistentes a para CXCL1, 2, 3, 4, 5, y 7 niveles de expresión. ELR ratón
+
CXC
análisis de la expresión génica de quimioquinas mostró que todas las citoquinas indicadas, excepto
CXCL2
, fueron significativamente mayores en los grupos resistentes (& gt; 2 pliegues,
P
& lt; 0,05) que los grupos sensibles. SS = sorafenib sensible; y SR = sorafenib resistente. concentraciones D) de plasma de quimioquinas CXC (pg /ml) en ratones de xenoinjerto Skov-3. CXCL1, CXCL2, y CXCL6 niveles fueron significativamente (P
Hotel & lt; 0,05). Sorafenib mayor en los grupos resistentes que en los grupos de sorafenib sensible
También cuantificado los niveles de IL-8 por semana durante un máximo de ocho semanas de tratamiento con sorafenib. Para un máximo de 4 semanas de administración de sorafenib, no se encontraron diferencias significativas en el nivel de IL-8 entre los grupos de tratamiento sensibles y resistentes a (figura 2B). Empezando en la semana cinco, significativamente elevados (
P
& lt; 0,05) los niveles de IL-8 se observaron en tumores resistentes a sorafenib. Estos resultados indican que la IL-8 niveles cambian dinámicamente con el tiempo, que coincide con el perfil de tiempo de la progresión tumoral. Además de IL-8, los datos de nuestro estudio de expresión de genes (Fig 2C) y citoquinas ensayo multiplex (Fig 2D) mostraron que la expresión de otros ELR
+ quimiocinas CXC (por ejemplo, CXCL1, -2, -5, y - 6) fue alta en los tumores resistentes al tratamiento, en comparación con sus homólogos.
CXCR2 expresión en tumores de ovario
Se realizó tinción CXCR2 en los tumores de xenoinjertos de tratamientos de sorafenib para comparar su expresión (figura 3A) en grupos sensibles y resistentes. expresión CXCR2 fue elevada en tumores resistentes en comparación con tumores sensibles y de control. Se observó un aumento de tres veces en los tumores resistentes en comparación con los tumores sensibles (
P Hotel & lt; 0,05, Figura 3B). En el grupo de tratamiento con sorafenib
A) inmunotinción Representante para CXCR2 en control, sorafenib- sensible (SS), y los tumores resistentes a sorafenib (SR). B) la expresión de CXCR2 fue elevado en los tumores resistentes a sorafenib (
P
. & Lt; 0,05) en comparación con los tumores sensibles a sorafenib
in vitro
efectos sinérgicos de sorafenib y SB225002
sobre la base de las conclusiones anteriores de la regulación positiva de la expresión de CXCR2 y múltiple ELR
+ CXC citoquinas proangiogénicos que median sus efectos angiogénicos a través del receptor CXCR2, que investigó los efectos de citoquinas CXCR2 mediada por el uso de SB225002, una inhibidor de molécula pequeña del receptor de quimioquinas CXCR2 (IL-8R), en combinación con sorafenib
in vitro
. Elegimos inhibidores de los receptores de quimioquinas CXCR2 más de los anticuerpos anti-CXC para evitar la función redundante de ELR
+ CXC quimiocinas de señalización. La combinación de sorafenib y SB225002 produce la inhibición del crecimiento significativamente mayor (
P
& lt; 0,005) en las células tumorales y las HUVECs que hizo cualquiera de los tratamientos por sí solo (Fig 4A y 4B). Los valores de CI en diferentes proporciones de concentración en Skov-3 (0,32-0,61) y HUVEC (0,87-1,1) indicaron la sinergia o aditividad entre SB225002 y sorafenib. IC
50 valores de sorafenib y SB225002 en las líneas celulares de cáncer de ovario probados y HUVEC están dentro de los datos de apoyo (S1 Tabla). Las curvas de concentración-efecto del tratamiento de combinación en comparación con sorafenib solos se muestran en la Fig S1.
SB225002 aumentó significativamente los efectos de inhibición del crecimiento de sorafenib en células HUVEC (B) SKOV-3 (A) y. A) Una combinación de 10 M sorafenib y 4 SB225002 M sinérgicamente inhibió el crecimiento de células SKOV-3, en comparación con cada fármaco por separado (
P
& lt; 0,005). B) Una combinación de 4 sorafenib M y 2 M SB225002 sinérgicamente inhibió el crecimiento de las células HUVEC, en comparación con cada fármaco por separado (
P
& lt; 0,01). C) Imágenes representativas de ensayo de formación de tubo de HUVEC tratados con o sin 1 SB225002 M o 2 M sorafenib. la formación del tubo se analizó usando el software de análisis Wimtube y longitud de tubo se presenta en píxeles. La adición de SB225002 al tratamiento sorafenib indujo una disminución estadísticamente significativa en la formación de tubo HUVEC (
P
& lt; 0,005). Los datos se muestran como media longitud de tubo en píxeles ± S.D. de tres experimentos independientes. D) Imágenes representativas de ensayo de migración transwell HUVEC utilizando la cámara. Para cuantificar las células migratorias, tres campos independientes de células migratorias por pocillo se fotografiaron bajo el microscopio de contraste de fase. El número de células por campo fue contado y promedió. Los recuentos de células se expresan como número relativo de células que migraron hacia el lado inferior de la cámara transwell con los resultados de las células de control dados como 1. El efecto inhibidor de sorafenib (2 mM) sobre la migración fue significativamente mayor de 1 M SB225002 (
P
& lt; 0,01). E) el crecimiento esferoidal se ve afectada por la inhibición de CXCR2 en células SKOV-3. áreas esferoides se midieron utilizando el software ImageJ. Los valores representados en el eje Y son píxeles ± S. D. de tres experimentos independientes.
