Extracto
La extraordinaria diversidad biológica de los bosques tropicales alberga una rica diversidad química con un enorme potencial como fuente de nuevos compuestos bioactivos. De particular interés son los nuevos entornos para el descubrimiento microbiana. Los perezosos - mamíferos arbóreos que se encuentran comúnmente en los bosques de tierras bajas de Panamá - llevan una amplia variedad de micro y macroorganismos en sus cabellos gruesos exteriores. Aquí se presenta por primera vez el aislamiento de diversos y bioactivos cepas de hongos de pelo pereza, y su colocación taxonómica. Ochenta y cuatro cepas de hongos se obtuvieron en la cultura de la superficie del cabello que se recogió de vivir perezosos de tres dedos (
Bradypus variegatus
, Bradypodidae) en el Parque Nacional Soberanía, República de Panamá. Los análisis filogenéticos revelaron un grupo diverso de Ascomycota pertenecientes a 28 unidades distintas operacionales taxonómicos (Otus), varios de los cuales son divergentes de taxones previamente conocidos. Setenta y cuatro cepas se cultivaron en caldo líquido y extractos crudos se ensayaron para determinar la bioactividad
in vitro
. Encontramos una amplia gama de actividades contra las cepas de los parásitos que causan la malaria (
Plasmodium falciparum
) y la enfermedad de Chagas (
Trypanosoma cruzi
), y en contra de la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 . Cincuenta extractos fúngicos Se analizó la actividad antibacteriana en una nueva pantalla de perfil antibiótico llamado BioMAP; de estos, 20 fueron activos contra al menos una cepa bacteriana, y uno tenía un patrón inusual de bioactividad contra las bacterias Gram-negativas que sugiere un potencial nuevo modo de acción. Juntos, nuestros resultados ponen de manifiesto la importancia de explorar nuevos ambientes para los hongos bioactivo, y demuestran por primera vez la composición taxonómica y bioactividad de los hongos de pelo perezoso
Visto:. Higginbotham S, Wong WR, Linington RG, Spadafora C , Iturrado L, Arnold AE (2014) Cabello pereza como fuente novela de Hongos con potente anti-parasitario, Lucha contra el cáncer y la bioactividad anti-bacteriana. PLoS ONE 9 (1): e84549. doi: 10.1371 /journal.pone.0084549
Editor: Alegría Sturtevant, Universidad del Estado de Louisiana, Estados Unidos de América
Recibido: 31 de julio de 2013; Aceptado: 15 Noviembre 2013; Publicado: 15 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Higginbotham et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por el programa Cooperativo Internacional Grupos de Biodiversidad (ICBG-Panamá http://www.icbg.org/, el número de concesión 2 U01 TW006634-06) y el Colegio de Agricultura y Ciencias Biológicas de la Universidad de Arizona. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de grandes incrementos en el gasto en asistencia sanitaria internacional en los últimos 20 años, las enfermedades transmisibles siguen representando una enorme carga para la salud mundial [1]. enfermedades infecciosas crónicas, como la malaria y diversas enfermedades tropicales desatendidas (NTD) afectan a millones de personas cada año, principalmente mujeres y niños en los países en desarrollo [2]. La rápida propagación de la resistencia a los antibióticos se ha reducido el arsenal disponible para el tratamiento de muchas enfermedades infecciosas, con la reciente aparición de la resistencia pandrug produciendo enfermedades que son recalcitrantes al tratamiento con cualquier fármaco conocido [3]. Al mismo tiempo las enfermedades no transmisibles están aumentando en incidencia en comparación con las enfermedades transmisibles: en el cáncer de 2008 fue responsable de alrededor de 7,8 millones de muertes (alrededor del 13% de todas las muertes en todo el mundo; [4]): perfil
Los productos naturales representan uno de los. la mayoría de las fuentes importantes de nuevos fármacos actuales. Aproximadamente el 50% de todos los medicamentos introducidos entre 1981 y 2006 eran de origen producto natural [5], con otros 34 fármacos a base de productos naturales adicionales lanzados entre 1997 y 2007 [6]. Desde el descubrimiento de la penicilina hace más de 80 años, los hongos han contribuido enormemente al descubrimiento de fármacos producto natural, proporcionando una gran cantidad de medicamentos inestimables, incluyendo los antibióticos β-lactámicos, griseofulvina, ciclosporina, ácido fusídico, lovastatina y [7]. Sin embargo, en los últimos años la tasa de éxito para la bioactividad de los hongos se ha ralentizado, posiblemente señalando el agotamiento inminente de "fruta madura" - los hongos que se accede fácilmente y con frecuencia tales como hongos microscópicos del suelo -. Como fuentes de nuevos metabolitos bioactivos
las estimaciones conservadoras indican que el número total de especies de hongos en la existencia es superior a 5 millones de dólares, sin embargo, se han descrito menos de 100.000 especies de hongos [8], [9]. Esto sugiere que la exploración de nuevos entornos que pueden ser el hogar de los hongos no descrita anteriormente puede ser extremadamente productiva. Por ejemplo, un examen reciente de los hongos endófitos tropicales ha descrito hojas tropicales como un "punto caliente de biodiversidad" [10], [11], [12] que está demostrando ser fructífero como fuente de nuevos compuestos bioactivos (ver [13] para una revisión) .
