Extracto
caracol, un potente represor de la expresión de E-cadherina, juega un papel clave en la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) en el cáncer epitelial. Recientemente, EMT y programas stemness se encuentran unidos entre sí. En el presente estudio, se estudió la expresión de Snail y su contribución a la expresión de células madre del cáncer (CSC) marcador, invasividad, la auto-renovación, clonogenicidad y tumorigenicidad de las células del cáncer pancreático. Nuestros resultados muestran que Snail se expresa altamente en el CSC
alta línea celular Panc-1. Estable, ARN corto horquilla (shRNA) mediada por Caracol caída redujo la invasión en células Panc-1, en consonancia con el aumento de la expresión de E-cadherina y su translocación desde el núcleo hasta la membrana. silenciamiento Snail en Panc-1 también inhibió la expresión CSC marcador ALDH, junto con la esfera de la disminución y la capacidad de formación de colonias, que era altamente consistente con la expresión de factores de transcripción de células madre asociadas como Sox2 y Oct4. En modelos de xenoinjerto de ratón, desmontables de Snail condujo a una reducción del número de ratones portadores de tumores y un tamaño medio reducido de los tumores, que tenía una fuerte tinción de membrana de E-cadherina y más ligero tinción de Oct4. En conjunto, estos resultados implican Caracol es necesaria para el mantenimiento del fenotipo de células madre-como en el cáncer de páncreas, y la inhibición de caracol podría ser una estrategia eficaz para tratar el cáncer de páncreas apuntando a las CSC
Visto:. Zhou W, Lv R, Qi W, Wu D, Xu Y, Liu W, et al. (2014) Caracol contribuye al mantenimiento de la célula células-madre similares a diferentes fenotipos de cáncer pancreático humano. PLoS ONE 9 (1): e87409. doi: 10.1371 /journal.pone.0087409
Editor: Michael Klymkowsky, Universidad de Colorado, Boulder, Estados Unidos de América
Recibido: July 9, 2013; Aceptado: 24 Deciembre 2013; Publicado: 29 Enero, 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhou, et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [81001095]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático ductal adenocarcinoma es un cáncer epitelial altamente agresivo con una tasa de supervivencia a 5 años reportada de aproximadamente el 5% [1]. Sólo el 20% de los pacientes con cáncer de páncreas son elegibles para la resección quirúrgica, y la enfermedad metastásica se desarrolla con frecuencia, incluso después de la cirugía, mientras que la quimioterapia actual y radio-terapias son en gran medida ineficaces [2]. Por lo tanto, La comprensión de los eventos moleculares que subyacen al desarrollo y progresión del cáncer de páncreas se necesita con urgencia, lo que puede ser la clave para el desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces y novedosos.
Una cantidad cada vez mayor de la evidencia científica indica que los tumores contienen una pequeña subpoblación de células, es decir, las células cancerosas madre-como (CSC) o células iniciadoras del cáncer (AIC), que presentan una capacidad de auto-renovación, resistentes a la quimioterapia convencional y son responsables de fracaso de la terapia, la recaída del cáncer y la metástasis [3 ]. Aunque la hipótesis de los CAC sugiere que los tumores pueden surgir a partir de células madre o progenitoras, los estudios de algunos laboratorios indican que el epitelio-mesenquimal transición (EMT), un proceso de desarrollo en el que las células pierden características epiteliales y adquieren propiedades mesenquimales tales como aumento de la motilidad y la invasión, puede dotar a las células con el vástago de células como las características [4] - [6].
