Extracto
Los microARN (miRNA) han informado a desempeñar un papel crítico en la invasión del cáncer y la metástasis. Nuestro estudio anterior mostró que el miR-375 con frecuencia regulado por disminución en el cáncer gástrico suprime la proliferación celular mediante la focalización Janus quinasa 2 (JAK2). Aquí, encontramos, además, que el nivel de expresión de miR-375 se redujo significativamente en los tejidos de cáncer gástrico metastásico en comparación con los controles no metástasis. La expresión ectópica de miR-375 inhibe la migración y la invasión de células de cáncer gástrico en parte por la orientación JAK2. Por otra parte, el miR-375 expresión está regulada negativamente por la metástasis del factor de transcripción asociado Caracol, que se une directamente al supuesto promotor de miR-375. Por otra parte, la sobreexpresión de Snail puede revertir parcialmente la inhibición de la migración celular de cáncer gástrico causado por el miR-375. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que miR-375 puede ser regulada negativamente por Caracol y participa en la migración de células de cáncer gástrico y la invasión potencialmente por la orientación JAK2
Visto:. Xu Y, Jin J, Liu Y, Huang Z, Deng Y, Usted T, et al. (2014) Caracol-Regulado miR-375 inhibe la migración y la invasión de células de cáncer gástrico por la orientación JAK2. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10.1371 /journal.pone.0099516
Editor: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Febrero, 2014; Aceptado: 15-may de 2014; Publicado: 23 de julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Natural Científico China (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 y 31100975), Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2013CB945603, 2012CB945004 y (2011CBA01001), Ministerio de Educación de China (20110101110103 y (20130101120001), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Zhejiang, china (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 y Y2100106), los 111 proyectos (B13026), los Fondos de investigación Fundamental para las Universidades central (2014QNA7015) y Programa Provincial de Zhejiang para el cultivo de alto nivel talentos innovadores para la salud. la proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la metástasis es los aspectos más terribles de cáncer y se ha estudiado durante más de 100 años [1], [2]. En el cáncer gástrico, la alta mortalidad atribuye principalmente al retraso en el diagnóstico debido a la falta de síntomas específicos en etapa temprana. Y la metástasis es responsable de la mortalidad relacionada con el cáncer gástrico [3], [4]. La migración y la invasión de las células cancerosas son procesos esenciales durante procesión metastásica del cáncer que consiste en una serie de pasos relacionados entre sí, incluyendo la proliferación, el desprendimiento, la circulación, el transporte, la detención en los órganos, la adherencia a la pared del vaso, la extravasación, el establecimiento de un microambiente, y la proliferación en órganos distantes. En el cáncer gástrico, células de invasión en el tejido circundante es un paso temprano fundamental [3], [5]. Sin embargo, los mecanismos de las células de cáncer gástrico migración, invasión y metástasis no han sido completamente entendidos.
En los últimos años, diversas moléculas, por ejemplo, factores de crecimiento, citoquinas, moléculas de la matriz extracelular de remodelación, y algunos factores de transcripción tales como Caracol, Twist and ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], se han puesto de manifiesto para impulsar el progreso de la migración de las células del cáncer, invasión y metástasis. Últimamente, se ha hecho evidente que, además de alteraciones en genes codificadores de proteínas, alteraciones en los genes no codificantes también puede contribuir a la migración de células de cáncer, invasión y metástasis, tales como miRNAs, que son una clase de pequeño monocatenario no codificantes moléculas de ARN que regulan la expresión de genes con un gran potencial y han sido implicados en la regulación de células de cáncer de la migración, invasión y metástasis como activadores o supresores de [12], [13], [14], [15], [16] . Hasta la fecha, se han estudiado una serie de miRNAs estar implicados en la progresión de la metástasis del cáncer gástrico, por ejemplo, el miR-218, miR-9, miR-7, y miR-146a [6], [17], [18], [19]. Hemos estudiado la asociación entre miARN desregulación específica y la metástasis paso específico de cáncer gástrico, que proporcionará conocimientos sobre los mecanismos potenciales de cáncer gástrico células migración, invasión y metástasis
.