Gloer [14] propuso que la producción de metabolitos secundarios por los hongos puede estar influenciada por las presiones selectivas impartidas por otros organismos. Esto sugiere que los ambientes en los que existen muchas especies diferentes en las proximidades pueden tener un potencial especial como fuentes de metabolitos bioactivos. Uno de estos es el medio ambiente sin explorar el microbioma hongos asociada con el pelo grueso, similar a la esponja del perezoso de tres dedos (
Bradypus variegatus
), un mamífero arbóreo se encuentra comúnmente en los bosques tropicales de tierras bajas de América Central.
el escudo de perezosos de tres dedos se compone de dos capas distintas: una capa interna de pelo fino, suave cerca de la piel, y una capa externa de pelos gruesos que son ovalada en sección transversal y son aproximadamente 0,4 mm de ancho [ ,,,0],15]. Estos pelos exteriores llevan grietas transversales que son el hogar de una alga verde aparentemente ubicua, con mayor frecuencia de los géneros
Trichophilus
[16]. El alga se cree popularmente para proporcionar camuflaje para perezosos contra el fondo moteado de su hábitat, pero esto no se ha confirmado con los datos. Suutari
et al.
[16] sugiere que las sustancias exopolimérica producidos por el alga pueden fomentar el crecimiento de bacterias beneficiosas. Pereza cabello es comúnmente el hogar de cianobacterias y diatomeas, así como una variedad de macroorganismos (por ejemplo, cucarachas, gusanos redondos, y larvas de la polilla; [16]). Sin embargo, poco se sabe acerca de las comunidades de hongos en el pelo perezoso.
En un esfuerzo por descubrir nuevas fuentes de medicamentos para el tratamiento de las enfermedades transmitidas por vectores, el cáncer y las infecciones bacterianas, se utilizó un enfoque basado en la cultura para examinar las comunidades de hongos asociados con el cabello grueso y exterior de
Bradypus variegatus Hoteles en Panamá. Aquí mostramos el aislamiento de hongos con bioactividad frente a
Trypanosoma cruzi
, el agente causal de la enfermedad de Chagas;
Plasmodium falciparum
, el agente causal de la malaria; la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7; y una serie de bacterias patógenas humanas Gram-negativos y Gram-positivos. Se utilizaron los análisis filogenéticos para identificar estos hongos en un nivel más fino y más robusto que es posible usando métodos típicos de base de datos de coincidencia de solo. Nuestros resultados sugieren que el pelo pereza es una nueva fuente interesante de hongos importantes bioactivos con mucho margen para la exploración de las otras cinco especies de perezosos existentes que se encuentran al otro lado del neotrópico.