EMT es inducida por la represión de la expresión de e-cadherina por los reguladores de la EMT como caracol, barra, y Twist. La familia Snail de zinc-finger represores transcripcionales reprime directamente E-cadherina in vitro e in vivo a través de una interacción entre su región COOH-terminal y la secuencia 5'-CACCTG-3 'en el promotor de E-cadherina [7]. En las células de cáncer colorrectal humano, se informó de la sobreexpresión de caracol para inducir no sólo EMT sino también un fenotipo CSC-similares, que mejora la migración celular y la invasión in vitro y un aumento en la formación de metástasis in vivo [8]. Los estudios también han demostrado que Snail juega un papel esencial en el proceso de la progresión y la metástasis de cáncer de páncreas humano [9], [10]. En relación clínica, la sobreexpresión del caracol ha sido previamente asociado con una peor pronóstico y un fenotipo más agresivo en muchos tumores malignos [11] - [13]. Sin embargo, existen pocos informes sobre la relación entre la expresión de Snail y la ganancia de las propiedades de células madre del cáncer de páncreas. por lo tanto, se evaluó la función de la Caracol en la expresión de marcadores de células madre, la capacidad de auto-renovación en la línea celular de cáncer de páncreas en la formación vitro y los tumores de xenoinjerto in vivo. Nuestro trabajo revela que la regulación génica mediada por el caracol puede apoyar el crecimiento del cáncer pancreático humano al mantener el compartimiento de células madre del cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
El pancreática humana líneas celulares de cáncer Panc-1 y BxPC-3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células se cultivaron y mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco /Invitrogen, CA), penicilina-estreptomicina (Flow Laboratories, Rockville, MD). Ambas líneas celulares se mantuvieron en una atmósfera humidificada a 37 ° C con 5% de CO2. la morfología celular bruta de la presencia o ausencia de características morfológicas consistentes con EMT fue evaluada por dos observadores ciegos a las condiciones de tratamiento. Imágenes de líneas celulares fueron tomadas usando un microscopio Nikon Eclipse TS100 invertida y la cámara Pro-MicroScan (Oplenic).
Evaluación de la actividad de aldehído deshidrogenasa
Aldefluor sustrato (2,5 l, Aldagen, Inc., Durham, NC) se añadió a 1 × 10
6 células tumorales en tampón de ensayo 500 l y se incubaron durante 60 min a 37 ° C. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tratamiento de células con 5 l de la inhibidor de ALDH dietilamino-benzaldehído (DEAB) sirvió como control negativo. Lentiviral vectores sin fluorescencia se utilizaron para la transfección de células durante el análisis FACS.
Esfera ensayo de formación de
ensayo de formación de Esfera se realizó como se describe en otra parte [14]. En resumen, las células se sembraron en seis pocillos placas de fijación ultrabajas (Corning Inc., Corning, NY) a una densidad de 1.000 células /ml en DMEM suplementado con 1% de suplemento N2 (Gibco, Grand tierra, NY), 2% B27 suplemento (Gibco, Grand Island, NY), 20 ng ml de factor de crecimiento /de plaquetas humano (Sigma-Aldrich), 100 ng del factor de crecimiento /ml epidérmico (PeproTech, Rocky Hill, NJ) y 1% de antibiótico-antimicótico (Invitrogen) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO2. culturas esfera se pasaron después 7~10 días. Para esferas de paso, fue retirado de los medios y se recogieron las esferas y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min en 0,05% de tripsina (Solarbio, Pekín, China) y se observa bajo el microscopio para verificar la disociación. Las células obtenidas a partir de la disociación se tamizaron a través de un filtro de 40 micras y contados por el contador utilizando colorante azul de tripano antes de resiembra.
Ensayo en agar blando
Para evaluar el potencial clonogénico, se llevó a cabo el ensayo de formación de colonias como sigue. Cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos se revistió con 2 ml de mezcla de agar inferior (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,6% (w /v) de agar). Después de que la capa inferior solidificó, 2 superior ml agar mezcla de medio (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,3% (w /v) de agar) que contenía 1 × 10
se añadió 4 células, y se incubaron los platos a 37 ° C durante 3 semanas. Las placas se tiñeron con 0,5 ml de 0,005% de cristal violeta para 1 h y luego un microscopio de disección se utilizó para contar el número de colonias de & gt;. 50 células [15]
Transwell ensayo de invasión
Para el ensayo de invasión, se utilizó el sistema de placa Transwell de 24 pocillos con una membrana de filtro de policarbonato de tamaño de poro 8 mm (Corning Costar, Corning, NY). 1 × 10
se añadieron 5 células en 100 medio libre de suero l a la cámara superior recubierta con Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA). La cámara inferior contenía FBS al 10% que contenían medio. Las células se incubaron durante 48 h y las células que habían invadido través de la membrana recubierta con Matrigel se fijaron y tiñeron con violeta de cristal, y luego contadas bajo un microscopio de luz en cuatro campos al azar de una manera ciega.
