Extracto
La sobreexpresión del canal permeable a los cationes TRPM8 en los cánceres de próstata podría representar un nuevo oportunidad para su tratamiento. Los inhibidores de la TRPM8 reducen el crecimiento de células de cáncer de próstata. Hemos utilizado dos bloqueadores recientemente descrita y altamente específicos, AmtB y JNJ41876666, y RNAi para determinar la relevancia de expresión TRPM8 en la proliferación de células no tumorales y tumorales. La inhibición de la expresión o función del canal reduce las tasas de proliferación y la fracción proliferativa en todas las células tumorales ensayadas, pero no de células de la próstata no tumorales. No hemos observado una aceleración constante de crecimiento después de la estimulación del canal con mentol o icilin, lo que indica que la expresión basal TRPM8 es suficiente para sostener el crecimiento de células de cáncer de próstata
Visto:. Valero ML, Mello de Queiroz M, W Stühmer , Viana M, Pardo LA (2012) Los canales de iones TRPM8 diferencialmente modular la proliferación y el ciclo celular Distribución de células normales y cancerosas de la próstata. PLoS ONE 7 (12): e51825. doi: 10.1371 /journal.pone.0051825
Editor: Alexander A. Mongin, Albany Medical College, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Julio, 2012; Aceptado: 6 de Noviembre de 2012; Publicado: December 14, 2012
Derechos de Autor © 2012 Valero et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiado por la Sociedad Max-Planck y subvenciones SAF2010-14990 y PROMETEO2010-046 de FV. MV fue el beneficiario de una beca predoctoral del Gobierno español (F.P.I). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
TRPM8 es un canal de calcio-permeable, no selectivo de cationes del potencial receptor transitorio superfamilia [1], se requiere para la transducción de las bajas temperaturas moderadas [2], [3]. La presencia de TRPM8 en las neuronas de pequeño diámetro con el frío de respuesta en ganglios de la raíz dorsal y los ganglios del trigémino y el fenotipo detectado en TRPM8 - /- ratones knockout apoya un papel de TRPM8 en thermosensation y nocicepción [4] - [6]. canales TRPM8 se han clonado a partir de especies en diferentes géneros, de anfibios para los seres humanos [7]. TRPM8 humana se identificó inicialmente durante una pantalla para genes regulados en el cáncer de próstata (y por tanto denominados trp-P8 [8] pero más tarde detectado en otros tipos de tumores [9], [10]. Entre los tejidos normales, la expresión del canal es muy restringida a una subpoblación de neuronas sensoriales primarias [2], [3], pero también está presente en el sistema reproductor masculino en cantidades significativas [2], [3], [8], [9], [11], [12]
la activación de endógeno (es decir, neuronal) o canales TRPM8 recombinantes da lugar a una corriente de firma que se caracteriza por la rectificación hacia el exterior y dependiente de la tensión extrema gating [13] -.. [15] canales TRPM8 se puede activar por los agonistas específicos y selectivos, ya sean naturales (como el eucalipto y mentol) o compuestos sintéticos como el super icilin agente de refrigeración, que es hasta ahora el más potente agonista de TRPM8 [2], [3], [16] - [19] . Otros agonistas (linalol, geraniol, entre otros) se identificaron por selección de derivados de mentol o compuestos odorantes. en particular, geraniol podría ser un activador fisiológico de TRPM8 porque es un intermedio durante la síntesis de colesterol y que induce la proliferación en el epitelio de la próstata. Todos los agonistas TRPM8 conocidos inducen un efecto de enfriamiento, lo que refuerza la idea de un papel de TRPM8 en la percepción de frío [20].
TRPM8 mRNA se ha detectado en las células malignas, y esto ha sido ampliamente estudiado en el cáncer de próstata. TRPM8 mRNA fue altamente sobreexpresado en los tumores de próstata temprano bien diferenciados. En un modelo típico para el cáncer de próstata dependiente de andrógenos (células LNCaP; células apicales epiteliales con un fenotipo secretor) se detectó la expresión tanto en la membrana plasmática y retículo endoplasmático, donde podría actuar como Ca
2 + canal de liberación de [ ,,,0],18], [19], [21] - [23]. Plasma TRPM8 membrana podría ejercer un efecto protector, ya que la activación de TRPM8 por PSA (antígeno prostático específico) reducción de la motilidad celular en células PC3 [24].