Materiales y Métodos
La aprobación para el muestreo de la pereza se obtuvo el pelo del Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) del Instituto de Investigaciones Tropicales Smithsonian y permisos de recolección se obtuvieron a partir de Panamá Autoridad Nacional del Ambiente (ANAM). Una sola muestra de cabellos gruesos exteriores se recogió de alrededor de la parte posterior inferior de cada una de las nueve que viven perezosos de tres dedos encontradas en febrero de 2011 junto Pipeline Road en el Parque Nacional Soberanía, República de Panamá (N 9 ° 9 ', W 79 ° 44' [17]). Las muestras de pelo se colocaron en tubos estériles Falcon mitad llenos de gel de sílice y almacenados a temperatura ambiente hasta su transformación.
Aislamiento y cultivo de hongos
Cada cabello se aclara con agua estéril para eliminar los residuos y sin apretar microorganismos asociados. En condiciones asépticas pelos se cortaron en piezas de aproximadamente 2,5 cm de largo y se colocan en la superficie de agar de dextrosa de patata (PDA) o 2% de agar de extracto de malta (MEA) en placas de Petri estériles. Las placas se sellaron con Parafilm, se incubaron a temperatura ambiente, y se comprueban para el nuevo crecimiento de los hongos al día durante 2 semanas. Las hifas se cortaron asépticamente de cada placa y se transfiere a la cultura axénicos en el mismo medio. Los aislamientos se almacenan como vales de vida a temperatura ambiente (es decir, como los tapones de agar con micelio en agua destilada estéril) y se han archivado en la colección de la International Cooperative Biodiversity Group (ICBG) en el Instituto de Investigaciones Tropicales Smithsonian en Panamá (adhesiones disponible en solicitud)
identificación fúngica
ADN genómico total se extrajo de cultivos frescos de los hongos de acuerdo con Arnold & amp.; Lutzoni [11]. Los espaciadores nucleares ribosomales internos transcritos y 5.8S gen (ITSrDNA) y una parte adyacente de la subunidad ribosómica grande nuclear (LSUrDNA) se amplificaron como un único fragmento utilizando cebadores ITS1F o ITS5 y LR3 siguientes Hoffman
et al.
[18]. Los productos de PCR se visualizaron utilizando SYBR verde después de la electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se sometieron a la Universidad de Arizona Genética Core para la limpieza, la normalización y la secuenciación de Sanger bidireccional. Las secuencias fueron ensambladas de forma automática y bases denominan utilizando
Phred
y
phrap
[19], [20] con la orquestación de Mesquite [21], seguido por la edición manual en Sequencher 4.5 (GeneCodes Corp.) . Las secuencias se compararon con la base de datos NCBI no redundante utilizando BLASTN [22] para estimar la colocación taxonómica y se presentaron al GenBank bajo los números de adhesión. KF746076-KF746159 (Tabla S1).
Debido a la identificación basada sólo en BLAST partidos deben ser tratados con precaución (por ejemplo, [23]) que utiliza análisis filogenético para proporcionar la inferencia más fuerte con respecto a la afiliación taxonómica. Los datos de secuencia de 84 aislados fúngicos se cargaron como un grupo en Mesquite [21] y alineados por el músculo [24]. La alineación resultante, que identifica grupos de secuencias fácilmente alineables, era inadecuado para un solo análisis filogenético debido a la prevalencia de las regiones ambiguas y unalignable. Las secuencias que alineados coherentemente entre sí se dividieron en grupos de cepas estrechamente relacionadas parecer. grupos resultantes se analizaron a continuación como conjuntos de datos separados como sigue: Todas las secuencias de cada grupo se compararon con la base de datos NCBI utilizando BLASTN. Las 50 mejores éxitos para cada secuencia se descargan y se filtra para eliminar (1) secuencias redundantes, y (2) las secuencias de potencialmente erróneas identificadas las cepas y especímenes unvouchered (ver [23]). Al menos una secuencia de una colección de cultivos fiable se incluyó en cada conjunto de datos, y uno o dos grupos externos se selecciona de especies estrechamente relacionadas con las secuencias mencionadas en el conjunto de datos (elegido por revisión de la literatura).
