Extracto
El cáncer gástrico (CG) sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo y por lo tanto existe una clara necesidad de buscar de biomarcadores temprana de diagnóstico más sensibles. Se realizó una revisión sistemática de los ocho estudios de perfiles de miARN publicados que compararon tejidos GC con tejidos no cancerosos adyacentes. Se utilizó un sistema de clasificación de miARN que se llevó a la frecuencia de las comparaciones, la dirección de la expresión diferencial y el tamaño total de la muestra en consideración. Se identificaron cinco miRNAs que fueron reportados más consistente que se upregulated (miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a y miR-20a) y dos miRNAs que fueron regulados a la baja (miR-378 y miR-638). Seis de ellos fueron validados en 32 conjuntos de pares GC y muestras de tejidos cancerosos adyacentes usando PCR en tiempo real. MiR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a y miR-20a se confirmó que los tejidos GC upregulatedin, mientras que la expresión de miR-378 se redujo. Por otra parte, se encontró una asociación significativa entre los niveles de expresión de miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a y miR-20a y características clinicopatológicas de GC. Estos miRNAs pueden ser utilizados para los biomarcadores de diagnóstico y /o pronóstico para GC y estudiar con más detenimiento
Visto:. Wang J-L, Hu Y, Kong X, Wang Z-H, Chen H-Y, Xu J, et al. (2013) Candidato microARN biomarcadores en cáncer gástrico humano: una revisión sistemática y estudio de validación. PLoS ONE 8 (9): e73683. doi: 10.1371 /journal.pone.0073683
Editor: William CS. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 16 de mayo de 2013; Aceptado: July 19, 2013; Publicado: 9 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales del Programa clave (Nº 30.830.055), el Ministerio de Salud Pública, china (Nº 200802094), el Ministerio de Educación (Nº 20090073110077) fang JY, y la Fundación doctor en Innovación de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (núm BXJ201219) a Wang JL. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de una reciente disminución en la incidencia de cáncer gástrico (CG) [1], sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, especialmente en Asia Oriental. Un total de un millón de nuevos casos de CG se produjo en 2008, con 738.000 muertes [2]. Esto representa el 8% del total de casos de cáncer y el 10% del total de muertes. Aunque la endoscopia pueden detectar las primeras etapas de GC, la mayoría de los casos todavía se diagnostican en una fase avanzada, lo que resulta en un mal pronóstico [3]. La tasa de supervivencia a 5 años para los casos de CG con estadio II rangos de 30% a 50%, pero cae a entre 10% y 25% para los pacientes con enfermedad en estadio III [4]. Aunque las técnicas endoscópicas se están desarrollando rápidamente, su valor para la detección precoz de la GC es limitada debido a la falta de sensibilidad, los altos costos y molestias. Se requieren nuevos biomarcadores de diagnóstico y pronóstico para GC, por tanto, con urgencia.
Los microARN (miARN) son moléculas cortas de ARN no codificantes de 19-25 nt. Regulan la expresión de genes a nivel post-traduccional guiando el complejo de silenciamiento inducido por ARN de genes miARN sitios objetivo en la región no traducida 3 'del ARNm, dando lugar a la degradación del ARNm o la inhibición de la traducción [5]. Estudios anteriores han demostrado que numerosos miRNAs se expresan de manera aberrante en muchos tipos de cánceres, y de perfiles de expresión de los genes miARN ha mostrado ciertos miRNAs para ser asociados con el desarrollo del tumor, la progresión y la respuesta al tratamiento. Por tanto, son buenos candidatos para el uso de biomarcadores como diagnósticos, pronósticos y predictivos [6].
Se han realizado varios estudios para buscar biomarcadores mediante la identificación de la expresión diferencial de miRNAs entre muestras de tejido y GC correspondiente gástrico no tumoral tejido del mismo paciente [7] - [14]. Estos estudios han dado como resultado la identificación de cientos de miRNAs expresados diferencialmente. Sin embargo, muchos de estos son propensos a ser falsos positivos, y sólo una pequeña fracción se podría utilizar como biomarcadores de diagnóstico o pronóstico. Un enfoque lógico para distinguir miRNAs importantes de un gran número de candidatos listas miARN es la búsqueda de la intersección de miRNAs identificados en varios estudios independientes [15]. Aunque este método se ha convertido vez más popular [15], [16], [17], ningún estudio publicado ha identificado las intersecciones de miRNAs relacionados GC-en base a un gran número de genes miARN perfiles de expresión estudios.