TRPM8 podría ser un marcador útil para el resultado del cáncer de próstata, ya que la pérdida de TRPM8 expresión parece estar asociada a la transición a la independencia de andrógenos y de mal pronóstico [19], [21], [25]. Esto podría reflejar el efecto de los andrógenos sobre la expresión TRPM8, ya que el gen muestra diez putativo elementos sensibles a los andrógenos [18]. Los niveles anormales de TRPM8 mRNA también pueden ser indicativos de la enfermedad metastásica [26]
.
función del canal Canonical TRPM8 puede ser bloqueado por compuestos de urea (véase más adelante), que también se sabe que inhiben TRPV1 [17], [25 ], [27]. Esto limita el uso de tales bloqueantes en el estudio del papel de TRPM8 en el cáncer de próstata debido a que las células expresan también TRPV1 [28]. En la actualidad, la única manera factible para diseccionar específicamente el papel de la canal en el cáncer de próstata es el uso de siRNA. La interferencia de ARN puede producir un golpe eficaz y específica hacia abajo de un gen en particular
in vivo
y
in vitro
[29], [30].
En este estudio hemos examinado los efectos que TRPM8 silenciamiento tiene sobre la supervivencia celular y la proliferación de células de tres líneas de células de próstata humana, LNCaP, PC3 y DU145. LNCaP es fuertemente dependiente de andrógenos [19] mientras DU145 es independiente de andrógenos [31] y PC3 representaría un estado intermedio [32]. También se estudió el comportamiento a este respecto de una línea celular de próstata no tumoral (SV40 inmortalizado), PNT1A [33]. La inhibición de la expresión o función de las tasas de proliferación reducida del canal y la fracción proliferativa en todas las células tumorales probadas, pero no de células de la próstata no tumorales.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
líneas celulares de próstata derivadas de PNT1A (ECACC 95012614), LNCaP (DSMZ ACC 256), PC3 (DSMZ ACC 465) y DU145 (DSMZ ACC 261) se obtuvieron de DSMZ (Braunschweig, Alemania) o ECACC (Salisbury, Reino Unido) . Cada línea se propagó y se mantuvo de acuerdo con las instrucciones del proveedor correspondiente. Identidad de líneas de células tumorales se confirmó mediante la expresión de marcadores específicos (PC3 AR, ER +, + ERβ, PSA-, DD3-; DU145 AR-, ERα-, ERβ +, PSA-, DD3-; LNCaP AR +, ERα- , ERβ +, + PSA, DD3 +;. Paul Thelen, Departamento de Urología del hospital Universitario de Göttingen)
siRNA transfecciones
la transfección con ARNip (25 nM) se realizó utilizando Lipofectamine 2000 o Lipofectamine RNAiMAX reactivos en medio OptiMEM (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) 24 horas después de la siembra. Cuatro diferentes siRNAs fueron diseñados para apuntar canal hTRPM8 usando el HiPerformance siRNA diseño de algoritmos (Qiagen). Se utilizaron las siguientes secuencias (NM_024080) hTRPM8: TRPM8.1, tcgaatgttctcacctattaa; TRPM8.2, aaggttagattccaataaata; TRPM8.3, cagaatgttatcatactacat y TRPM8.4, ccgggacgagatggacataga.
Todos los siRNAs fueron sintetizados por Qiagen (Hilden, Alemania), con excepción del control negativo comercial#1 y lo humano GAPDH ARNsi (Ambion, Darmstadt, Alemania), que utilizamos como controles negativo y positivo, respectivamente. Las células se incubaron con el siRNA y el reactivo de transfección durante 6 h y se recogieron para los experimentos justo después del final de la transfección. Además, las células tratadas solamente con OptiMEM y el reactivo de transfección correspondiente se incluyeron como controles.