Cada conjunto de datos resultante fue alineado por separado en el músculo. Secuencias en cada alineación se recortaron a los puntos de inicio y final del consistentes, y la calidad de alineación fue verificado por inspección visual en Mesquite. Todas las alineaciones fueron sometidos a TreeBASE (http://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S14945). Modelos de evolución se infiere utilizando jModeltest [25], [26]. Los árboles filogenéticos se infiere por máxima verosimilitud en Garli [27], con el apoyo determinado por 100 repeticiones de arranque implementado en el portal web CIPRES [28], y el uso de métodos bayesianos en MrBayes (se accede a través CIPRES [28]). Para esto último, los análisis consistió en 5 millones de generaciones, con cuatro cadenas, a partir de árboles al azar, y el muestreo de cada árbol 1000a. Exhaustividad se evaluó sobre la base de los valores asíntotas de li-ln y evaluación de las desviaciones estándar de división de frecuencias. Posterior probabilidades proporcionan valores por inferencia independientes para apoyar las relaciones topológicas y valores asociados de apoyo de los análisis de máxima verosimilitud. Los resultados de cada análisis filogenético se compararon con la literatura existente para cada grupo taxonómico para asegurar que las relaciones de los taxones conocidos eran apropiados, proporcionando así la confianza en lo que respecta a nuestra colocación de hongos pelo perezoso.
Preparación de extractos de hongos
un tapón de agar único de cada cepa seleccionada para el análisis adicional se transfirió en condiciones estériles a una placa fresca de 2% de MEA y se incubaron en la mesa de trabajo a temperatura ambiente hasta aproximadamente 50% de la placa se cubrió con el crecimiento del micelio. Quince tapones de agar (cada uno de 5 mm de diámetro) se cortaron con un perforador de corcho estéril en condiciones estériles y se transfirieron a matraces que contenían 37 ml de caldo de extracto de malta 2% (MEB). Los matraces se incubaron en un agitador orbital (28 ° C, 125 rpm) durante 2 semanas.
Los cultivos líquidos se mezclaron con un volumen igual de acetato de etilo y se mezcla durante 2 minutos a 9000 rpm con un Polytron (Lauda- Brinkmann, Delran, Nueva Jersey, EE.UU.). biomasa fúngica se eliminó por filtración a vacío a través de papel de filtro Whatman (# 1) y el filtrado se extrajo dos veces con un volumen 1:01 de acetato de etilo. La capa acuosa se desechó y la capa orgánica se secó y se almacenó a -80 ° C.
bioensayos
extractos orgánicos crudos de cultivos de hongos se utilizaron en bioensayos contra cepas focales de los agentes causales de la malaria (
Plasmodium falciparum
) y la enfermedad de Chagas (
Trypanosoma cruzi
), y contra la línea celular de cáncer de mama MCF-7, según lo descrito por Higginbotham
et al
. [29]. La bioactividad de los extractos, que se diluyeron en DMSO (10 mg /ml), se midió como la inhibición del crecimiento por ciento (% IG) en comparación con el control negativo (DMSO sin extracto; 0% IG).
BioMAP
análisis
una pantalla de perfil de actividad antibiótica, BioMAP (anti
bio
tic
m
oda de
a
cción
p
ERFIL; [30]), se utilizó para probar la actividad de 50 extractos orgánicos crudos contra 15 bacterias patógenas humanas. Extractos con potente bioactividad se diluyeron en serie (16 diluciones de 2 veces) y re-examinados contra el mismo panel de bacterias. Las curvas de crecimiento se representaron mediante el registro de DO
600 valores cada hora durante 24 horas y concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) se calcularon posteriormente para cada extracto. Para establecer perfiles de bioactividad independiente de la concentración para cada extracto, valores de MIC primas se normalizaron que resulta en un rango de valores de 0 (inactivo) a 1 (más bioactivo). Estos perfiles de actividad fueron comparados con los perfiles de los antibióticos conocidos pertenecientes a todas las principales clases estructurales. Este método es eficaz en la predicción de la clase estructural de compuestos antibióticos desconocidos a partir de mezclas complejas o crudos [30].