En nuestro estudio anterior, el miR-375 fue downregulated significativamente en el cáncer gástrico y inhibió la proliferación de células de cáncer gástrico por la orientación JAK2 [20]. Curiosamente, en el presente estudio, hemos encontrado, además, que el nivel de expresión de miR-375 fue aún menor en las muestras de pacientes con cáncer gástrico de metástasis positivas comparadas con la de los pacientes sin metástasis. Por lo tanto, se propone que el miR-375 podría tener un papel causal en la metástasis del cáncer gástrico. Nuestros estudios revelaron que la expresión ectópica de miR-375 inhibe la migración y la invasión de células de cáncer gástrico también parcialmente por la orientación JAK2. Nos alentó más para averiguar cómo la expresión de miR-375 fue regulada en el cáncer gástrico. Los resultados indicaron que el miR-375 era un objetivo de la metástasis del factor de transcripción asociado caracol y su expresión se correlaciona inversamente con el caracol en el cáncer gástrico. La sobreexpresión de Snail puede revertir parcialmente la inhibición de la migración celular de cáncer gástrico causado por el miR-375. Por lo tanto, nuestros resultados demuestran que el miR-375 inhibe la migración de células de cáncer gástrico y la invasión a través de la vía /miR-375 /regulación JAK2 Caracol.
Materiales y Métodos
muestras clínicas (Declaración de Ética) y células líneas
especímenes clínicos de cáncer gástrico y sus muestras gástricas no malignas pareados de 39 pacientes sometidos a resección de cáncer gástrico fueron proporcionados por Sir Run Run Shaw hospital (Hangzhou, china). Todas las muestras se recogieron con el consentimiento por escrito de los pacientes como se describe anteriormente [20]. Tanto los tejidos tumorales gástricas y tejidos gástricos nontumorous adyacentes recogidos después de la cirugía fueron y se divide en dos partes. Uno se congeló en nitrógeno líquido inmediatamente para su uso posterior, otra parte se almacenó en formalina para el análisis de la patología. Los pacientes que participan en nuestro estudio fueron separados en grupos de metástasis positivos (9/30) y libre de metástasis. Las líneas celulares de cáncer gástrico (AGS y MGC-803) y una línea de células epiteliales gástricas no malignos fueron descritos (GES-1) anteriormente [20].
extracción de RNA
El ARN total de muestras y líneas celulares gástrico fue extraído utilizando el kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion, TX, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante.
cuantitativo en tiempo real PCR análisis
la expresión de miR-375 se ensayada mediante la Taqman MicroARN ensayos (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) con cebadores específicos (P /N: 4373151, Applied Biosystems). reacción de transcripción inversa se llevó a cabo a partir de 10 ng de RNA total usando los cebadores en bucle. Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) se realizó utilizando el protocolo Taqman microARN ensayos estándar de sistema de detección de PCR en tiempo real ABI7500. Se utilizó el método de cuantificación relativa ΔΔCt para determinar la expresión de los genes miARN. El Ct es el número de ciclo fraccional al que la fluorescencia de cada muestra pasa el umbral fijo. El Ct se calcula restando el Ct de ARNsn U6 (RNU6B, P /N: 4373381, Applied Biosystems) de la Ct de la miARN de interés. El ΔΔCt se calculó restando el Ct de la muestra de referencia (emparejado no malignas de tejidos de muestras quirúrgicas, los tejidos normales y GES-1 de células de las líneas celulares de cáncer gástrico) de la Ct de cada muestra. cambio veces se determinó como 2
-ΔΔCt.