qPCR
ARN total obtenido a partir de cultivos utilizando RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania) se sometió a transcripción inversa ( superíndice, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) con oligo-dT y genes primers específicos para hTRPM8 (5'-cttgggcaaaacacacaatg-3 '). PCR en tiempo real se realizó en la plantilla utilizando el sistema TaqMan en un 7700 Detector AbiPrism secuencia (Applied Biosystems, Foster City, CA) o un LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Alemania). Los siguientes fragmentos se amplificaron: NT 2.910-3.058 de la secuencia de NM_024080.4 se detectó con la sonda hTRPM8 (5'-FAM-tcgccatgtttggctacacggtgggcacc-TAMRA-3 ') y nt 1632 a 1732 de la secuencia NM_003234 se detectó con la sonda HTFR (5 '-Joe-tgaatggctagagggatacctttcgtccc- (6-TAMRA) 3'). El receptor de transferrina humano se utilizó como una plantilla de control para la integridad del ARN y el rendimiento de la PCR. cuantificación relativa se realizó utilizando el software REST (Herramienta de software Expresión relativa; [34], [35])
Citometría de Flujo
siRNA: Después del tratamiento con siRNA, las células se sembraron en 6-. placas de pocillos y se incubaron durante 24-120 horas antes de las mediciones. Las células se trataron con tripsina, se lavaron dos veces con PBS y posteriormente se mantuvieron en hielo. Para las mediciones del ciclo celular, las células se incubaron con 50 mg /ml de yoduro de propidio (PI), 0,3% de saponina y 100 U /ml de RNasa. Para medidas de viabilidad, las células no viables se detectaron por tinción con 10 g PI /ml en PBS. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo BD FACSAria (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). yoduro de propidio se excitó a 488 nm, y se recogió la fluorescencia utilizando un espejo dicroico 595 nm y 610/20 filtro de paso de banda nm (para el ciclo celular) o 655 nm espejo dicroico y 695/40 filtro de paso de banda nm (para la viabilidad) . Puertas de células viables fueron establecidos por las fases de dispersión del ciclo celular y salida anterior y laterales se determinaron utilizando el software FlowJo (Árbol Star Inc., Ashland, EE.UU.). Por otra parte, el porcentaje de células viables se determinó directamente por la exclusión PI
.
Para los experimentos en presencia de mentol y icilin, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 a 168 h con 125-300 M mentol o 10 mM icilin antes de las mediciones. Las células se trataron con tripsina, y se lavaron dos veces con PBS. Las muestras se trataron y analizaron para las mediciones del ciclo celular y viabilidad como se ha descrito antes.
Imagen de calcio
El calcio experimentos de imagen se llevaron a cabo con el indicador fluorescente Fura-2. Antes de cada experimento, las células se incubaron con 5 M acetoximetiléster forma de Fura-2 (Fura-2AM; Invitrogen) durante 45 min a 37 ° C. Después de esto, se añadió 250 mM de sulfinpirazona durante otros 20 minutos con el fin de bloquear el transportador de aniones que deteriora la carga con Fura-2AM en las líneas de células cancerosas. Las medidas de fluorescencia se realizaron en un microscopio invertido Leica (Nussloch, Alemania) DM IRE2 equipado con una de 12 bits cámara CCD refrigerada (Imago QE Sensicam; HASTA Fotónica, Graefelfing Alemania). Fura2 se excitó a 340 y 380 nm con un monocromador de policromo IV (TILL Fotónica) y la fluorescencia emitida se filtró a través de un filtro de paso largo nm 510. proporciones calibradas se muestran en la línea a 0,5 Hz usando HASTA Visión versión de software 4.01 (HASTA Fotónica). Los experimentos de imagen de calcio se llevaron a cabo simultáneamente con registros de temperatura. La solución del baño, conocido como 'solución de control', contenida (mM): NaCl 140, KCl 3, CaCl
2 2,4, MgCl
2 1.3, Hepes 10 y glucosa 10, y se ajustó a pH 7,4 con NaOH.