tiempo real análisis de RT-PCR para la expresión génica
en tiempo real el análisis RT-PCR, el ARN total de células se extrajo usando el kit de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA fue sintetizado utilizando cantidades equivalentes de ARN total (1 g) con cebadores aleatorios en un 20 l mezcla de reacción de la transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI). Los cebadores de PCR en tiempo real fueron diseñados y adquiridos de Ruisai Inc (Shanghai, China) de la siguiente manera:
caracol, hacia adelante (5'-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3 ')
e inversa (5' ATCTCCGGAGGTGGGATG-3 ');
Slug, hacia adelante (5'-AGCGAACTGGACACACATAC-3')
e inversa (5'-TCTAGACTGGGCATCGCAG-3 ');
1 torsión , hacia adelante (5'-CACTGAAAGGAAAGGCATCA-3 ')
e inversa (5'-GGCCAGTTTGATCCCAGTAT-3');
ZEB1, hacia adelante (5'-CGAGTCAGATGCAGAAAATGAGCAA-3 ')
e inversa (5'-ACCCAGACTGCGTCACATGTCTT-3 ');
ZEB2, hacia adelante (5'-GAGTTGATGCCTCGGCTATTGC-3')
e inversa (5'-CTGGACATTGAGCTGCTTCGATC-3 ') ;.
GAPDH, hacia adelante (5'-GGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3 ')
e inversa (5'-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3')
La amplificación se llevó a cabo en una volumen total de 20 ul que contiene 1 ul de cada cebador, 10 ul LightCycler FastStart DNA Maestro SYBR green I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) y 1 ul de 01:10 cDNA diluido. Las reacciones de PCR se prepararon por duplicado y se calienta a 95 ° C durante 2 min seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, hibridación a 55 ° C durante 20 seg, y extensión a 72 ° C durante 20 seg. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se calcularon sobre la base de
método ΔΔCt. El cambio n veces en la expresión ARNm se determinó según el método de 2-
ΔΔCT.
Lentiviral mediada por ARNi de Snail
El pcDNA6.2-GW /EmGFP-MIR vector fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). shRNAs de doble cadena Caracol de orientación humana fueron diseñados por el bloque i-T ™ RNAi Designer. La secuencia diana era 1 5'-GCCTAACTACAGCGAGCTG-3 '; dirigida secuencia 2 era 5'-GGATCTCCAGGCTCGAAAG-3 '. Ambas secuencias específicas se verifican tal y como específico para Snail por la búsqueda BLAST contra el genoma humano. Control Universal no director shRNA (secuencias: 5'-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 '; 5' CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC-3 ') se utilizó como control negativo. shRNAs se sintetizaron y se clonó en pcDNA6.2-GW /EmGFP-MIR, a continuación, transfiere en el plásmido de expresión lentiviral pLenti6 /V5-DEST con la tecnología de recombinación Gateway. lentiviral producción se realizó mediante transfección de células 293 T con shRNA o plásmido de control negativo y el envasado de la mezcla (Invitrogen) en presencia de POLOdeliverer ™ 3000 reactivo de transfección (Ruisai Inc, Shanghai, China). Los sobrenadantes se recogieron 48 h después de la transfección y luego se filtraron; los títulos virales se determinaron luego por PCR en tiempo real. células subconfluentes se infectaron con lentivirus a una multiplicidad de infección de 50 en presencia de 8 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich). Se seleccionaron Panc-1 células con silenciamiento estable de gen Snail con 2 ug /ml de blasticidina para 4 semanas. Luego, las células se cultivaron con 1 ug /ml Blasticidin. Otro control negativo shRNA plásmido (sc-108060) de Santa Cruz Biotechnology, que codifica una secuencia shRNA revueltos, se utilizó para la transfección transitoria de acuerdo con el protocolo.