Migración y ensayo de invasión
Las células fueron transfectadas con 20 nM de pre-miR-375 o negativo de control mediante transfección agente (Ambion, TX, EE.UU.) siguiendo el protocolo de fabricación en placas de 24 pocillos. 24 h después de la transfección, ensayo de migración Transwell y ensayo de invasión de Matrigel se realizaron por separado utilizando 24 pocillos Transwell inserta con 8 micras de tamaño de poro (Corning Costar Corp). Para el ensayo de migración Transwell, 2 × 10
4 AGS o 3 × 10
4 células MGC-803 en suspensión en 100 l de medio de cultivo correspondiente sin suero bovino fetal (FBS) se cargaron en la cámara superior de transwell inserto con no membrana recubierta. Para el ensayo de invasión Matrigel, 5 × 10
4 AGS o células MGC-803 se sembraron en 100 medio libre de suero l en la cámara de Matrigel recubierto superior en su lugar. En ambos ensayos, la cámara inferior se contenía 600 l de medio con FBS al 20%. Las células se dejaron luego a migrado o invadido durante 12 horas a 37 ° C. Las células que migraron o invadieron en la cámara inferior se fijaron, se tiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:1000), se visualizaron bajo microscopio de contraste de fase y se fotografiaron. Número total de células que migraron o invadidas fue contada por el software IPP (Image-Pro Plus 6.0). Todos los experimentos se repitieron de forma independiente al menos tres veces.
arañazos cicatrización de heridas ensayo
Las células fueron transfectadas como se describió anteriormente y se dejaron crecer hasta confluencia. Las células fueron cultivadas en un medio correspondiente sin FBS durante 12 h y luego se rascaban con una punta de pipeta. áreas de la herida se marcan y se fotografiaron a las 0 h, 12 h, 24 hy 36 h, respectivamente. La tasa de migración de las células se evaluó por tanto fotografiar y cuantificar la distancia migrada de células se ha movido desde el borde de la herida hacia el centro utilizando IPP sistema 6.0. Todos los experimentos se repitieron tres veces.
Las construcciones
Para producir el plásmido pGL3-375pro, la secuencia de ADN que contiene pri-miR-375 (primaria miR-375), el promotor fue amplificado por RT-PCR utilizando los cebadores 5 'ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT AAG CGA CTC-3' y 5'-ATCG AAGCTT ACG CCT TGG AGC TTG TCC-3 'y después se clonó en el vector pGL3-basic (Promega). Para construir el plásmido que expresa Snail en las células, la secuencia de marco de lectura abierto (ORF) de Snail se clonó en el vector de expresión de mamíferos pEGFP-C1 (Clontech, CA, EE.UU.) utilizando los cebadores 5 'ATCG AA GCT TCG ATG CCG CGC TCT TTC CTC G-3 'y 5'-GGA TCC ATCG TCA GCG GGG ACA TCC TGA GCA-3'. Para la expresión ectópica de JAK2 marcado con FLAG, JAK2 humano con la región de codificación fue clonado en pCMV-Tag 2C vector. Para construir el plásmido que expresa miR-375 en células de mamíferos, los oligonucleótidos apareados en base a la secuencia primaria de HAS-miR-375 y sus regiones flanqueantes se clonó en el vector de expresión de mamíferos pEGFP-C1 (Clontech, CA, EE.UU.). Todos los constructos se confirmaron por secuenciación.
Luciferase ensayo
Cuarenta mil células se sembraron en placas de 24 pocillos 24 h antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con cualquiera de pGL3-375pro o vector pGL3-Basic. El vector de PRL-TK (Promega, WI, EE.UU.) que contiene
Renilla luciferasa
fue también co-transfectó como control de referencia. Firefly y
Renilla
actividades de luciferasa se midieron mediante el uso de Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega) 24 h después de la transfección. Firefly luciferase actividad se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla.