Ensayos de proliferación
la proliferación se estima en base a la capacidad de las células metabólicamente activas para reducir las sales de tetrazolio a formazan coloreado (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-difeniltetrazolio bromuro, MTT; Sigma-Aldrich). Las células se trataron con tripsina y se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo plano a densidades que van desde 2000 a 5000 células /pocillo dependiendo de la línea celular examinada. Para determinar la actividad metabólica, se añadieron 10 l de reactivo MTT a cada pocillo y se incubaron durante 4 h. La absorbancia de la formazan producida se determinó en un lector de placas Victor2 (Wallac) usando 570 nm y 630 nm de excitación filtros. Para los experimentos con el mentol, el medio se renueva cada 48 h tanto en los pozos de prueba y control
Curación de Heridas Ensayo
Las células se cultivaron primero hasta la confluencia (& gt; 90%). En 6- platos así. a continuación, un área pequeña se vio interrumpido por el rascado de la monocapa con una punta de pipeta de plástico de 1.000 l. Posteriormente, las células fueron cultivadas durante 12, 24 o 48 h bajo diferentes condiciones experimentales: sérico bajo o bien vehículo o medio que contiene el fármaco. Las células se inspeccionaron microscópicamente con el tiempo. El área de la herida restante se calculó utilizando el software CorelDraw y la distancia de migración de las células se estimó sobre la base de que el cálculo
Medicamentos
4- (3-cloro-piridin-2-ilo). - ácido (4-terbutil-fenil) -amida piperazina-1-carboxílico (CTCB) fue un generoso regalo de Grünenthal AG (Aquisgrán, Alemania). [L-arginil] - [N- [2,4-diclorofenetil] glicil] -N- (2,4-diclorofenetil) glicinamida (DD01050; (H-Arg-15-15 C en [36]), fue un regalo de Dr. A. Ferrer-Montiel (Universidad Miguel Hernández, España) AMTB (N- (3-aminopropil) -2 -. [(3-metilfenil) metoxi] -N- (2-tienilmetil) benzamida (1: 1) hiclato) una novela, altamente selectivo antagonista de TRPM8 es un generoso regalo del Dr. Stuart Bevan (Kings College, Londres) JNJ41876666 (compuesto 5 en la referencia [37].; 3-[7-Trifluoromethyl-5-(2-trifluoromethyl-phenyl)-1
H-
benzimidazol-2-yl]-1-oxa-2-aza-spiro[4.5]dec-2-ene Clorhidrato,), un antagonista potente TRPM8, fue un generoso regalo de Janssen Investigación & amp;.. Development, LLC (Spring House, PA) La figura 1 muestra las estructuras químicas de los fármacos utilizados
Estadística. Análisis
los datos se presentan como media ± SEM obtenida de al menos tres experimentos independientes la significación estadística se evaluó mediante la prueba de la t de Student valores de p se indican en las figuras por asteriscos cerca de la columna o símbolo correspondiente * p & lt...; 0,05; ** p & lt; 0,01; *** p & lt;. 0.005
Resultados
Detección de expresión TRPM8 en las líneas celulares de próstata y la próstata
expresión TRPM8 es más abundante en el tejido nervioso y el sistema reproductor masculino. estudios previos describen la sobreexpresión de TRPM8 en los tumores de próstata y las líneas celulares derivadas de cáncer de próstata, específicamente LNCaP [8]. Otras líneas celulares se encontraron negativo en esos informes. Más recientemente, se informó de células PC3 débilmente positiva por Western blot [21]. Hemos establecido para determinar los niveles de expresión de TRPM8 en las células de cáncer de próstata LNCaP, PC3 y DU145 y la línea celular no tumoral PNT1A por diferentes enfoques para ampliar y complementar los resultados reportados antes [38].
en primer lugar, el contenido TRPM8 ARNm se determinó mediante transcripción inversa-PCR en tiempo real (qRT-PCR) usando sondas TaqMan en el cerebro humano normal, de próstata, y las líneas celulares LNCaP, PC3, DU145 (derivado de tumores) y PNT1A (inmortalizado línea celular de próstata no transformado). La integridad del ARN y la transcripción inversa se controlaron usando el receptor de transferrina humana como referencia para la normalización. mRNA para TRPM8 se detectó en el cerebro y próstata, con niveles máximos en la salud de la próstata (no se muestra). El mensaje también se detectó en todas las líneas celulares humanas analizadas, LNCaP, PC3, DU145 y PNT1A. Como se informó anteriormente, los niveles de la línea de PNTA1 no tumoral fueron significativamente más bajos que en las líneas celulares de cáncer. La cantidad relativa de mensaje TRPM8 era DU145≈LNCaP & gt; PC3 & gt; PNT1A
A (Fig 2A.).. la abundancia de ARNm se determinó por PCR en tiempo real en ADNc derivado de ARN a partir de la fuente indicada. El receptor de transferrina humano se utilizó como gen de mantenimiento de referencia. la abundancia de ARN se expresa como valores normalizados más de PNT1A. Los asteriscos indican la significación estadística con respecto al PNT1A. ANTES DE CRISTO. DU145 células responden al frío y mentol. B. Transmisión (izquierda) y pseudocolor radiométrica [Ca
2 +]
i imágenes que muestran un ejemplo de la respuesta de las células DU145 al frío (18 ° C) y mentol 500 mM. C. [Ca
2 +]
i respuestas de un frío y mentol celular sensible (C1) en comparación con una, célula DU145 mentol y minúsculas-frío insensible (C2). D-F. Respuesta al frío se ve disminuida por TRPM8 caída en las células DU145. Pseudocolor radiométrica [Ca
2 +]
i imágenes en las células transfectadas con siRNA control (D) o con TRPM8.4 siRNA (E) a 37 ° C (paneles superiores) o 18 ° C (paneles inferiores). Individual [Ca
2 +]
i respuestas se representan a la derecha de las imágenes correspondientes. La amplitud y la fracción de células que responden a los estímulos de frío está claramente disminuidos en los cultivos tratados con siRNA TRPM8. Este efecto se representa cuantitativamente en F.