formación de tubo endotelial y la migración son características importantes de la angiogénesis tumoral. Se realizó ensayos de migración transwell de cámara y ensayos de formación de tubo a base de matrigel utilizando HUVECs para evaluar el potencial antiangiogénico de sorafenib y SB225002 en combinación. Como se muestra en la figura 4C, el sorafenib (2 M) y SB225002 (1 M) tratamiento de combinación casi completamente suprimida la formación del tubo HUVEC. La combinación de sorafenib y SB225002 longitud del tubo endotelial inhibió significativamente en comparación con sorafenib (≥ 2 veces,
P Hotel & lt; 0,005) o SB225002 (≥ 3 veces,
P Hotel & lt; 0,005) por sí sola. Además, los resultados del ensayo de migración transwell demostraron que SB225002 potenció significativamente la inhibición sorafenib mediada de la migración endotelial (Fig 4D). Esta combinación provocó un descenso aproximadamente el doble de la migración HUVEC, en comparación con sorafenib y SB225002 tratamientos solos (
P
& lt; 0,01). En conjunto, estos resultados indican que el tratamiento de combinación de sorafenib y SB225002 podrían afectar significativamente el potencial angiogénico de HUVECs
in vitro
.
Dado que la IL-8 desempeña un papel en la agregación de las células tumorales, se realizó una esferoide ensayo para estudiar los efectos de sorafenib y SB225002 sobre el crecimiento de esferoides. SB225002 interrumpido formación de Skov-3 esferoides a una concentración 2 M: sorafenib no lo hicieron (Figura 4E). Una combinación de sorafenib y SB225002 reduce el crecimiento de esferoides (Fig 4E).
SB225002 y sorafenib terapia de combinación en ratones de xenoinjerto sorafenib resistente
Además, evaluó los efectos del tratamiento combinado en sorafenib- xenoinjertos tumorales resistentes
in vivo
. Nos trataron los ratones con sorafenib hasta que los tumores de xenoinjertos de resistencia desarrollados. Después de 46 días de tratamiento sorafenib, los ratones con tumores resistentes a sorafenib recibieron sorafenib, SB225002, o una combinación de los dos fármacos. Los tumores tratados con sorafenib solo progresaron, pero lo hicieron más lentamente que los tumores de control (figura 5). La progresión tumoral se suprimió significativamente cuando se añadió SB225002 a sorafenib (Fig 5). Al final del tratamiento, los tumores de los ratones que recibieron el tratamiento de combinación eran 42% más pequeño en volumen que los tumores de los ratones que recibieron sorafenib solo. Curiosamente, el tratamiento con SB225002 solo no inhibió el crecimiento del tumor que progresó de tratamiento con sorafenib, lo que sugiere la necesidad de mantener el bloqueo de la vía de señalización VEGF. Nuestros resultados muestran que la inhibición CXCR2 combinado con sorafenib alivia eficazmente la progresión tumoral y proporcionado extendió beneficio terapéutico.
SKOV-3 xenoinjertos fueron tratados con una dosis diaria de 30 mg /kg sorafenib hasta que los tumores desarrollados resistencia fenotípica al tratamiento (~ 46 días). Los ratones con tumores resistentes fueron aleatorizados en grupos para recibir uno de los siguientes: 30 mg /kg sorafenib solo (
n
= 6), 10 mg /kg solos SB225002 (
n = 6
), o sorafenib más SB225002 (
n
= 6). La flecha indica el comienzo del tratamiento el día 46. El volumen del tumor se midió en los tiempos indicados y se presentan como media ± S.D. La combinación de sorafenib y SB225002 condujo a una reducción del 42% en el crecimiento del tumor en comparación con sorafenib solo (
P Hotel & lt; 0,05).
Discusión
La angiogénesis juega un importante papel en el desarrollo y progresión del cáncer de ovario. Los tumores de ovario son muy vascularizado, y un alto grado de angiogénesis tumoral en tumores de ovario predice un mal resultado clínico [1, 2, 26]. Los tumores de ovario sobreexpresan factores proangiogénicos, incluidos los VEGF, FGF, angiopoyetina, factores de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGF), y varias citoquinas pro-angiogénicos [10]. Hasta la fecha, resultados alentadores han sido obtenidos con los ensayos de cáncer de ovario que incorporan inhibidores de VEGF de la vía, el bevacizumab anticuerpo terapéutico, e inhibidores de receptor tirosina quinasa de molécula pequeña (TKIs) [27]. La adición de bevacizumab a la quimioterapia reduce el riesgo de empeoramiento de la enfermedad y /o muerte en un 62% en comparación con la quimioterapia sola [8, 28]. Este hallazgo condujo a la reciente aprobación de la FDA de bevacizumab en combinación con quimioterapia en la enfermedad recurrente.