Los análisis estadísticos
Los datos se representan como media ± error estándar (SE) de tres experimentos independientes. Las relaciones entre la expresión de miR-375 y la expresión de Snail ARNm fueron exploradas por
coeficiente de correlación de Pearson
, que se describió anteriormente [20]. Estudiante de
t-test
y
X
2 pruebas se realizaron para determinar la significación estadística.
P Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
miR-375 es downregulated dramáticamente en células de cáncer gástrico y los tejidos de pacientes con metástasis positivos
.
Para averiguar si el miR-375 se asocia con metástasis de cáncer gástrico, se detectó por primera vez el nivel de expresión de miR-375 en el cáncer gástrico tejidos primarios de pacientes metástasis positiva y sin metástasis. Cuando se compara con muestras de pacientes libres de metástasis, el nivel de expresión de miR-375 fue la reducción de casi el doble en los tejidos de pacientes de metástasis positivos (
P
& lt; 0,05) (Figura 1A). En consonancia con este resultado, el nivel de expresión de miR-375 en líneas de células gástricas se asoció negativamente con la capacidad de migración de las células y la invasión. Las propiedades metastásicas de líneas de células epiteliales gástricas (GES-1, MGC-803, AGS) se caracterizaron. Como se muestra en la Figura 1C y 1D, migración y la invasión capacidades de la línea celular AGS fueron mayores que la de MGC-803 y GES-1 líneas celulares (
P
& lt; 0,01). A la inversa, miR-375 expresión en células AGS fue menor que la de MGC-803 y las células GES-1 (
P
& lt; 0,01) (Figura 1B). En una palabra, el miR-375 es downregulated en tejidos de cáncer gástrico de pacientes con metástasis positiva y en células de cáncer gástrico con mayores capacidades de migración e invasión. Esta correlación indica que el miR-375 podría tener un papel causal en la metástasis del cáncer gástrico.
La expresión de miR-375 fue investigado por QRT-PCR. (A) veces los cambios relativos (tejido tumoral /tejido normal, T /N) entre las muestras de cáncer gástrico en pacientes sin metástasis o -positivas y sus tejidos adyacentes no malignas. El nivel de expresión de miR-375 fue la reducción de casi el doble en los tejidos de los pacientes 30 metástasis-positiva que la de 9 pacientes sin metástasis,
P * Hotel & lt; 0,05. (B) El nivel de expresión de miR-375 en tres líneas de células epiteliales gástricas humanas con diferentes capacidades de migración e invasión. El nivel de expresión de miR-375 en células AGS fue menor que la de MGC-803 y las células GES-1.
P ** Hotel & lt; 0,01. Las capacidades de migración y la invasión de las tres líneas de células epiteliales gástricas (C, D) se midieron con cámaras transwell. Las fotos son representativas de los campos migrado células invasoras (D) en la membrana (C) o. Los gráficos de barras representan el número medio de células en la parte inferior de la membrana ± SE. **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con no maligno de células del epitelio gástrico GES-1
La sobreexpresión de miR-375 inhibe las células de cáncer gástrico migración y la invasión
.
Para explorar el papel de miR-375 en la metástasis del cáncer gástrico, se analizó el efecto de la sobreexpresión de miR-375 en la migración y la invasión de AGS y el MGC-803 células de cáncer gástrico con baja expresión endougenous de miR-375. Las células fueron transfectadas con cualquiera de miR-375 precursor (miR-375) o los oligonucleótidos de control de precursores-negativo (negativo) o ninguno de los anteriores (Mock). El ensayo de migración Transwell mostró que la sobreexpresión de miR-375 inhibió en gran medida la migración de AGS (Figura 2A, 2B) y MGC-803 células (Figura S1A, S1B). En consonancia con estos resultados, el ensayo a los arañazos cicatrización de la herida también reveló que las velocidades de AGS (Figura 2C, 2D) y el MGC 803-células (Figura s1c, S1D) de migración hacia la zona de la herida se redujo significativamente después de la sobreexpresión de miR-375 . Empleamos más ensayo de invasión de Matrigel y encontramos que la sobreexpresión de miR-375 dio lugar a una reducción de más de dos veces en las propiedades invasivas de AGS (Figura 3A, 3B) y MGC-803 células (Figura 3C, 3D). En conjunto, estos resultados indican que la sobreexpresión de miR-375 es suficiente para inhibir tanto la migración y la invasión capacidades de células de cáncer gástrico.