Hemos llevado a cabo esta revisión sistemática para identificar los más importantes miRNAs expresados diferencialmente que se han reportado consistentemente en una serie de estudios de perfiles de expresión de los genes miARN independiente en pacientes con cáncer gástrico. Por otra parte, hemos validado aún más algunos de los miRNAs que fueron más arriba o regulados a la baja mediante PCR en tiempo real en 32 pares de GC y muestras de tejidos no tumorales adyacentes emparejados.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
el estudio fue aprobado por el comité de ética de Shanghai Jiaotong University School of Medicine, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes al inicio del estudio.
Estrategia de Búsqueda
estudios de potenciales publicados en Inglés de Medline utilizando las siguientes palabras clave: 'miARN' O 'microARN' O 'MIR', 'gástrica' O 'estómago', 'perfiles' O 'microarrays'. Las listas de referencias de artículos de revisión y artículos originales se hicieron búsquedas manuales para publicaciones adicionales.
Criterios de inclusión de la Literatura
En un estudio que se incluirán en esta revisión sistemática, varios criterios había que cumplir : 1) los estudios debían ser miARN perfiles de estudios en pacientes con cáncer gástrico; 2) los estudios tuvieron que utilizar tejidos GC y sus correspondientes tejidos no tumorales adyacentes para la comparación; 3) métodos tenían que comprender las técnicas de microarrays miARN. Por otra parte, sólo se incluyeron las publicaciones de texto completo en Inglés. No se incluyeron los estudios de perfiles que utilizan líneas celulares de GC o muestras de suero de pacientes con cáncer gástrico, los que compararon las biopsias de tumores de GC con diferentes etapas de la enfermedad, y aquellos que utilizan diferentes tecnologías miARN. los artículos de revisión no se incluyeron en esta revisión sistemática.
Extracción de datos y listas de miARN
expresados diferencialmente fueron identificados miRNAs de cada estudio incluido perfilado. Se determinó la información pertinente (es decir, localización cromosómica, pre-miARN longitud, la secuencia de los genes miARN maduro y objetivos potenciales de la miRNAs), y la información que falta se identificaron a partir de la base de datos miRBase (www. mirbase.org/) y Pubmed.
Clasificación
Cada estudio incluido perfilado [7] - [14] proporciona una lista de miRNAs expresados diferencialmente (Tabla S1). Griffith y Chan ideado un método para clasificar biomarcadores moleculares potenciales para los grupos de comparación [16], [17], que se ha utilizado para estudios de perfiles de miARN. Por ejemplo, Ma et al. [15] identificaron las intersecciones de miRNAs relacionados con el cáncer colorrectal sobre la base de un gran número de genes miARN estudios de perfiles. Por lo tanto, los criterios para la literatura incluidos en esta revisión sistemática actual se basaron en los de sus informes [15]. MiRNAs se clasificaron a los criterios establecidos en el siguiente orden de importancia: (i) el miARN se informó de forma consistente como diferencialmente expresado en una dirección coherente de cambio; (Ii) la frecuencia de los genes miARN se informó en los estudios de microarrays; (Iii) el tamaño total de la muestra para cada uno consistente informó miRNAs.
Validación de los miRNAs Uso de PCR en tiempo real
Para validar los resultados de perfilado, 32 GC tejidos frescos y su gástrica no tumoral emparejados los tejidos se obtuvieron del hospital Renji, adscrito a la Facultad de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiaotong. ARN total fue extraído a partir de 32 pares de muestras coincidentes humanos GC (incluyendo cáncer y tejidos no cancerosos adyacentes) usando reactivo TRIzol (Invitrogen). La concentración de ARN y la pureza se midió usando Nanodrop ND-2000, y se aplicó el método de medición de absorción ultravioleta para detectar la pureza del RNA, sólo aquellos A260 /A280 situado entre 1,80 a 2,00, y A260 /A230 & gt; 1,7, se utilizaron para el experimento final, de lo contrario el RNA debe ser re- extrajo. La transcripción inversa del ARN 3 mg se hizo usingAll-in-One ™ primer capítulo de síntesis de cDNA Kit (Genecopoeia, Guangzhou, China), de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, la solución de reacción de transcripción inversa de ARN preparado se incubó a 37 ° C durante 60 minutos y se terminó en 85 ° C durante 5 minutos, y después se almacenó a -20 ° C para su posterior análisis. PCR cuantitativa (qPCR) se realizó utilizando un ABI Prism 7900HT de detección de secuencias (Applied Biosystems, EE.UU.) con SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara). Los cebadores (miR-21-5p, miR-106b-5p, miR-17-5p, miR-18a-5p, miR-20a-5p y miR-378-5p) incluyendo U6 se obtuvieron de Genecopoeia (Guangzhou, China) . La cuantificación se calcula utilizando el método 2 -ΔΔCT y se presenta como modelo normalizado.
