Extracto
adenocarcinoma ductal de páncreas es el ranking 4 para el paciente 'muerte por enfermedad maligna en los países occidentales, con ningún tratamiento satisfactorio. Hemos vuelto a examinar con mayor precisión las histonas deacetilasas (
HDAC
) y Sirtuinas (
SIRT
) patrones de expresión génica en el cáncer de páncreas con más tumores de páncreas y tejidos normales. También examinedthe posible relación entre
HDAC
niveles de expresión génica y evolución de la enfermedad a largo plazo. Por otra parte, hemos evaluado mediante el uso de un
in vitro
sistema modelo en la línea celular de tumor pancreático humano si desmontables HDAC7 puede afectar el comportamiento de las células. Se analizaron 29 adenocarcinoma pancreático (PA), 9 pancreatitis crónica (PC), 8 pancreática benigna (BP) y 11 tejidos normales de páncreas. En relación con adenocarcinoma pancreático, hemos sido capaces de recoger biopsias en la periferia del tumor. Para evaluar la posible participación de HDAC7 en la capacidad de proliferación de las células, hemos generado humano Panc-1 tumoral recombinante que underexpressed o HDAC7 sobreexpresado. La expresión de
HDAC1,2,3,4,7 y Nur77
ha aumentado en muestras de PA en niveles significativamente más altos que los observados en el grupo de CP (
p
= 0,0160; 0,0114; 0,0227; 0,0440; 0,0136; 0,0004, respectivamente). La expresión de HDAC7, fue significativamente mayor en el PA en comparación con muestras de tejido de BP (
p
= 0,05). La media de los niveles de mRNA de transcripción de PA para
HDAC7
y
HDAC2
fueron más altos en comparación con sus contrapartes biopsias tomadas en la periferia del tumor (
p = 0,0346
, 0,0053, respectivamente) . Por otra parte, los datos obtenidos mediante microscopía confocal y un método cuantitativo de la tinción de inmunofluorescencia apoyan firmemente la sobreexpresión HDAC7 en especímenes quirúrgicos PA. El número de muertes y recurrencias al final del seguimiento fueron significativamente mayores en los pacientes con sobreexpresión de
HDAC7
. Curiosamente, la tasa de crecimiento se redujo significativamente en el caso de células que incorporan shRNA constructo de gen que codifica HDAC7 en comparación con las células parentales tumorales Panc-1 (p = 0,0015) a las 48 h y 96 h (p = 0,0021). Este estudio apoya firmemente la idea de que HDAC7play un papel en la progresión del adenocarcinoma pancreático
Visto:. Ouaïssi H, F Silvy, Loncle C, D Ferraz da Silva, Martins Abreu C, Martínez E, et al. (2014) Caracterización adicional de
HDAC
y
SIRT
patrones de expresión de genes en el cáncer pancreático y su relación con la enfermedad resultados. PLoS ONE 9 (10): e108520. doi: 10.1371 /journal.pone.0108520
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, China
Recibido: 17 Marzo, 2014; Aceptado: 24 Junio 2014; Publicado: 2 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Ouaïssi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Los datos clínicos se agrupan en: Sitio SIRIC- Integrado de Investigación en Cancérologie, programa titulado: Estrategias alternativas en terapias contra el cáncer de páncreas. Las solicitudes se pueden enviar al jefe del departamento, Dominique Lombardo (Tel +33 (0) 491 324 402)
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos institucionales del INSERM (París, Francia) y el Aix -Marsella Université (Marsella, Francia) y con una donación Inca-DGSO-INSERM 6038 de sitios de Recherche sur le Intégrée cáncer (Siric). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ductal adenocarcinoma de páncreas es el ranking 4 para el paciente 'muerte por enfermedad maligna en los países occidentales [1]. La agresividad de este cáncer se demuestra por una tasa de mortalidad relacionada con la enfermedad que se aproxima estrechamente la frecuencia [2]. la difusión del cáncer y la metástasis cuenta de aproximadamente el 90% de todas las muertes relacionadas con el cáncer [2]. Metástasis sigue un multi-paso procesos complejos en los que el tejido sano vecino es invadido por las células tumorales primarias, que acceden a la circulación sistémica y, finalmente, proliferan en sitios distantes en tumores secundarios macroscópicos a través de la perivascular y /o tejido perilinfática [3]. En el caso de cáncer de páncreas, la mayoría de los pacientes que ya tienen metástasis en el momento del diagnóstico. Un número de investigaciones se han centrado en la identificación de posibles marcadores que pueden permitir para el diagnóstico precoz del cáncer pancreático. Los eventos específicos que promueven la tumorigénesis y la progresión del cáncer están relacionados con modificaciones moleculares complejas como la metilación del ADN, la acetilación de histonas, la fosforilación, ubiquitinación y ADP ribosilación. Actualmente, los resultados de la investigación básica subrayan la importancia de la acetilación y desacetilación en el nivel de no sólo las histonas lisina residuos, sino también otros factores celulares que se supone que interferir con la regulación de la expresión génica. De hecho, la constante-Estado de acetilación de las histonas del núcleo es controlada por las acciones opuestas actetyltransferases histonas (HAT) y desacetilasas de histonas (HDAC) cuya actividad se correlaciona con la activación de genes y la represión de genes o silenciar [4]. Creciente conocimiento acerca de HDACs muestra que son los reguladores de crecimiento, diferenciación y muerte celular (apoptosis). La disfunción de la represión transcripcional mediada por HDAC puede conducir a la carcinogénesis. De hecho, la modulación de los niveles de expresión de genes que codifican HDAC (expresión bajo-sobre y /o) se ha informado de diferentes tipos de cáncer [5], [6], [7], [8]. La caracterización de los genes clave que juegan un papel en el desarrollo de tumores de páncreas no puede permitir solamente para descubrir nuevos biomarcadores, que se convertirán en el foco de interés de investigación intensiva, sino también arrojará luz sobre los productos de genes potenciales para ser explotado para el diseño de medios selectivos para interferir con la progresión del tumor. Estudios recientes demostraron [9], [10] que HDAC2 se sobreexpresa en muestras de tejido de adenocarcinoma de páncreas. Con el fin de proporcionar información sobre el comportamiento biológico del cáncer de páncreas e identificar nuevos biomarcadores potenciales, que tenemos en los últimos años inició un estudio con el objetivo de examinar los niveles de
HDAC
y
SIRT
genes expresión en un conjunto de resecado quirúrgicamente los tejidos pancreáticos, incluyendo 11 muestras de adenocarcinoma de páncreas y un tejido normal del páncreas. A pesar de relativamente pequeño número de especímenes examinados, se halló una mayor expresión de HDAC7, una histona de clase IIa, en 9 de cada 11 muestras [11], [12]. Sin embargo, aunque hemos utilizado uno de páncreas normal, como el calibrador para la medición de la expresión génica y otras muestras en las proximidades o lejos del tumor como controles, pensamos que se necesitan más investigaciones usando un mayor número de tejidos pancreáticos normales y muestras tumorales para volver a examinar con mayor precisión el
HDAC Opiniones y
sirts
patrones de expresión génica en el cáncer de páncreas. Por otra parte, se hicieron intentos para examinar la posible relación entre la expresión de genes de HDAC y la evolución de la enfermedad. También se evalúa mediante el uso de un
in vitro
sistema modelo en la línea celular de tumor pancreático humano si desmontables HDAC7 puede afectar el comportamiento de las células.