células AGS transfectadas con el miR-375 precursora (375-MIR), control negativo (negativo ) o ninguno de los anteriores (Mock) fueron sometidos a ensayo Transwell migración (a) y los arañazos cicatrización de heridas análisis (C). (A) campos representativos de células migradas en la parte inferior de la membrana que se fijaron y tiñeron con DAPI. (B) Número total de células migradas en la parte inferior de la membrana fue contada por el software IPP 6.0. (C) La migración de las células a la zona herida fue fotografiado por microscopía a las 0 h, 12 h, 24 hy 36 h después de la herida. Las líneas de puntos indican las zonas que carecen de células. (D) La tasa de migración se examinó mediante la medición de la distancia de células se ha movido desde el borde de la herida hacia el centro en 36 h después del rascado. Los datos se presentan como media ± SE de al menos tres experimentos independientes. Bares, 50 m. **
P
. & Lt; 0,01
AGS y células MGC-803 transfectadas con pre-miR-375 (375-MIR), control negativo (negativo) o ninguna de las anteriormente (Mock) fueron sometidos a análisis de la invasión de Matrigel. (A, C) se muestran campos representativos de las células de la cámara inferior a las 12 h después de la invasión. Las barras de escala, 50 m. (B, D) El número total de células invasoras en la parte inferior de la membrana fue contada por el IPP 6.0. Los datos se muestran como media ± SE de tres experimentos independientes. **
P
. & Lt; 0,01
JAK2 regulados por el miR-375 está implicado en la regulación de la migración de las células de cáncer gástrico y la invasión
Nuestro estudio previo ha JAK2 identificado como un objetivo abajo de miR-375 [20]. En este caso, estamos interesados en estudiar si JAK2 está implicado en la regulación de la migración de las células de cáncer gástrico y la invasión. Se empleó la técnica de ARNi basado en vectores para agotar JAK2 endógena y se encontró que las actividades de migración y la invasión de AGS (Figura 4) y las células MGC-803 (Figura S2) fueron ambos muy inhibida. Al mismo tiempo, se estudió si JAK2 podría contrarrestar el efecto de la inhibición de las células cancerosas migración y la invasión gástrica causada por el miR-375. Las células fueron co-transfectadas con el miR-375 y, o bien precursor JAK2 sobreexpresión del vector (miR-375 + JAK2) o el control de vector vacío (miR-375 + Vec). La sobreexpresión de JAK2 promueve claramente la migración y la invasión de células como se muestra en la Figura 4 y S2. Así, en consonancia con nuestra hipótesis, miR-375 puede inhibir la migración y la invasión de células de cáncer gástrico en parte por la orientación JAK2. Hemos determinado además que JAK2 sobreexpresión no tiene efecto en el nivel de expresión de miR-375, como se muestra en la Figura S3. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que la desregulación de miR-375 interfiere con otros objetivos necesarios para la migración de las células de cáncer gástrico y la invasión
.