Análisis de transferencia Western
Para células enteras la extracción de proteínas, las células se lisaron con tampón RIPA enfriado con hielo que contenía PMSF 1 mM y se centrifugó a 14.000 g durante 5 min. El sobrenadante que contiene la proteína aislada se cuantificó mediante un ensayo de Bradford modificado comercialmente disponible (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). muestras de proteína de transferencia de Western se prepararon hirviendo proteínas aisladas con buffer de desnaturalización de la muestra. Igual cantidad de proteína se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon a continuación con leche en polvo desnatada al 5% en TBS y 0,1% de Tween 20 durante 1 h y se sondaron con el anticuerpo primario apropiado durante la noche a 4 ° C. A continuación, las membranas se lavaron y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante apropiada (Sigma Aldrich, St Louis, MO) durante 1 h a temperatura ambiente. a continuación, las membranas se lavaron y bandas de proteínas se visualizaron mediante el uso de un kit comercialmente disponible de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Thermo Scientific). Para verificar la precisión de la carga de proteína aislada de lisado de células enteras, los blots fueron despojados, se lavaron y se volvieron a sondar con el anticuerpo GAPDH (Bioworld) como control de carga. Las imágenes se visualizan usando el sistema ECL de detección (Amersham, Arlington Heights, IL). Los anticuerpos utilizados para los análisis de Western blot fueron los siguientes: mAb de conejo anti-Snail, mAb de conejo anti-E-cadherina, mAb de conejo anti-vimentina, mAb de conejo anti-Bmi1, conejo mAb anti-Nanog, mAb de conejo anti-Oct4, conejo mAb anti-Sox2 (Cell Signaling Technology, Inc.). Densitometría de las transferencias Western se analizó usando el software Image J.
La inmunofluorescencia
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio, se fijaron en formaldehído al 4% en PBS durante 10 min, se permeabilizaron con 0,2% Triton X -100 para 10 min, y se bloquearon en suero de cabra al 10% en PBS-0,2% de Tween durante 1 h. Los cubreobjetos se incubaron con anticuerpo E-cadherina (BD Biosciences, 1:200 dilución) en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar las células con PBS-0,2% de Tween, se incubaron las células durante 1 h con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo Alexa 594 (dilución 1:1000; Invitrogen). Los núcleos se contratiñeron con DAPI. Los portaobjetos se lavaron extensamente con PBS y se montaron con Fluoromount-G. Las muestras fueron fotografiados utilizando microscopio de inmunofluorescencia.
Análisis in vivo del crecimiento del tumor
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang (ZYXK2010-0149). Se inyectaron por vía subcutánea células individuales suspensiones (2 × 10
5 en un volumen total de 100 l de 1/1 (v /v) de PBS /Matrigel) en el derecho y el izquierdo del área midabdominal de ratones desnudos macho (/c cepa BALB ) de 8 semanas. El tamaño del tumor seguimiento diario con calibradores y se calculó el volumen del tumor según la fórmula (longitud x anchura
2) /2. Los animales fueron sometidos a autopsia a los 28 días después de la implantación de células y el crecimiento tumoral se evaluó.
El análisis inmunohistoquímico de los tejidos de xenoinjerto
Los tumores subcutáneos formados en ratones fueron fijadas en 10% formalina tamponada con fosfato y se incrustan en parafina. secciones gruesas 4-micras se desparafinaron utilizando xileno, e hidratadas por una serie graduada de lavados de etanol. La actividad peroxidasa endógena se inactivó mediante la 10-min de incubación en 3% H
2O
2. Después de la incubación con la solución durante 30 minutos de bloqueo, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario a partir de BD Biosciences (anti-Snail, 1:200 dilución; anti-E-cadherina, dilución 1:200, y anti-Oct4, 1:300 dilución) para 1 h, un anticuerpo secundario biotinilado durante 20 min y luego con estreptavidina peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 10 min. El anticuerpo se visualizó con diaminobencidina cromógeno (DAB), y las secciones se counterstained con H & amp; E
El análisis estadístico