Materiales y Métodos
Población Sujeto
A partir de mayo de 2007 hasta Agosto de 2012, 29 de adenocarcinoma de páncreas (PA), 9 pancreatitis crónica (PC), 8 tumores pancreáticos benignos incluyendo cistoadenoma seroso (SC) n = 2, cistoadenoma mucinoso (n = 2), benigna IMPN ( n = 2), quiste benigno (quiste retencional, n = 1), y de páncreas endocrino del tumor (n = 1), se tomaron a su cargo en el Departamento de Cirugía del hospital de la Timone (Marsella, Francia). Todos los pacientes fueron sometidos a torácica con contraste y la tomografía computarizada abdominal, ecografía abdominal, resonancia magnética y análisis de sangre. PA tenía ningún tratamiento preoperatorio antes de la cirugía. Se realizaron veintidós pancreaticoduodenectomías (PD), y 7 pancreatectomías izquierda de adenocarcinoma pancreático, respectivamente. Se realizaron dos procedimientos PD, 4SP y 3 Frey [13] para CP. Cuatro PD, 2 SP y 2 pancreatectomías mediales se realizaron para lesiones benignas. Se obtuvieron cuatro pancreáticos (NP) biopsias normales durante el trasplante hepático en la hepatectomía del donante, se obtuvieron durante la cirugía 7others susmesocolic cuando gastrectomía radical requiere pancreatectomía izquierda: 3 ampulloma (AP1-3), 2 colangiocarcinoma de la vía biliar principal (BD1-2) , 1 gastrinoma del duodeno (G), 1 normales tejidos adyacentes muestras después de la resección gástrica para el adenocarcinoma gástrico. Además, 11 muestras de tejidos de control adoptadas en la periferia de los especímenes quirúrgicos de diferentes pacientes con PA también fueron incluidos en este estudio. Los datos se recogen de forma prospectiva y un cuestionario estandarizado se completó en el momento del seguimiento y de la evaluación del estudio. Antes de la cirugía todos los pacientes firmaron un consentimiento informado que había sido aprobado por el comité de ética local. Protección de las personas del comité del Sur del Mediterráneo II, aprobado por la Orden Ministerial de fecha 31 de mayo de 2012, constituidas de acuerdo con la orden del Director General de la Agencia de Salud Región Provenza-Alpes-Costa Azul fecha 13 de junio de 2012, compuesto por: L. Boyer, V. PRADEL, B. Dussol, C. SICHEL, M. CAILLOL, F. VINCENT, G. NAURAYE, JP. VIDAL, O. Schweitzer, J. Acciaro, discutido en el plenario el almacenamiento de archivos de declaración y preparación para los elementos científicos del cuerpo humano identificado por el Ministerio de Educación Superior e Investigación bajo la referencia DC-2013-1857 y cuyo director científico es el Sr. Dominique Lombardo, dio un consejo experto favorable (archivos S1, S2).
Cirugía
Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron por tres cirujanos experimentados pancreáticos (BS, YPLT, ES, MO). cirujanos experimentados altos llevaron a cabo todas las resecciones la cabeza del páncreas. PD se realizó con un píloro preservar o procedimiento de Whipple, y un pancreaticoyeyunostomía de extremo a extremo (PJA) se construyó con una anastomosis de capa única de interrumpidas 5-0 PDS (cirugía Ethicon) suturas absorbibles. Elección de la técnica quirúrgica se decidió por la cirugía con destino a la decisión del cirujano. entonces abordaje anterior SMA se utilizó rutinariamente desde el año 2001 para estandarizar la radicalidad de la resección en el sitio del margen retroperitoneal. linfadenectomía estándar se realizó antes del año 2001 y se extendió linfadenectomía desde entonces [14]. exámenes sección de congelados en la línea de sección trans de páncreas, se realizó en todos los casos y no fue invadido por todas PA. linfadenectomía estándar se llevó a cabo a lo largo del ligamento hepatoduodenal y la arteria hepática común [15]. Todas las resecciones se realizaron a través de laparotomía. En el caso de la pancreatectomía izquierda: la técnica de la pancreatectomía distal comenzando con la división del cuello del páncreas antes de que se utiliza el control de los vasos esplénicos [16]. división cuello temprana permite el control vascular más seguro. Para pancreatectomía distal, la sección principal del cuello y la ligadura de vasos esplénicos, en combinación con la división de la izquierda gastro-epiploica y vasos gástricos cortos, precede a la movilización de una muestra de devascularized, disminuye el sangrado operatorio y parece más adecuado desde un punto de vista carcinologic. Después de la cirugía los pacientes recibieron quimioterapia adyuvante en función de su estado general, ya la discreción del oncólogo. Dos drenajes blandos (Peters) o la sección de páncreas izquierda para la pancreatectomía izquierda se colocan habitualmente cerca de la anastomosis pancreaticojejunal. Se registró el tiempo quirúrgico. En ausencia de una fístula, drenajes se retiraron después de 7 días.