Análisis estadístico
Los resultados fueron analizados utilizando el software SAS 9.2 (SAS Institute Inc. EE.UU.). Los datos se presentan como medias ± SD. Se utilizó la prueba t de Student para comparar los valores entre dos grupos independientes.
Resultados
Selección Literatura y estudiar las características
Un total de 104 estudios Se realizaron búsquedas en PubMed usando nuestra búsqueda estrategia, de los cuales 73 fueron excluidos después de revisar los títulos y resúmenes. Se excluyeron 23 estudios después de leer el texto completo. Sólo ocho estudios fueron incluidos en esta revisión sistemática. La selección detallado estudio se muestra en la Figura 1. Las características detalladas de cada estudio se presentan en la Tabla 1.
miRNAs expresados diferencialmente
Un total de 223 miRNAs expresados diferencialmente se informaron en los ocho estudios de microarrays (miRNAs expresados diferencialmente en cada estudio se detallan en la Tabla S1); 124 fueron upregulated en GC y 99 se downregulated. Entre los 223 miRNAs expresados diferencialmente, fueron reportados 48 en al menos dos estudios; 39 (81,3%) tenían una dirección constante y nueve (18,7%) tenían una dirección inconsistente de la expresión alterada. Entre los primeros 39, 20 fueron regulados positivamente en GC y 19 se downregulated. Tres de estos miRNAs se informaron en cinco estudios de microarrays (miR-21, miR-106b y miR-378), cuatro fueron reportados en cuatro estudios (miR-17, miR-18a, miR-20a y miR-638), y siete se informaron en tres estudios (miR-19a, miR-20b, miR-25, miR-30d, miR-923, miR-375 y miR-148a). Sus localizaciones cromosómicas, pre-miARN longitudes, secuencias maduras y los posibles objetivos se enumeran en las Tablas 2-4.
Validación de los miRNAs seleccionados en GC pacientes
Para validar la expresión de los seis miRNAs más consistentemente reportado (miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a, miR-20a y miR-378), la expresión de estos miRNAs en biopsias de GC y adyacentes no cancerosos los tejidos se compararon en 32 casos de GC utilizando PCR en tiempo real. Los valores de Ct primas de los seis miRNAs se muestran en la Tabla S2.The resultados mostraron que el miR-378 se downregulated en los tejidos GC, mientras que los otros cinco miRNAs (miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a y miR -20) se upregulated en GC (Figura 2). Nuestros resultados fueron consistentes con los de los perfiles de estudios originales. Por otra parte, hemos explorado la relación entre la expresión de estos miRNAs con las características clínicas y patológicas de GC. Se encontró que la expresión de miR-21 fue significativamente mayor en los casos de casos de CG con tamaños más grandes tumores (≥8 cm), una pobre diferenciación y la metástasis con el compromiso de los ganglios linfáticos y enfermedad etapa posterior. MiR-106b, miR-17 y miR-18a niveles fueron significativamente mayores en GC pobremente diferenciado, los casos con afectación de los ganglios linfáticos, o enfermedad en etapa tardía, mientras que los niveles de miR-20a fueron significativamente mayores en los casos de GC con compromiso de los ganglios linfáticos. Sin embargo, no se encontró relación entre la expresión de miR-378 y las características clinicopatológicas de GC. Estos resultados se detallan en la Tabla 5.
Uso U6 como una normalización de control, la expresión de miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a y miR-20a fue significativamente mayor en los tejidos de GC, mientras que la expresión de miR-378 fue significativamente menor.