Resultados y Discusión
Un total de 84 aislamientos de hongos fue examinado desde el exterior del cabello grueso de nueve individuos que viven del perezoso de tres dedos (
Bradypus variegatus
) encontraron a lo largo de la tubería Road en el Parque Nacional Soberanía, República de Panamá. Las muestras de pelo se transportaron al laboratorio en tubos estériles Falcon que había sido medio llena de gel de sílice, un desecante que es eficaz para el almacenamiento de tejido fúngico [31], [32]. Cada pieza de pelo perezoso colocado en agar produjo múltiples cepas de hongos que representan una variedad de morfotipos. Los análisis filogenéticos de las cepas axénicas revelaron un grupo diverso de hongos, algunos de los cuales parecen ser nueva con respecto a los taxones previamente observada o secuenciado (Tabla 1; Figura 1). Muchas de estas cepas muestran bioactividad
in vitro
contra los parásitos que causan la malaria y la enfermedad de Chagas, las células de cáncer de mama, y las bacterias patógenas humanas tanto Gram-positivos y Gram-negativos (Tabla 2, Tabla 3).
Topología de cada árbol refleja el análisis de ML y los valores superiores indican los valores de LD ramas de arranque y posterior probabilidades bayesianas (& gt; 0,50 y & gt; 0,75, respectivamente). Grupos externos y taxón de muestreo para cada árbol ha sido validado en estudios de la literatura (véase métodos). conclusiones taxonómicas se presentan en la Tabla 1. La Figura 1 (A): La colocación de F5073 en el grupo 17; (B) F4847 en el grupo 18; (C) F4831a en el grupo 19; (D) F4819 en el grupo 20; (E) F4801 en el grupo 5; (F) F4806 en el grupo 7; (G) F4886 en el grupo 8; (H) F5071 en el grupo 15; (I) F4812-F4816, F4830, F4831, F4845, F4852-F4856, F4860, F4873, F4882, F4883 y F4900-F4902 en el grupo 1; (J) F4803, F4817, F4820, F4823, F4824, F4826, F4827, F4829, F4837, F4841, F4842, F4846, F4848, F4857, F4858, F4861, F4862, F4870, F4872, F4875, F4878, F4879, F4894-F4896 , F4908, F4909, F5069 y F5074 en el grupo 2; (K) F4818 y F4839 en el grupo 10; (L) F4877, F4890 y F4897 en el grupo 11; (M) F4828 y F4898 en el grupo 12; (N) F4876 y F4881 en el grupo 13; (O) F4863 y F4884 en el grupo 6; (P) F4821, F4874, F4889 y F4913 en el grupo 3; (Q) F4802, F4807, F4825, F4844, F4906 y F5068 en el grupo 4; (R) F4850 y F4891 en el grupo 9; (S) F4904 y F4905 en el grupo 14; y (T) F5070 y F5072 en el grupo 16.
Análisis filogenéticos
El 84 aislamientos de hongos representa 28 unidades taxonómicas operacionales (UTO), basado en 95% de similitud de secuencia (Tabla 1). Los dos más abundante UOT representado 34 (40,5%) de los aislados. Las 50 cepas restantes fueron representados por 26 Otus distinta.
BLAST comparaciones con GenBank faciliten estimaciones preliminares de la colocación taxonómica y similitud con hongos previamente secuenciados (Tabla 1). Todas las cepas fueron Ascomycota. Catorce aislamientos tenido un partido de arriba a clones fugal incultos y 23 tenían un fósforo superior a los hongos cultivados, pero no identificados. Los 47 aislamientos restantes tuvieron coincidencias con las cepas con nombre que tentativamente sugieren la colocación en el Sordariomycetes (Xylariales, Glomerellales, Hypocreales), Dothideomycetes (Botryosphaeriales y Pleosporales), y Eurotiomycetes (Eurotiales). Para determinar con más confianza la colocación taxonómica, las secuencias se analizaron mediante máxima verosimilitud y métodos bayesianos
Las secuencias que alinean bien el uno al otro se repartió en grupos para crear 20 grupos de especies aparentemente similares (Tabla 1, Figura 1).. Un grupo contenía 29 secuencias de hongos perezoso de pelo, un grupo contenían 20 secuencias, y los 18 grupos restantes contenidas entre 1 y 6 secuencias de cada uno. Entre 34 y 165 secuencias de taxones estrechamente relacionados fueron compilados para cada grupo para que no redundante de datos a la que uno o dos grupos externos apropiadas se agregan según la revisión de literatura.