Los experimentos se repitieron al menos dos veces.. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. Diferencias estadísticamente significativas se determinaron mediante la prueba t de Student para muestras independientes cuando sea apropiado utilizando el software SPSS análisis estadístico (versión 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL). Las diferencias significativas entre los grupos se calcularon en P & lt;. 0.05
Resultados
expresión de Snail y tallo ALDH marcador celular en líneas celulares pancreáticas
Bajo el microscopio, BxPC-3 células fueron epitelial morfológicamente en la naturaleza. En contraste, las células Panc-1 eran poblaciones mixtas de células de tipo epitelial y mesenquimal en forma de huso (Figura 1 A). El uso de la citometría de flujo, línea celular pobremente diferenciado Panc-1 se caracterizó como CSC
alta celda con más de ALDH
alta de la población, mientras que la línea celular bien diferenciado BxPC-3 como CSC
bajo de células con menos ALDH
alta población (Figura 1 B). ensayo de formación de Esfera también reveló que Panc-1 formando cada vez más grandes esferas de BxPC-3 hicieron (Figura 1 A). Para comprender mejor el papel crucial de los reguladores de la EMT, se analizó la expresión basal de caracol, barra, TWIST1, ZEB1 y ZEB2 en Panc-1 y BxPC-3. Cabe destacar que, en tiempo real RT-PCR análisis mostraron que las células Panc-1 tenían una expresión significativamente mayor de caracol y ZEB1 mRNA (aproximadamente 6 veces y 4 veces, respectivamente, P & lt; 0,01) en comparación con BxPC-3 células (Figura 1 DO). Hubo una correlación entre la mala diferenciación, Caracol y los niveles de expresión ZEB1 y la capacidad de formación de esferas en estas dos líneas celulares de cáncer de páncreas. Elegimos la línea celular Panc-1 para los experimentos después de silenciamiento Caracol debido a su nivel de expresión relativamente alto de caracol y una excelente eficiencia de transfección lentiviral.
A. Morfología de Panc-1 y BxPC-3 células y sus esferas. Tenga en cuenta que las células Panc-1 tienen más poblaciones mesenquimales en forma de huso y pueden formar esferas más y más grandes. ** P & lt; 0,01 en comparación con BxPC-3. actividad B. ALDH en Panc-1 y células BxPC-3. gráficos de puntos de células analizadas por citometría de flujo para la actividad de ALDH. Las células se trataron con el sustrato Aldefluor en presencia o ausencia de DEAB inhibidor de ALDH. Después del tratamiento, las muestras se analizaron por citometría de flujo para la presencia de ALDH
pilas de gran. Los valores presentados son la media de tres experimentos independientes. C. Real-time RT-PCR quantifing caracol, barra, TWIST1, ZEB1, y la expresión ZEB2 mRNA en células Panc-1 y BxPC-3. Los gráficos de barras muestran la relación entre el nivel de expresión en células Panc-1 a la de BxPC-3 células. ** P & lt;. 0,01
Snail induce cambios EMT-como en células de cáncer pancreático
Para examinar el papel de caracol en la inducción de la EMT y la generación de CSC, se produjo una caída de forma estable Caracol Panc-1 línea celular (Panc-1 /shSnail) mediante transfección lentiviral.
Dos clones estables que expresan shSnail independientes (S1, S2) y un control negativo estable clones shRNA (NC) se analizaron para la expresión de RNAm de Snail . S1 y S2 se presentaron para 80% regulación a la baja de los niveles de ARNm de caracol, mientras que el clon de control no muestra ninguna reducción significativa en Snail mRNA (Figura 2A). Elegimos S1 clon como Panc-1 /shSnail para siguiente experimento debido a su mayor grado de silenciamiento del caracol. Desmontables de Snail en células Panc-1 se confirmó por análisis de transferencia Western (Figura 2B y C). Rabbit mAb anti-Snail se valida con lisados de células de las líneas celulares Capan-1 Panc-1, MIA-PaCa2, BxPC-3, y. El patrón de tinción fue similar a la de los datos publicados anteriormente (Figura S1) [9], [16]. Para descartar la heterogeneidad causada por transfección estable y protocolo de selección, se utilizó otro control negativo shRNA plásmido (sc-108060) para la transfección transitoria. Real-time RT-PCR y Western blot revelaron ninguna diferencia significativa de la expresión de Snail entre el control de los clones transfectados de manera estable y transitoria (figura S2).