Discusión
estudios de microarrays MiRNA proporcionar cantidades de información, pero un inconveniente común es la falta de coherencia entre los diferentes estudios . De acuerdo con los informes de Griffith et al. y Chan et al. [16], [17], una solución lógica a este problema sería determinar la consistencia entre los diferentes estudios utilizaron diferentes plataformas de microarrays. Varias revisiones sistemáticas [15] - [17] han utilizado este método para determinar los genes expresados diferencialmente o miRNAs en varios estados de enfermedad. La aplicación de un método similar, se observó que un total de 48 miRNAs expresados diferencialmente se registraron en al menos dos estudios independientes entre los ocho estudios de perfiles de GC miARN [7] - [14]. Entre estos, se reportaron 39 miRNAs que ser modificado en una dirección constante, mientras que los resultados de nueve eran incompatibles. Entre los 39 miRNAs que presentaban cambios, 20 miRNAs se upregulated consistente en GC en comparación con el tejido no canceroso gástrica, y 19 fueron regulados a la baja constantemente en GC. Se identificaron los cinco miRNAs que se upregulated más consistente (miR-21, miR-106a, miR-17, miR-18a y miR-20a) y dos downregulated más consistente (miR-378 y miR-638) en al menos cuatro perfiles estudios. A continuación, se validó estos hallazgos a través de PCR en tiempo real, lo que apoya aún más los resultados de esta revisión sistemática. También se determinó que la expresión de estos miRNAs se correlacionaron con las características clínico-patológicas de GC, lo que sugiere que estos miRNAs pueden ser útiles como biomarcadores para el GC.
Uno de los MIR más constantemente informado upregulated miARN en nuestra revisión sistemática fue -21, que se ha alterado la expresión y la actividad oncogénica en diferentes cánceres humanos. Cui et al. [18] demostraron que la expresión de miR-21 fue significativamente mayor en el tejido GC en comparación con el tejido normal adyacente. La expresión de miR-21 también se ha encontrado a ser mayor en los pacientes con GC con metástasis en los ganglios linfáticos que los que no, y también se correlacionó significativamente con el tipo histológico del tumor y el estadio pTNM [19], el cual fue validado por nuestro estudio. Por otra parte, el aumento de los niveles de expresión de miR-21 predijeron pobre supervivencia en pacientes con GC [19]. Otros estudios han encontrado que el miR-21 puede promover la proliferación tumoral y la invasión de GC mediante la supresión de la expresión de PTEN o PDCD4 [20], [21]. Además, estudios previos han revelado también la actividad oncogénica de miR-21 en el cáncer colorrectal [22], el cáncer de mama [23] y el cáncer de esófago [24].
miR-106b se informó también de forma consistente como un miARN aumentada en tejido GC por este y otros estudios anteriores [14], [25]. La alta expresión de miR-106b se ha asociado previamente con la metástasis de los ganglios linfáticos [25], [26], y esto fue validado en nuestro estudio. Kim et al. [27] encontró que el miR-106b puede ejercer su actividad oncogénica por la supresión de la expresión de p21 en GC. MiR-106b podría inducir la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) y un fenotipo de células iniciadoras de tumores en el cáncer de mama por la orientación de Smad7 y Six1 y la activación de la señalización de TGF-β [28]. También puede promover la proliferación celular en el carcinoma hepatocelular humano mediante la regulación negativa de la expresión de la APC [29].
miR-17 se ha conocido la actividad oncogénica en los seres humanos, y se encontró que ser aumentada en un 77,2% de las muestras de tejido de GC en comparación con el tejido normal adyacente gástrico. Promueve la progresión del ciclo celular e inhibir la apoptosis en GC por la orientación p21 y p53INP1 (proteína nuclear tumor proteína inducida por p53-1) [30]. Los niveles circulantes de miR-17 son elevados en pacientes con cáncer gástrico, y la concentración de miR-17 se asocia significativamente con el estadio TNM y grado de GC [31]. Sin embargo, nuestro estudio encontró que la expresión de miR-17a fue mayor en los casos de CG y sin metástasis en los ganglios linfáticos que aquellos con afectación de los ganglios linfáticos, que puede haber sido una consecuencia del pequeño tamaño de la muestra en nuestro estudio. La alta expresión de miR-17 se correlaciona significativamente con los resultados de supervivencia pobres [31]. Estudios anteriores también han encontrado que el miR-17 tiene actividad oncogénica en el cáncer colorrectal [32], el cáncer de mama [33] y el cáncer de páncreas [34].