A partir de estos resultados, se concluye que TRPM8 se expresa en todas las líneas celulares ensayadas prostáticos. Además, la proteína parece formar canales funcionales. En nuestras manos, DU145 (Fig. 2B, C), las células LNCaP y PC3 (datos no mostrados) muestran un aumento en intracelular de Ca
2 + niveles tras la estimulación por el mentol (500 M) y frío moderada (disminución de la temperatura de 36 ° C a 18 ° C), compatible con la expresión funcional de TRPM8. las respuestas evocadas por frío en las células DU145 fueron fuertemente reducidos de siRNA dirigido contra TRPM8 (Fig. 2D-F).
Efecto de los bloqueadores de TRPM8 en la proliferación de las líneas celulares de cáncer de próstata
Los experimentos descritos hasta ahora apoyar la idea de que la expresión TRPM8 se produce tanto en células de la próstata y tumorales normales. La pregunta sigue siendo, sin embargo, si la inhibición de TRPM8 tiene efectos similares en todos los tipos de células. Nuestro principal objetivo era probar si la actividad TRPM8 es un requisito general para la proliferación de diferentes líneas celulares de cáncer de próstata. . Para probar esto, hemos utilizado bloqueadores farmacológicos TRPM8 [39] y la tecnología siRNA
Bloqueo utilizados (Fig. 1) fueron clotrimazol (CE
50 200 nM) [40]; CTCB, un agente bloqueante de los canales de TRPV1 [41] y de ratón, rata y canales TRPM8 humanos (con CE
50 de aproximadamente 0,6-1 M) [13], [17], [27], [42]; tio-BCTC, un menos activo (CE
50 3,5 M) analógica de BCTC; y DD01050, una novela bloqueador de los canales TRPV1 que también bloquea TRPM8 en las neuronas y células HEK293 (CE
50 aproximadamente 1 M) [38]. La proliferación se determinó usando ensayos de MTT (Fig. 3) y el efecto de estos medicamentos y un antagonista TRPM8 más selectivo (ver a continuación) en la distribución del ciclo celular y la viabilidad celular se determinó por citometría de flujo (Fig. 4).
el crecimiento de las líneas celulares indicadas en presencia de inhibidores de TRPM8. MTT hidrólisis, expresado como veces de incremento, ha sido normalizado a los niveles en el tiempo 0. El clotrimazol (cuadrados sólidos), BCTC (círculos sólidos), tio-BCTC (cuadrados abiertos) y DD01050 (triángulos) de más de 5 días de experimento. Los puntos de datos representan la media de 4 experimentos ± SEM. *:
p Hotel & lt; 0,05; **:
p Hotel & lt; 0,01; ***:
p Hotel & lt; 0,005. Los bloqueadores se utilizaron en una concentración final de 10 mM.
Los histogramas muestran los cambios en la fracción proliferativa en presencia de bloqueadores de los canales como se determina por citometría de flujo El análisis del ciclo celular. Todos los fármacos se utilizaron a una concentración de 10 mM. La fracción proliferativa bajo condiciones de control (células tratadas con vehículo) se ha considerado como 100% de la proliferación.
Clotrimazole es un inhibidor bien establecido de la proliferación de células cancerosas probablemente a través de múltiples objetivos, incluyendo la conductancia intermedia
canales activados por calcio de K + [43]. A la concentración usada (10 mM), el clotrimazol inhibió la proliferación de todas las líneas de células tumorales en un 60 a 80% después de cinco días, pero no afectó el crecimiento de células PNT1A (Fig. 3). BCTC en 10 mM mostró un comportamiento similar al clotrimazol, ya que reduce fuertemente la proliferación de todas las líneas celulares (50-70%), pero PNT1A. Los efectos de BCTC parecen ocurrir, al menos en parte (véase a continuación), a través de su acción sobre TRPM8, desde tio-BCTC era claramente menos eficaz en todas las líneas ensayadas. Sorprendentemente, DD01050 (10 M) indujo una inhibición significativa sólo en las células PC3 a un nivel comparable al de otros inhibidores, pero no mostró ninguna inhibición significativa en ninguna otra línea celular (Fig. 3).