A. la expresión de Snail ARNm de shSnail estables que expresan (S1, S2) y control negativo shRNA-expresando (NC) Panc-1 clones. Los valores son los promedios y las desviaciones estándar de las mediciones por triplicado. ** P & lt; 0,01 en comparación con NC. B. mancha Western que muestra los marcadores epiteliales-mesenquimales caracol, barra, TWIST1, ZEB1, ZEB2, E-cadherina y vimentina en células Panc-1 transfectadas con el control negativo lentivirus mediada por shRNA (Panc-1 /NC) o shSnail (Panc-1 /shSnail). GAPDH se utilizó como control de carga. C. La cuantificación de los niveles de proteína de caracol, barra, TWIST1, ZEB1, ZEB2, E-cadherina y vimentina en Panc-1 /NC y Panc-1 células /shSnail. * P & lt; 0,05, ** P & lt;.
0,01
Después de la infección por lentivirus, cegados investigadores observaron diferencias en el aspecto macroscópico de las células. infección estable de células Panc-1 por shSnail aumentó significativamente la adhesión intercelular y la forma de adoquines similar, en comparación con las células control (Figura 3A). A continuación, se evaluó la expresión y localización de E-cadherina mediante la tinción de inmunofluorescencia. En comparación con Panc-1 células /NC, las células Panc-1 /shSnail ha aumentado los niveles de expresión de E-cadherina y la reubicación de la E-cadherina desde el compartimento nuclear de la membrana plasmática de células (Figura 3B). Estos cambios eran típicas de las células con un fenotipo epitelial, lo que indica que las células fueron sometidas mesenquimal a epitelial de transición (MET) después de Snail silenciamiento. Para confirmar aún más la observación, se evaluó la expresión de la molécula de adhesión epitelial E-cadherina, vimentina marcador de células mesenquimales y otra transcripción EMT factores Slug, TWIST1, ZEB1 y ZEB2 por transferencia Western en lisados celulares. Como se esperaba, después de silenciamiento de Snail en Panc-1, se observó la expresión de la E-cadherina a aumentar. Por el contrario, se observó una disminución en la expresión de vimentina y ZEB1 después de Snail caída. No se observaron diferencias significativas en los niveles de proteína de Slug, TWIST1 y ZEB2 (Figura 2 B, C). Estos resultados muestran una clara relación entre Caracol y E-cadherina, y también sugieren una interacción directa o indirecta entre Caracol y ZEB1, ambos de los cuales tienen el potencial de reprimir la transcripción de la E-cadherina.
A. alteraciones morfológicas de las células Panc-1 después de caracol silenciamiento indican un cambio en el patrón de crecimiento celular de una mesenquimales hacia un fenotipo epitelial. tinción B. Inmunofluorescencia para la expresión y localización celular de E-cadherina en los clones estables de Panc-1 /NC y Panc-1 /shSnail. El ADN nuclear se detectó por tinción con DAPI. Estable Snail caída conduce a un aumento de la expresión de E-cadherina y su translocación desde el núcleo a la membrana. C. Caracol silenciamiento inhibe Panc-1 de invasión en los ensayos de invasión de Matrigel in vitro. ** P & lt; 0,01 en comparación con Panc-1 /NC. Los datos que se muestran aquí son la media ± desviación estándar de tres experimentos.
Caracol aumenta la capacidad de invasión de las células en el páncreas de células cancerosas
Dado que los procesos de EMT se han relacionado con la invasión de células, el próximo preguntó si la expresión de Snail tiene algún efecto sobre la capacidad de invasión de células en células de cáncer pancreático. Utilizando el Matrigel en ensayo de invasión in vitro, encontramos células Panc-1 con Caracol silenciamiento habían disminuido significativamente la capacidad de invasión en comparación con las células control (Figura 3 C). Estos datos confirman que la expresión de Snail aumenta la capacidad invasiva de las células de cáncer de páncreas, y la inactivación de caracol conduce a la MET con características menos invasivos.