Se encontró miR-18a que se upregulated en cuatro estudios en esta revisión sistemática, y se sabe que tiene actividad oncogénica en seres humanos. Wu et al. [35] reveló que la expresión de miR-18a se upregulated significativamente en el tejido GC en comparación con el tejido gástrica normal, y podría apuntar directamente PIAS3 (inhibidor de la proteína de transductor de señales activado y activador de la transcripción 3) y se correlacionó positivamente con los niveles de survivina, Bcl-XL y c-myc. Por otra parte, la regulación al alza de miR-18a se ha informado en el carcinoma nasofaríngeo [36], el cáncer de páncreas [37], carcinoma hepatocelular [38] y el cáncer de mama [39].
Mir-20a es otro miARN con oncogénico se encontró que la actividad, y de que se upregulated en cuatro estudios en esta literatura. Se ha demostrado que los niveles circulantes de miR-20a es significativamente elevado en pacientes con cáncer gástrico en comparación con los controles sanos, y esto se asoció significativamente con el estadio y el grado del tumor [31], [40]. Nuestro estudio también encontró que el miR-20a fue significativamente elevado en los tejidos GC y se asoció significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos. Por otra parte, la regulación al alza de miR-20a ha sido encontrado previamente en el cáncer de cuello uterino, cáncer de próstata y el cáncer de ovario, y esto miARN podría promover la proliferación celular o la invasión de estos tipos de cáncer [41] - [43].
La downregulated más consistentemente miARN en esta revisión sistemática fue el miR-378, que resultó ser regulados a la baja en cinco estudios. MiR-378 se ha demostrado que tiene actividad anti-oncogénica en seres humanos [44]. La expresión exógena de miR-378 suprime notablemente la proliferación de células de GC mediante la supresión de CDK6 y VEGF señalización [44]. En nuestro estudio, aunque se encontró que la expresión de miR-378 se downregulated en los tejidos GC, no se encontró relación entre la expresión de miR-378 y las características clinicopatológicas de GC. Esto puede haber sido debido al tamaño pequeño de la muestra de este estudio. También se informa de que el miR-378 está regulado por disminución significativa en el cáncer colorrectal, y puede desempeñar un importante papel supresor tumoral en este tipo de cáncer [45]. Sin embargo, otros estudios han encontrado que miR-378 puede tener actividad oncogénica en otros tipos de cáncer [46] - [49]. Por lo tanto, el papel exacto de miR-378 en la carcinogénesis necesita ser estudiada posteriormente.
Por otra parte, también se encontró que algunos de los miRNAs candidatos identificados en nuestro estudio fueron identificados slso como biomarcadores séricos en varios tipos de cáncer. Por ejemplo, el suero de miR-21 fue significativamente elevado en el suero perioperatoria de adenomas y cáncer colorrectal (CCR), y fue un marcador pronóstico independiente para el CCR [50], [51]; Plasma miR-106b, junto con miR-20a y miR-221 tienen el potencial como nuevos biomarcadores para la detección precoz del cáncer gástrico [40]; Hacer circular el miR-17 se puede utilizar como un nuevo biomarcador no invasivo para el carcinoma nasofaríngeo [52], cáncer gástrico [53] y el CRC [54]; Serum miR-18a se puede utilizar como un nuevo biomarcador en cáncer de mama [55], el cáncer colorrectal [56], carcinoma hepatocelular [57], y cáncer de páncreas [58]; Circulación miR-378 se puede usar como un biomarcador en carcinoma renal de células [59] y el cáncer gástrico [60]. Estos estudios confirmaron además la importancia de los miRNAs indentified, y pueden ampliar el ámbito de aplicación de estos miRNAs.
En conclusión, nuestra revisión sistemática identificó cinco miRNAs upregulated (miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a y miR-20a) y una downregulated miARN (miR-378) que son potenciales nuevos biomarcadores para GC. Estos miRNAs han demostrado tener un potencial de diagnóstico y /o pronóstico de este cáncer y garantiza una mayor investigación. Otros estudios que se centran en estos miRNAs ayudarán a determinar un panel de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico de GC con adecuados niveles de sensibilidad y especificidad.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
diferencialmente expresado miRNAs identificados en cada estudio incluido
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073683.s001 gratis (XLS)
Tabla S2.
valor bruto Ct de los miRNAs seleccionados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073683.s002 gratis (XLS) sobre Table S3. Lista de verificación
PRISMA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0073683.s003 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos a la señorita Wei-Feng Qu por su excelente editorial trabajo.