Tras los análisis filogenéticos, las identidades de alto nivel (clase, orden, familia) podría ser asignado con confianza al 82 hongos que representan a 15 familias y 10 órdenes (Tabla 1; Figura 1). La mayoría (81,7%) de estos fueron Sordariomycetes. Los hongos de esta clase son fuentes de metabolitos bioactivos bien documentados (por ejemplo, [33], [34]). Los aislamientos restantes eran Dothideomycetes (15,9%) y Eurotiomycetes (2,4%)
Ochenta aislamientos confianza podrían ser asignados a 15 géneros (Tabla 1; Figura 1).. Dos cepas se les dio colocaciones filogenéticos más tentativas. F4886 (Figura 1 (G)) se identificó como
Robillarda
sp. o como un miembro de un género estrechamente relacionado en el Amphisphaeriaceae. Aislar F4831a (Figura 1 (C)) se identificó como miembro de
Paraconiothyrium
sp. o un género dentro de la Montagnulaceae estrechamente relacionados. Los géneros dos más comunes,
Pestalotiopsis
sp. y
Hypocrea
sp., se aislaron de 7 de 9 y 5 de 9 muestras de cabello de perezoso, respectivamente.
Aislar F4891 (Figura 1 (R)) no parecen estar estrechamente relacionados con cualquier secuencias en GenBank nombrado y sólo pudieron ser identificados como posiblemente un miembro de la orden Pleosporales (Dothideomycetes). Aislar F4850 (Figura 1 (R)) tenía 96% de similitud de secuencia a su valor más cercano de GenBank, un clon de hongo del suelo uncultured (Tabla 1; [35]). Los análisis posteriores están garantizados con el fin de confirmar si los aislados F4891 y F4850 son nuevas especies de hongos. En general, las identificaciones asignadas por análisis filogenéticos de cerca coincidían con las de la parte superior BLAST hits para cada aislamiento (Tabla 1).
bioactividad de pelo perezoso
aísla
hongos pelo de la pereza que se cultivaron en medio líquido y se extrajo con acetato de etilo se ensayó la bioactividad. Se consideró que los extractos de ser altamente bioactivo si causaban una inhibición de al menos 50% del crecimiento (es decir, ≥50% IG) de parásitos o células cancerosas
in vitro
.
En general, dos de 70 (2,5%) los extractos ensayados fueron altamente activos frente a
P. falciparum
, ocho de los 62 (12,9%) extractos probados eran muy activos frente a
T. cruzi
, y 15 de 73 (20,6%) extractos probados fueron altamente activo contra el cáncer de mama línea celular MCF-7 (Tabla 2). La mayoría de los extractos con la bioactividad fueron activos en un solo ensayo (Tabla 2). cepas bioactivos se aislaron con igual frecuencia en MEA y PDA (Tabla 2). Cabe destacar que, a menudo estrechamente relacionados aislados diferían en bioactividad: por ejemplo, tres de los 20 aislamientos identificados como
Hypocrea
sp. (Tabla 1) tenía bioactividad sólo contra MCF-7 células de cáncer de mama; tres eran activos contra células MCF-7 de cáncer de mama y
T. cruzi
(Tabla 2); y uno era activa sólo contra
S resistente a la meticilina. aureus gratis (Tabla 3).
De los 16 hongos que tenían IG alto% en por lo menos un
in vitro
ensayo, 13 pertenecían a la Hypocreales (Hypocreaceae, Bionectriaceae y Nectriaceae) . Los tres hongos restantes pertenecían a la Valsaceae (Diaporthales), Amphisphaeriaceae (Xylariales) y Trichocomaceae (Eurotiales). Contra la malaria y las actividades contra el cáncer han sido previamente reportados en la literatura de estos linajes de hongos relativamente bien estudiados (por ejemplo, [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]). Sin embargo, nuestros resultados representan, a lo mejor de nuestro conocimiento, los primeros informes de actividad anti-trypanosomal en
Cytospora gratis (Valsaceae) y
Bionectria gratis (Bionectriaceae).