La inhibición de la proliferación se correlacionó bien con la fracción proliferativa que se midió como porcentaje de células en S /G2 /M fases del ciclo celular. Como se muestra en la Fig. 4, la potencia relativa de cada bloqueador también se refleja en la disminución de la fracción proliferativa inducida. Ninguno de los fármacos probados cambió la fracción proliferativa de las células PNT1A. Por otra parte, tanto el clotrimazol y BCTC (ambos a 10 mM), disminución de las células en S M fases en todas las líneas de células tumorales /G2 /, mientras que 10 mM tio-BCTC fue menos potente y DD01050 era más eficaz en las células PC3. También probamos el efecto de AMTB y JNJ41876666, novedosa e inhibidores altamente específicos TRPM8 [37], [44], en todas las líneas celulares. A los 10 M, ambos fármacos reducen la fracción de proliferación de líneas celulares de cáncer dejando a las células PNT1A afectada. No se observó ningún efecto citotóxico de los fármacos en las concentraciones utilizadas (no se muestra). En conjunto, los resultados obtenidos con los diferentes bloqueadores son consistentes con la opinión de que la inhibición de la TRPM8 en una reducción de la proliferación de células de cáncer de próstata.
Knock Down de TRPM8 mensaje Reduce la proliferación de células de cáncer de próstata
para lograr una correlación más directa entre la expresión TRPM8 y proliferación de células tumorales, se utilizó siRNA contra TRPM8 y medimos sus efectos sobre la proliferación y la distribución del ciclo celular en las tres líneas celulares prostáticas tumor y el que no tumoral. Como control positivo se utilizó siRNA dirigido contra hGAPDH. Como GAPDH es una enzima clave de la glucólisis, la reducción de la proteína se refleja en la actividad metabólica de las células transfectadas. Esto se demostró para las cuatro líneas celulares por ensayos de MTT (no mostrado) y citometría de flujo (Fig. 5A).
Se determinó el efecto de la caída GAPDH en la fracción proliferativa de cada línea celular. Como era de esperar, GAPDH desmontables inhibe la proliferación en todos los tipos de células. Por supuesto B. Tiempo de reducción de TRPM8 ARN contenido por el tratamiento TRPM8 siRNA se indica. TRPM8 mensaje se determinó a los tiempos indicados después de la transfección. La abundancia relativa se refiere a la cantidad de mRNA a tiempo 0 y corregido para la expresión de receptor de transferrina como control. proteína C TRPM8 caída por TRPM8.3 y TRPM8.4 siRNA 48 h después de la transfección. Actina se utilizó como control de carga, y la cuantificación densitométrica relación con el control de siRNA se presenta en el diagrama de barra de la derecha.
Se recomienda el uso de múltiples siRNAs funcionales para asegurar la especificidad de los efectos fenotípicos observados debido secuencias dirigidas a diferentes partes del mensaje deben tener cualitativamente los mismos efectos. Cuantitativamente, diferentes siRNAs dirigidos el mismo gen a menudo no son igualmente eficaces debido a las propiedades termodinámicas, la estabilidad, y el posicionamiento de cualquiera de los siRNAs a sí mismos o de la región diana del gen. Por lo tanto, hemos probado cuatro diferentes siRNAs dirigidos contra TRPM8, que han sido designados TRPM8.1-4. Estos siRNAs reconocen secuencias diana en distintos TRPM8 y difieren en su potencia silenciamiento en las diferentes líneas celulares. Para reducir la posibilidad de efectos fuera de la meta, se utilizó una baja concentración de siRNA (25 nM) y optimizado el tiempo de transfección. Para ello, se incubaron con cada tipo de célula equilibrada mezcla de reactivos de transfección siRNA para 4, 6, 8, 12 y 24 h, y vigilancia las 24 y 48 horas después de la reducción relativa de TRPM8 provocada por TRPM8.3 y utilizando TRPM8.4 PCR en tiempo real; TRPM8.3 y TRPM8.4 fueron efectivos en el nivel de ARN en las cuatro líneas celulares analizadas (incluyendo PNT1A) después de incubación de 6 horas con siRNA. También optimizado el tiempo de incubación después de la transfección siRNA siguiendo la abundancia de mRNA TRPM8 en 12, 24, 72 y 120 horas. Para PNT1A, LNCaP y PC3 la reducción máxima de mensaje TRPM8 usando TRPM8.4 siRNA se observó a las 72 horas, mientras que DU145 mostró el efecto máximo ya a las 48 horas (Fig. 5B). El silenciamiento de TRPM8 indujo una disminución en la proliferación medida por ensayos de MTT en la línea celular PC3. MTT hidrólisis en PNT1A, DU145 y células LNCaP no fue obviamente afectada por siRNA (no mostrado). Esto es probablemente un reflejo de los diferentes tiempos óptimos para RNA caída, porque uno debe esperar un cambio por varias horas entre la reducción en el mensaje TRPM8 y efectos sobre la proliferación, lo cual dependerá de el tiempo de duplicación y el tiempo necesario para la proteína desmontables ambos que son diferentes para cada tipo de célula. La reducción del ARNm correlacionado con una clara reducción de la proteína en aproximadamente un 50% en todas las líneas celulares a las 48 horas (Figura 5C), pero la caída incompleta podría explicar la falta de efectos en MTT hidrólisis.