Caracol mejora de las células madre como las propiedades de las células de cáncer de páncreas
Como Snail es altamente expresado en CSC
alto en comparación con CSC
células de baja, por lo tanto, examinamos si Snail podría afectar la expresión de ALDH marcador de células madre. Snail silenciado células Panc-1 mostraron una disminución significativa en la ALDH
alta población (1,60%) en comparación con sus homólogos de control (6,01%) (Figura 4 A). A continuación, se utilizó en el ensayo de formación de ámbito vitro para examinar si Caracol participa en la renovación CSC en pasos en serie. Hemos demostrado que Snail no sólo caída afectó a la formación inicial de las esferas, sino que también condujo a una reducción continua de los números de la esfera en las generaciones posteriores. prueba de formación de colonias también mostró que el silenciamiento de Snail bloqueó de manera significativa el crecimiento de colonias de células Panc-1 (Figura 4 B). Estos experimentos implicar que Snail tiene un papel importante en la regulación del contenido de CSC de páncreas y es necesaria para la capacidad de auto-renovación.
A. silenciamiento Caracol disminuye ALDH
alta población de células Panc-1. gráficos de puntos de células analizadas por citometría de flujo para la actividad de ALDH. Los valores presentados son la media de tres experimentos independientes. B. Snail silenciar inhibe significativamente la capacidad de formación de esferas con pasos en serie y la capacidad de la clonogenicidad en células Panc-1. imágenes representativas de la colonia se muestran por encima del diagrama de la columna. Similares experimentos se repitieron tres veces. ** P & lt; 0,01, en comparación con Panc-1 /NC. El análisis de transferencia Western de extractos de C. celulares de Panc-1 /NC y células Panc-1 /shSnail para Bmi1, Nanog, Sox2, Oct4 y expresión. GAPDH se utilizó como control de carga. D. La cuantificación de los niveles de proteína de Bmi1, Nanog, Sox2, Oct4 y en Panc-1 /NC y Panc-1 células /shSnail. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 en comparación con Panc-1 /CN
Caracol aumenta la expresión de células madre factores de transcripción asociados
A medida que la expresión de Snail tiene alguna relación con. contenido CSC, se utilizó la transferencia Western para determinar si la expresión de Snail tiene funciones en el cambio de expresión de Bmi1, Nanog, Sox2, y Oct4, que son necesarios para el mantenimiento de la pluripotencia en células madre. Como se muestra en la Figura 4 C y D, lentiviral transfección mediada de Snail shRNA indujo una reducción dramática en la expresión de Sox2 y Oct4 (P & lt; 0,05 y P & lt; 0,01, respectivamente) en células Panc-1, que fue consistente con la pérdida de CSC fenotipo, lo que sugiere que la expresión de estos factores puede ser importante a la formación de CSC inducida por Snail en células de cáncer pancreático.
Snail mejora la tumorigenicidad de células de cáncer de páncreas in vivo
Desde nuestros estudios in vitro sugieren que Snail juega un papel regulador en la invasión de células de cáncer de páncreas y la formación de CSC, se implantó por vía subcutánea números iguales de Panc-1 /NC y Panc-1 /shSnail en los ratones desnudos y se midió el crecimiento del tumor resultante. Cuando se inyecta 2 × 10
5 células, Panc-1 /CN tenía formación (8/8) del tumor del 100%, mientras que sólo 2/8 ratones inyectados con células Panc-1 /shSnail mostró el injerto del tumor de páncreas. Por otra parte, se observó una tendencia a la formación de tumor retrasado y una disminución en el tamaño del tumor en los tumores derivados de células Snail silenciar comparación con los de las células control (Figura 5A). La inmunohistoquímica de los tumores mostró una tinción ligera de caracol y Oct4, mientras que una tinción de membrana fuerte de E-cadherina en los tumores Panc-1 /shSnail, en comparación con los de Panc-1 tumores /NC (Figura 5B). Estos datos están de acuerdo con nuestras observaciones in vitro y apoyan el papel de Snail en el mantenimiento del compartimento de CSC de páncreas.