Las células transfectadas con los vectores u oligonucleótidos indicados fueron sometidos a la migración Transwell (A) o ensayo de invasión de Matrigel (C). Los experimentos de rescate para el miR-375 sobreexpresión se realizaron por la expresión ectópica de JAK2 sin 3'-UTR en las células tratadas-miR-375. (A, C) se muestran campos representativos de las células de la cámara inferior a las 12 h después de la migración o invasión. Las barras de escala, 50 m. (B, D) El número total de células que migraron o invasivos de nueve campos elegidos al azar fue contado por IPP 6.0. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
Caracol regula a la baja la expresión de miR-375
Los resultados anteriores indican que miR-375 puede ser el blanco de ciertos factores de transcripción que están asociados con la invasión del cáncer y el proceso de metástasis. Naturalmente, nos centramos en cómo se regula la expresión de miR-375. En primer lugar, encontramos una región de ADN conversado aguas arriba del pri-miR-375 gen, que se dice que contiene el promotor del gen pri-miR-375 [21]. A continuación realizó programa consite (http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite) y se encontró que había seis sitios de unión del factor de transcripción Snail en la región de ADN (Figura 5A). La región de ADN se clonó en el vector pGL3-basic (Promega) (pGL3-375pro) para medir la actividad del promotor. En consonancia con los datos del grupo Walker [21], nuestros resultados mostraron que esta región de ADN que contiene el promotor del gen pri-miR-375 y es capaz de dirigir la expresión de luciferasa (Figura 5B). La actividad de luciferasa fue reprimida eficazmente cuando pGL3-375pro vector se co-transfectadas con el vector de expresión de Snail (caracol), pero no cuando se co-transfectadas con el vector de control vacío (Mock) (Figura 5C). Por otra parte, la sobreexpresión del caracol podría reducir el nivel de expresión de miR-375 en un 46% (Figura 5D). Con el fin de determinar la relevancia clínica de estos resultados, hemos correlacionado aún más el nivel de expresión de miR-375 con el nivel de RNAm de Snail en los mismos pacientes con cáncer gástrico. Como se muestra en la Figura 5E, se encontró una correlación inversa marcada entre el nivel de expresión de miR-375 y mRNA Snail (
P
& lt; 0,05, r = -0,6). Por lo tanto, estas observaciones demuestran que Snail es un potencial regulador de aguas arriba de miR-375 expresión.
Análisis (A) utilizando el programa de Bioinformática consite reveló posibles sitios de unión y se encontró que había seis puntos de unión de factor de transcripción Snail en la región de ADN que contiene el promotor del gen de pri-miR-375. (B) La región promotora putativa del gen miR-375 se ligó aguas arriba al gen informador de luciferasa de luciérnaga en el vector pGL3-basic promotor de menos (pGL3-375pro), resultando en un aumento de 20 veces en la actividad luciferasa. (C) La actividad de luciferasa de pGL3-375pro en las células transducidas por el vector de caracol. La actividad de luciferasa fue reprimida de manera eficiente cuando pGL3-375pro vector fue co-transfectadas con el vector de expresión de Snail. (D) El nivel de expresión de miR-375 en las células transducidas por Caracol que sobreexpresan vectorial. Caracol sobreexpresión podría reducir el nivel de expresión de miR-375 en un 46%. (E) la correlación inversa entre la expresión de miR-375 y el nivel de RNAm de Snail en tejidos de cáncer gástrico primario. Una correlación estadísticamente significativa entre el miR-375 y Caracol fue observada por
método de Pearson con un coeficiente de correlación de -0.6. **
P
. & Lt; 0,01
Caracol está implicado en la regulación de la migración de las células de cáncer gástrico por la orientación de miR-375
Para aclarar aún más la correlación de miR-375 y Caracol, Caracol se estudió si está implicado en la regulación de la migración de las células de cáncer gástrico por la orientación de miR-375. Se empleó la técnica basada en vectores para regular al alza el nivel de expresión del caracol y se encontró que la actividad de migración de las células AGS (Figura 6) fueron promovidos en gran medida. Al mismo tiempo, se estudió si caracol podría contrarrestar el efecto de la inhibición de las células del cáncer gástrico causado por la migración de miR-375. Las células fueron co-transfectadas con el miR-375 vector de sobreexpresión y caracol vector de sobreexpresión (Caracol + miR-375). La sobreexpresión de Snail claramente las células promueve la migración y podría contrarrestar parcialmente el efecto de inhibición de las células de cáncer gástrico migración causada por miR-375, como se muestra en la figura 6. Así, en consonancia con nuestra hipótesis, Snail puede inhibir la migración de células de cáncer gástrico en parte por la orientación miR-375.