Por esta razón , hemos realizado mediciones de la fracción proliferativa, que resultó más sensible. Hemos detectado una disminución en la fracción de células en S /G2 /M fases del ciclo celular en todas las líneas de células tumorales pero observó ningún efecto sobre las células PNT1A no tumorales. Un ejemplo de mediciones de la distribución del ciclo celular en las células DU145 se muestra en la Fig. 6A. Una disminución de S y las células G2 /M se ve claramente después del tratamiento siRNA. El resultado de las dos siRNAs eficaces era diferente en función de las líneas celulares; PC3 y LNCaP respondieron sólo a una de las dos secuencias (TRPM8.4, Fig. 6B), mientras que para DU145 ambas secuencias eran eficaces.
. Representante histograma del ciclo celular de las células DU 145 transfectadas con el control (arriba) o hTRPM8 siRNA (parte inferior). La fracción proliferativa (S /G2 /M) se reduce con claridad después de TRPM8 caída. fracción B. proliferativa (%) de las células transfectadas con el control o anti-TRPM8 siRNA (secuencias 3 y 4). Las barras representan media de 3-5 experimentos. C. CTCB mantiene sus efectos inhibitorios después de silenciamiento de TRPM8. el crecimiento de las células DU145 normalizada en presencia de 10 mM BCTC, después de la transfección de las células con el control (columna blanca) o TRPM8.4 siRNA (columna de negro). El crecimiento en ausencia de BCTC representa 100%.
Los efectos observados bajo siRNA hizo posible comprobar si la inhibición de la proliferación inducida por agentes farmacológicos está mediada únicamente por sus efectos sobre TRPM8. Para probar esto, se evaluó si BCTC fue capaz de reducir el crecimiento de células DU145 después del tratamiento siRNA. Si todos los efectos de CTCB fueron mediadas a través de TRPM8, el fármaco debe tener menos efecto sobre la proliferación después de TRPM8 desmontables de siRNA. Sin embargo, BCTC (10 M) inhibió el crecimiento de esta línea celular en un grado similar después de TRPM8 caída, lo que indica que el efecto de BCTC sobre la proliferación celular del cáncer de próstata no es del todo debido a la inhibición TRPM8 (Fig. 6C).
informes anteriores habían demostrado que la viabilidad de las células LNCaP se reduce por la inhibición de TRPM8 [19]. Podríamos confirmar esta observación, pero LNCaP fue la única línea celular que mostró este comportamiento. La viabilidad de PNT1A1 también se redujo después de siRNA transfección, pero este efecto no dependía de TRPM8, porque ocurrió en esta línea celular también para el control de siRNAs (datos no mostrados).