Las muestras de tejido
Todos los especímenes quirúrgicos fueron revisados por un patólogo de alto nivel. La estadificación clínica y patológica (Tabla S1) se evaluaron de nuevo según el Comité Conjunto sobre el Cáncer de estadificación TNM del cáncer de páncreas relativa PA. Los tumores habían sido congelaron rápidamente en el ARN más tarde y nitrógeno líquido durante 15 segundos y se almacenaron inmediatamente a -80 ° C. características de los tumores se registraron en todos los pacientes (Tabla S1). Esto incluye su ubicación, tamaño media al diagnóstico, la UICC puesta en escena, la extensión de la enfermedad neoplásica el momento del diagnóstico, el número de sitios de metástasis cuando se presente y el estado ganglionar. Todas las muestras se clasifican de acuerdo con las reglas de clasificación de la 6
ª edición (2002) del American Joint Committee on Cancer Staging Manuel (AJCC) [17]. La radicalidad de la resección fue clasificado de acuerdo con la I-clasificación de la Unión Internacional contra el Cáncer (R0: ningún tumor residual, R1: tumor residual microscópica, R2: tumor residual macroscópico
In situ
) [18]. El margen retroperitoneal se calificó R1 si el tumor microscópico residual se identificó dentro de 1 mm de la línea de sección trans [19]. Desde el año 2002, el estudio anatomopatológico de la pieza quirúrgica fue estandarizado según la Luttges
et al.
Protocolo [20], mediante el uso de marcado de la línea de sección trans retroperitoneal tinta rutina. En los casos de resección vascular, el segmento vascular completa se ha incrustado y ambos extremos se examinaron por separado como márgenes de resección adicionales.
Tratamiento de tejidos y la inmunofluorescencia histológico Estudio
Las muestras de tejido (21 PA y 6 pacientes con PN ) se fija de forma rutinaria en formol al 10%, se incluyeron en parafina y más corta en secciones de 5 mm inmediatamente almacenados a 4 ° C o teñidas con hematoxilina-floxina-azafrán (HPS).
Reactivos y anticuerpos monoclonales
En el caso de análisis de transferencia Western, un anticuerpo anti-actina monoclonal de ratón y marcado con POD anticuerpo anti-ratón {de Sigma (St Louis, MO)}, se utilizaron. Un anticuerpo anti-HDAC7 policlonal de conejo fue de Euromedex (Souffelweyersheim, Francia), el anticuerpo anti-conejo marcado con POD era de Señalización Celular (Beverly, MA). DMEM medios de cultivo celular, penicilina, estreptomicina, tripsina-EDTA, higromicina B y neomicina eran de Invitrogen (Carlsbad, NM) Para llevar a cabo la inmunotinción, anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) anti-HDAC7 (20 mg /ml, Sigma-Aldrich, Francia ), y se usaron un anticuerpo de conejo anti-Nur77 (Ab) (5 mg /ml, Thermo Scientific, CergyPontoise, Francia). Conjugado con biotina F (ab ') 2 fragmento de anticuerpos de cabra contra IgG de ratón (Beckman Coulter, Roissy CDG, Francia) o de cabra conjugado con biotina IgG anti-conejo (Sigma-Aldrich) para HDAC7 y Nur77 inmunotinción respectivamente fueron utilizados.
inmunofluorescencia
fijadas con formalina, secciones de tejidos embebidos en parafina (5 micras) se deparaffinized y se tratan con una solución de recuperación de antígeno. Las secciones de tejido se incubaron 2 h a temperatura ambiente (RT) con anti-HDAC7 o anti-Nur77 y se lavaron en PBS. a continuación, las secciones se lavaron en PBS y se incubaron 1 h a TA con una dilución 1:50 de la biotina conjugado con F (ab ') 2 fragmento de anticuerpos de cabra a IgG de ratón o IgG de cabra anti-conejo conjugado con biotina para HDAC7 y Nur77 inmunotinción respectivamente. Las secciones se lavaron en PBS, se trató 1 h a TA con una dilución 1:50 de estreptavidina-fluoresceína (Beckman Coulter). Todas las secciones fueron montadas en medio de montaje permanente acuosa Dako.
Las secciones se observaron por medio de un microscopio Zeiss Axiovert 200 M invertida con 20 objetivo y un microscopio de barrido láser confocal (CLSM) (Leica, TCS SP5) con una 60 objetivo. Un láser de argón con una excitación de 488 nm se utiliza para activar la fluorescencia verde.