La número de cepas altamente bioactivo contra
T. cruzi gratis (Tabla 2) es de particular interés ya que tan pocas veces encontramos microbios con bioactividad en este ensayo: sólo 104 de 2.698 hongos endófitos (3,9%) a partir de la colección de la cultura en general son altamente bioactivo contra ese parásito [29]. Actualmente los únicos tratamientos disponibles para esta enfermedad son nitrofurane y benznidazol, ambos de los cuales están asociados con tales efectos secundarios tóxicos que el tratamiento es a menudo abandonado [44].
De los 50 extractos de hongos seleccionados por BioMAP, 20 eran bioactivo contra al menos un organismo de ensayo (Tabla 3). La mayoría de los aislados (16 de 20) activo contra las bacterias en el ensayo de BioMAP pertenecían a las familias Lasiosphaeriaceae (Sordariales), Glomerellaceae (Glomerellales), Valsaceae (Diaporthales), Botryosphaeriaceae (Botryosphaeriales), y Amphisphaeriaceae (Xylariales). Los cuatro hongos restantes pertenecían a la Nectriaceae, Bionectriaceae y Hypocreaceae (Hypocreales). La actividad frente a bacterias Gram-positivas fue detectado con más frecuencia que contra las bacterias Gram-negativas (Tabla 3)
Cinco aislamientos (
Colletotrichum sp
F4806 (Figura 1 (F));..
Cytospora
sp 1, cepa F4818 (Figura 1 (K));.
Fusarium sp
1, cepa F4898 (Figura 1 (M));.
Lasiodiplodia
sp. 1, la cepa F4807 (Figura 1 (Q)), y
Lasiodiplodia
sp 1, F4844 cepa (Figura 1 (Q)) tenía particularmente potente actividad en el ensayo BioMAP y se seleccionaron para la prueba adicional se diluyeron en serie.. extractos fueron re-analizó la actividad contra el panel de 15 bacterias y los perfiles de bioactividad fueron construidos utilizando valores de MIC normalizados (Tabla 4).
el extracto de
Lasiodiplodia
sp. 1 ( F4807 cepa) fue de particular interés ya que tenía una actividad potente y específico contra bacterias Gram-negativas (Tabla 4). el perfil de bioactividad del aislado no coincide con la de cualquiera de las clases de antibióticos conocidos previamente probados en el ensayo de BioMAP, lo que sugiere una potencialmente nuevo modo de acción (ver [30]). Las infecciones causadas por bacterias (MDR) Gram-negativas resistentes a múltiples fármacos emergentes se están convirtiendo en un problema clínico importante en todo el mundo [45]. Estas infecciones más comúnmente incluyen MDR
Pseudomonas aeruginosa
, de espectro extendido enterobacterias productoras de β-lactamasa, y MDR
Acinetobacter baumannii
[46]. Los datos recientes sugieren que las infecciones trazadas a
Staphylococcus aureus aislados
torrente sanguíneo están en declive, pero que las infecciones por
Escherichia coli
, las especies Gram-negativas más comunes responsables de las infecciones en los aislados de sangre humana, son aumento de la frecuencia [47]. En ese informe [47] También se destaca la escasez de agentes antibacterianos en fase de desarrollo para las bacterias Gram-negativas, con más esfuerzo que se centra en el SARM Gram-positivas. El aumento de la prevalencia de microorganismos resistentes a múltiples fármacos se debe principalmente al uso excesivo de antibióticos de amplio espectro y mala administración de antibióticos [48]. Por lo tanto la especificidad del extracto de F4807 cepa para las cepas Gram-negativas es muy valiosa y vale la pena para su posterior análisis.