las células transfectadas con los vectores indicados fueron sometidos a ensayo de migración Transwell. (A) se muestran campos representativos de las células de la cámara inferior a las 12 h después de la migración. Las barras de escala, 50 m. (B) El número medio de células migraron de nueve campos elegidos al azar fueron contados por IPP 6.0. **
P
. & Lt; 0,01
Discusión
MiRNAs se han reportado para regular la migración tumoral, invasión y metástasis incluyendo el cáncer gástrico [6], [22 ]. MiR-375 se ha demostrado previamente para jugar un papel importante en la proliferación de células de cáncer gástrico [20], [23]. Sin embargo, los mecanismos de regulación no están claros. En el presente estudio, hemos explorado aún más la función y los mecanismos potenciales de miR-375 en la migración y la invasión de células de cáncer gástrico. Se encontró que la sobreexpresión de miR-375 inhibió la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico en parte por la orientación JAK2. Han pasado más de una década desde JAK2 clonado por primera vez [24]. JAK2 se expresa en casi todos los tejidos y se asocia con muchos patológico progresa. Aunque es evidente que JAK2 actúa como un oncogén en ambos trastornos mieloproliferativos y algunos tumores sólidos [25], [26], [27], no participación directa de JAK2 en la migración del cáncer, se ha informado de la invasión o la metástasis. Emocionante, nuestro estudio demostró por primera vez que la anulación de JAK2 por RNAi inhibe las actividades de migración y la invasión de células de cáncer gástrico similares a la de la sobreexpresión de miR-375. Además, la sobreexpresión de JAK2 podría promover la migración y la invasión de células de cáncer gástrico. Por lo tanto, se asumió que JAK2 podría contrarrestar el efecto inhibidor sobre la migración y la invasión de células causada por el miR-375. Dado el papel crítico de miR-375 y JAK2 como reguladores maestros en la proliferación de células de cáncer gástrico, la migración y la invasión, tanto de ellos tiene un potencial terapéutico en el tratamiento del cáncer gástrico. Por lo tanto, queda por investigar si hay otros objetivos participan en el miR-375 metástasis gástrica mediada.
De particular interés, se estudiaron más a fondo cómo miR-375 implicados en la carcinogénesis gástrica. Aunque existe una evidente que la metilación del ADN y la desacetilación de las histonas son los posibles mecanismos implicados en la regulación a la baja de miR-375 en el cáncer gástrico [23]. Los mecanismos subyacentes de miR-375 desregulación en la metástasis del cáncer gástrico son aún poco conocidos. No hay posibilidad de un bloqueo de la transcripción de la expresión génica miR-375 en este proceso. Aquí nos muestran que la metástasis del factor de transcripción asociado Caracol es un potencial regulador de aguas arriba de la expresión de miR-375. Snail es una proteína de dedo de cinc de unión a ADN y se ha informado como represor transcripcional [28]. evidencias a acumular muestran que Snail se une a las cajas E en el promotor de la E-cadherina y reprime su transcripción para regular el desarrollo invasión tumoral [29]. Por otra parte, se encontró que la sobreexpresión de Snail en los cánceres de estar asociado con la metástasis de los ganglios linfáticos, la recaída del tumor y el pronóstico [30], [31], [32], [33], [34], [35]. En consonancia con otros informes, nuestro estudio encontró que Snail mRNA se sobreexpresa en tejidos de cáncer gástrico en comparación con sus tejidos adyacentes no malignas. Como la actividad del promotor de miR-375 podría ser suprimida por Snail y la sobreexpresión de Snail podría reducir el nivel de expresión de miR-375 de manera significativa, encontramos además una correlación inversa marcada entre el nivel de expresión de miR-375 y el nivel de Snail mRNA en el cáncer gástrico muestras. Caracol se encuentra también estar implicado en la regulación de la migración de las células de cáncer gástrico por la orientación de miR-375.