mentol y icilin Efectos en la proliferación y la viabilidad de las células de la próstata
Nuestros resultados confirman la idea de que la inhibición TRPM8 reduce la proliferación celular de células de cáncer de próstata. Por lo tanto, decidimos probar si la activación de TRPM8 con mentol produce un efecto contrario, es decir, un aumento en la proliferación. El mentol (120 o 300 mM) o icilin (10 M) se añadieron al medio de crecimiento. Paradójicamente, el mentol se ha descrito para reducir la viabilidad de células LNCaP [19]. La interpretación original de este fenómeno fue que la activación de TRPM8 conduce a una sostenida Ca
2 + afluencia que induce la apoptosis, pero el mentol podría tener efectos fuera de objetivo en estas células, así [22], [45]. No se observó una reducción sistemática de la viabilidad celular LNCaP en presencia de mentol, aunque había algo de aumento de la mortalidad en algunos experimentos. El mentol no alteró la viabilidad de las otras líneas celulares (no mostrado). MTT y citometría de flujo experimentos en las cuatro líneas celulares proporcionan results.We intrigante no detectó ningún aumento significativo inducida por el mentol o icilin bajo la concentración sérica normal (Fig. 7A). Sin embargo, en presencia de suero reducido, sólo DU145 células mostraron un aumento significativo aún modesta en la proliferación inducida por el mentol (Fig. 7B).
El efecto de mentol (dos concentraciones diferentes) y icilin (10 M) en la fracción proliferativa de cada línea celular fue determinada. No se detectó ningún efecto. Los datos se presentan normalizados a la fracción proliferativa en ausencia de activadores TRPM8. B. En las células privadas de suero, las concentraciones moderadas de mentol provocó un aumento en la actividad metabólica de las células DU145 medidos mediante el ensayo de MTT. El efecto fue más débil a concentraciones más altas.
Efecto de TRPM8 Bloque de Curación de Heridas
La evidencia reciente indica que la actividad TRPM8 es un factor relevante para controlar la migración de las células de cáncer de próstata [24], [46]. Por lo tanto, hemos decidido utilizar un ensayo de cicatrización de heridas, un método clásico de la retransmisión de los efectos combinados de la proliferación y la migración [47], para estudiar las acciones de los bloqueadores de TRPM8 en monocapas interrumpidas de LNCaP, PC3, DU145 y células PNT1A. En presencia de la concentración de suero normal, todas las líneas celulares reducen eficazmente el área de la herida; las líneas de células tumorales requieren tiempos más cortos para cerrar la herida en comparación con las líneas no tumorales (Fig. 8A izquierda, C). La curación de heridas fue significativamente inhibida por los bloqueadores específicos TRPM8 AmtB y JNJ41876666, en PC3, LNCaP y células DU145, pero no en PNT1A (Figura 8A, C). Para reducir al mínimo los efectos de la proliferación, se realizó el mismo análisis en todas las líneas celulares a las 12 h; JNJ41876666 redujo la curación de heridas en todas las líneas de células tumorales, pero no en células PNT1A (Fig. 8B).
ensayos de curación de la herida se realizaron en PNT1A, LNCaP, PC3 y DU145 células en ausencia o presencia de la TRPM8 inhibidores AMTB y JNJ41876666 (10 M). A. Imágenes representativas de experimentos realizados en presencia de concentraciones en suero normales. En ausencia de bloqueador, todas las líneas celulares restaurar eficazmente la monocapa después de 24 (LNCaP y DU145) o 48 h (PNT1A; a 24 h, no se observó la recuperación). La presencia de bloqueadores perjudica la curación en LNCaP, PC3 y DU145, pero no en células PNT1A. B. No se observaron efectos similares en todas las líneas celulares ya las 12 h después de la cero. C. Cuantificación de la superficie restaurada a partir de tres imágenes como las de A, durante 24 h en todas las líneas celulares, excepto PNT1A (48 h) en presencia de JNJ41876666 (negro) y AMTB (rojo). D. Experimentos similares en bajas concentraciones en suero revelaron que PNT1A no redujo la superficie de cero, mientras que las células de cáncer de LNCaP y PC3 (en 3% de FCS) y DU145 (en 1% de FCS) lo hicieron. La cicatrización se inhibe de nuevo por JNJ41876666 (10 M). E. El mentol indujo una ligera aceleración de la cicatrización sólo en las células DU145, mientras icilin mostró ningún efecto sobre cualquiera de las líneas ensayadas.
En las concentraciones séricas bajas, las células PNT1A no lograron cerrar la herida en 48 horas mientras que las tres líneas celulares de cáncer redujeron significativamente la superficie de la herida dentro de las 24 h; en tales condiciones, JNJ41876666 retrasó significativamente la cicatrización de heridas en todas las líneas celulares de cáncer, aunque no en PNT1A (Figura 8D); AMTB produjo esencialmente los mismos efectos (datos no mostrados).