hongos aislados en este estudio fueron taxonómicamente consistente con grupos de hongos sabe que se producen en el suelo y en las plantas como patógenos, saprotrophs, o endófitos [11], [49]. Los perezosos pueden encontrarse con este tipo de hongos a propósito de spora aire o por contacto directo cuando descienden de los árboles con el fin de hacer sus necesidades fisiológicas, momento en el que cavar un agujero en el suelo que posteriormente se cubren con la hojarasca [50]. Sorprendentemente, la comparación con una gran colección de endófitos de las plantas terrestres en Panamá ([29]; 1269 cepas) reveló que las secuencias de 29 aislamientos de pelo pereza eran idénticos a cepas obtenidas de plantas (100% de similitud sobre la secuencia de longitud completa). Así, este estudio amplía el espectro de hospedadores conocidos y el modo ecológico de los endófitos putativos. Algunos de estos hongos pueden afiliarse directamente con el alga verde que habita en el pelo grueso de los perezosos, al igual asociado hongos endolichenic con algas verdes en los talos de liquen y con frecuencia son taxonómicamente similar a los endófitos en los mismos ambientes [51], [52].
los roles potenciales de estos hongos en la salud de los perezosos no han sido investigados. Xavier Araújo
et al
. [50] informó de infecciones fúngicas en
B. variegatus
causada por el hongo patógeno
Microsporum gratis (que también causa la dermatitis en los seres humanos [53]), pero este género no fue recuperado en el presente estudio o en el trabajo previo de Suutari
y col
. [dieciséis]. En contraste con el microbioma humano, donde los hongos comprenden & lt; 0,01% de communites microbianos en las superficies externas, tales como la piel [54], Suutari
et al
. [16] informó de que los hongos representaron el 8% de la flora en las encuestas de microbios perezoso de pelo. La gran abundancia y diversidad de hongos asociados con el pelo pereza, junto con su bioactividad, pueden hablar con una importancia biológica de los perezosos que aún no se ha explorado.
La necesidad urgente de nuevos medicamentos continúa representando uno de los mayores desafíos de la humanidad . Comúnmente se acordó que la gran mayoría de los microbios bioactivos aún no se han descubierto [9] y taxones microbianos recién descubiertos tienen una importante promesa de la nueva química. Abundante evidencia apunta a nuevos entornos como fuentes prometedoras de microorganismos que aún no descritas [55]. Aquí hemos demostrado que el pelo del perezoso de tres dedos (
Bradypus variegatus
) en Panamá es una fuente rica de diversos hongos bioactivos. Las cepas aisladas aquí incluidos los miembros de algunos linajes bien estudiados (por ejemplo, Hypocreales; Pleosporales), sino también los miembros de poco estudiada o potencialmente nuevos grupos (por ejemplo,
Endomelanconiopsis
sp F4801;.
Robillarda
sp . F4886; Ascomycota sp F4891;.. Ascomycota sp F4850). Anticipamos que la novela adicional taxones se puede conocer en la pereza de pelo mediante la ampliación de los métodos de estudio a diversos tipos de medios de comunicación y el uso de métodos de alto rendimiento para evaluar la composición de la comunidad. También anticipamos que los diferentes taxones se puede aislar de perezosos en otras regiones, tanto como las comunidades de hongos endófitos en plantas tropicales difieren notablemente a escala regional [56], [57]. Así, nuestro trabajo sugiere que la exploración fructífera de la microbiota pereza se justifica para aplicaciones potenciales en el descubrimiento de fármacos.
Apoyo a la Información sobre Table S1. ID hongo cabello y los números de acceso de GenBank
pereza
doi: 10.1371. /Journal.pone.0084549.s001 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Agradecemos a Bryson para Voirin colección de muestras de cabello pereza. Agradecemos a Phyllis D. Coley, Thomas A. Kursar, Meg Crofoot y Santosh Jagadeeshan útil para los comentarios y otras ayudas, y Malkanthi Gunatilaka y Jakob criba para el análisis de secuencias. Agradecemos al gobierno de Panamá y, en particular, el personal de de Panamá Autoridad Nacional del Ambiente (ANAM), para facilitar esta investigación. Agradecemos al Instituto de Investigaciones Tropicales Smithsonian (STRI) para soportar todos los aspectos logísticos de este trabajo y los muchos estudiantes y asistentes que contribuyeron a este cuerpo de investigación.