En conclusión, hemos identificado que el miR-375 se expresa de manera aberrante en los tejidos de cáncer gástrico de pacientes con metástasis positivos o células de cáncer gástrico con mayor migración y la invasión de las actividades en comparación con los tejidos de los pacientes sin metástasis o línea de células epiteliales gástricas no invasiva GES-1, respectivamente. La sobreexpresión de miR-375 reduce las actividades de migración células de cáncer y la invasión gástrica al menos parcialmente, por la orientación JAK2. Por otra parte, Caracol puede ser un regulador de aguas arriba de miR-375 que regula negativamente la expresión de miR-375 y estuvo involucrado en la regulación de la migración de las células de cáncer gástrico por la orientación de miR-375. En conjunto, nuestros resultados proporcionan una vía no descrita, en el que un factor de transcripción Snail regula la expresión de miR-375, que suprime su JAK2 objetivo directo, lo que lleva a inhibir la migración y la invasión de células de cáncer gástrico. Nuestros datos indican que la restauración de miR-375 o la inhibición de caracol o JAK2 puede ser estrategias terapéuticas útiles para el tratamiento del cáncer gástrico. Sin duda, va a ser muy interesante para explorar más a fondo la posible eficacia de esas moléculas diana de miR-375, JAK2 o Caracol en el tratamiento del cáncer gástrico. Otro tema interesante para la investigación futura será la identificación de otros posibles objetivos de miR-375, y, más concretamente, la posible participación de JAK2 en la metástasis del cáncer gástrico.
Apoyo a la Información
Figura S1.
La expresión ectópica de miR-375 suprime la migración de las células MGC-803. MGC-803 células transfectadas con el miR-375 precursora (miR-375), control negativo (negativo) o ninguno de los anteriores (Mock) se sometieron a ensayo de migración Transwell (A) y los arañazos cicatrización de heridas análisis (C). (A) campos representativos de las células invasoras en la parte inferior de la membrana que fueron fijadas y teñidas con DAPI. (B) Número total de células migradas en la parte inferior de la membrana fue contada por el software IPP 6.0. (C) La migración de las células a la zona herida fue fotografiado por microscopía a las 0 h, 12 h, 24 hy 36 h después de la herida. Las líneas de puntos indican las zonas que carecen de células. (D) La tasa de migración se examinó mediante la medición de la distancia de células se ha movido desde el borde de la herida hacia el centro en 36 h después del rascado. Los datos se presentan como media ± SE de al menos tres experimentos independientes. Bares, 50 m. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s001 gratis (TIF)
figura S2 .
La sobreexpresión de JAK2 invierte miR-375 inducida por la inhibición de las células MGC-803 migración y la invasión. Las células transfectadas con los vectores u oligonucleótidos indicados se sometieron a la migración Transwell (A) o ensayo de invasión Matrigel (C). Los experimentos de rescate para el miR-375 sobreexpresión se realizaron por la expresión ectópica de JAK2 sin 3'-UTR en las células tratadas-miR-375. (A, C) se muestran campos representativos de las células de la cámara inferior a las 12 h después de la migración o invasión. Las barras de escala, 50 m. (B, D) El número total de células que migraron o invasivos de nueve campos elegidos al azar fue contado por IPP 6.0. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s002 gratis (TIF)
Figura S3 .
JAK2 no tiene ningún efecto sobre la expresión de miR-375. Las células AGS y MGC-803 fueron transfectadas con el vector de JAK2 sobreexpresión o vector control y sometidos a análisis de RT-PCR para el nivel de expresión de miR-375. El nivel de ARN U6 se utilizó como control
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s003 gratis (TIF)