A. Representación gráfica de las tasas de crecimiento de los xenoinjertos de tumores subcutáneos utilizando células de Panc-1 /NC y Panc-1 /shSnail. 2 × 10
5 de cada célula fue transplantada en ocho ratones por grupo. Todos los ratones en el grupo /NC Panc-1, mientras que sólo 2 ratones en el grupo /shSnail Panc-1 tenían la formación de tumores. B. Expresión de caracol, E-cadherina, y Oct4 en xenoinjertos de tumores. Los ejemplos representativos de caracol, E-cadherina, y la expresión de Oct4 determinados por inmunohistoquímica. la expresión de Snail fuertemente positiva está presente en el núcleo y el citoplasma de tumores Panc-1 /NC (a), pero no en los tumores Panc-1 /shSnail (b). La expresión de E-cadherina es débil y heterogénea en los tumores Panc-1 /NC (C), pero más intenso en la membrana de Panc-1 /tumores shSnail (d). Bajo nivel de expresión Oct4 está presente en los tumores Panc-1 /shSnail (f), en comparación con la de Panc-1 /tumores NC (e). Barras de escala: 10 micras
Discusión
Nuestro estudio demuestra que Snail que está relacionada con EMT de células de cáncer pancreático humano también puede regular la expresión de marcadores de células madre y pluripotencia mantenimiento de los factores de transcripción. , la modulación de la capacidad de auto-renovación y clonogenicidad. Junto con el estudio de la implantación del tumor, nuestros resultados indican que se requiere la activación de caracol para el mantenimiento de los rasgos similares a células madre de cáncer, lo que afecta directamente a la iniciación del tumor, de crecimiento in vivo. convincente Hemos demostrado que la inhibición de Snail podría considerarse como una estrategia novedosa para mejorar los efectos biológicos de los agentes contra el cáncer y quimiopreventivos.
Los investigadores CSC generalmente identificados de cáncer de páncreas en base a la expresión de los antígenos de superficie celular tales como CD44 , CD24, antígeno epitelial específico (ESA), y CD133 [17] - [20]. Hay diferentes conclusiones en estudios separados en cuanto a qué marcador mejores enriquece para los CAC pancreáticas. Sin embargo, estudios recientes han encontrado que las poblaciones de células enriquecidas con alta actividad de ALDH solos son suficientes para una eficiente tumoral-iniciación con mayor potencial tumorigénico [21]. En nuestro experimento, desmontables de la llave EMT inductor Caracol disminuyó significativamente la población de células ALDH alta
. Estos datos indican que EMT dota células tumorales con propiedades de células madre. Nuestros resultados están de acuerdo con la investigación de Chen y otros, que encontraron ALDH
pilas de gran cáncer de cabeza y cuello escamoso que tiene el desplazamiento EMT y co-expresada de forma endógena Caracol. Por otra parte, la caída de la expresión de Snail disminuyó significativamente la expresión de ALDH, inhibido propiedades madre, como el cáncer [22]. Estas observaciones se confirmaron posteriormente por la formación de la esfera del tumor in vitro y la implantación in vivo, donde Caracol caída llevó a menos y más pequeño injerto. Estos resultados son consistentes con los de Mani y colegas [4] que han mostrado que forzó la expresión de moléculas asociadas a EMT como Snail y resultados de giro en células con un fenotipo de células madre de cáncer. EMT ofrece una forma alternativa de generar propiedades de células madre de cáncer de células tumorales epiteliales diferenciadas. Esta hipótesis de desdiferenciación se apoya en la generación de reciente descripción de las células madre pluripotentes a partir de células somáticas aparentemente terminales diferenciadas [23].
En general se considera que Sox2 y Oct4 son reguladores de la transcripción clave de células madre embrionarias (ESC) auto-renovación y pluripotencia [24] - [26]. La acumulación de pruebas indica que estos factores de transcripción de los CES se expresan por las células CSC-como en diferentes tipos de cáncer. Desmontables de estos genes podría conducir a una disminución fenotipo CSC, reducir las capacidades clonogénico y tumorigénicas de las células cancerosas. [27] - [29]. También son suficientes para reprogramar las células somáticas humanas con las células madre pluripotentes que presentan las características esenciales de los CES [23]. En el presente estudio, se encontró que los niveles de expresión de Sox2 y Oct4 se redujeron en Caracol-silenciar las células Panc-1 en comparación con las células control. Esto sugiere que las funciones del caracol como un interruptor maestro durante la regulación de los potenciales pluripotentes de la célula madre. Resultados similares se encuentran en otras investigaciones, en las que la alta expresión de Oct4 y Nanog promueve EMT, y se asocia con la resistencia a fármacos, la metástasis tumoral y mal pronóstico en diversas lesiones malignas humanas. [30], [31].