Procesamiento de Imágenes
Las imágenes fueron procesadas como se describe anteriormente [11]. Para cada anticuerpo primario, la tinción se calculó como la relación entre la fluorescencia total de la zona (fluorescencia específica total) y la superficie de esta zona (media de fluorescencia específica, MSF). Los valores medios de las seis áreas manchadas para cada biopsia se calcularon entonces.
Seguimiento
El seguimiento postoperatorio incluye clínicas, bioquímicas, y la evaluación radiológica cada 3 meses durante el primer año postoperatorio, a continuación, cada 6 meses hasta un retraso postoperatoria de 5 años y después cada año hasta 10 años de seguimiento. Ninguna paciente se perdió del seguimiento. Los pacientes que sobrevivieron fueron evaluados para la recurrencia de la enfermedad y el sitio de recurrencia. La información de seguimiento se obtuvo de los registros médicos y consulta a los pacientes directos. Se efectuó un seguimiento de todos los pacientes en esta cohorte a junio de 2013, sin que incluye nuevos pacientes. A largo plazo de seguimiento estaba disponible para todos los pacientes. La duración media del seguimiento fue de 16 meses (mediana: 18 meses, rango: 2-53). La duración de la supervivencia se calculó a partir de la fecha de la operación hasta la fecha de la muerte o la fecha de la que se puso fin al presente estudio.
El crecimiento celular y la proliferación
Panc-1 células (ATCC, CRL-1469) se originó de carcinoma pancreático humano se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de FCS, 1% de penicilina (100 U /ml), 1% de estreptomicina (100 g /ml) y glutamina (1 mM). Las células se sembraron a 4000 células
por
bien en una de 96 pozos de la placa y el crecimiento celular se evaluó a las 24, 48, 72 y 96 h por 3- (4,5-dimethythiazol-2-il) -2 , 5-difenil (MTT) ensayo. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (n = 8) y son representativos de al menos 3 experimentos independientes.
Las células transfección
El silenciamiento de genes HDAC7 se realizó mediante transfección estable de células Panc-1 con SureSilencing shRNA plásmido para HDAC7 humano (Qiagen, Courtaboeuf, Francia), que confiere resistencia a la higromicina a las células transfectadas. Más de expresión de HDAC7 se realizó mediante transfección estable usando pCDNA3-Flag-HDAC7 plásmido (plásmido Addgene 13824; Eric Verdin, Los Institutos J. David Gladstone, San Francisco, CA, [21]), que confiere resistencia a la neomicina para células transfectadas. Panc-1 células en el 50-80% de confluencia fueron transfectadas con el reactivo Lipofectamina LTX con Reactivo PLUS (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Después de un 6 h de incubación a 37 ° C en 5% de CO2, el medio de transfección se reemplazó con medio DMEM completo durante 48 h y luego con medio fresco que contiene 300 mg /ml de higromicina B (shRNA plásmido) o 2 mg /ml de neomicina (pCDNA3 plásmido -HDAC7-Flag). Después de 1-2 semanas, en medio selectivo se realizó una dilución límite. Los clones seleccionados fueron referidos como los clones de células SH o PFLAG, respectivamente. transfecciones de control se llevaron a cabo utilizando el vector de shRNA CTL o pCDNA3 vector vacío.
SDS-PAGE y Western Blot
Las células se lavaron tres veces con PBS enfriado en hielo, se recogieron y se sedimentaron por centrifugación. Los sedimentos se lavaron dos veces y se lisaron a 4 ° C en 0,1 ml de tampón de lisis {50 mM Tris /HCl pH 7,5, NaCl 100 mM, 0,5% de Triton X-100, EDTA 1 mM, inhibidores de la proteasa (Complete TM, Roche Diagnostics)} . Los homogenados se incubaron durante 30 min a 4 ° C y se clarificaron por centrifugación a 10 000 g durante 30 min a 4 ° C y se congelaron a -20 ° C. Una alícuota se guarda para la determinación de proteínas usando el kit de ácido bicinconínico (Sigma, St Louis). Cantidades iguales de lisados celulares (100 mg) en tampón reductor de SDS se resolvieron en 8-16% de geles de gradiente de poliacrilamida de Tris-glicina (Pierce). Después de la migración electroforética, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se procesaron para la inmunotransferencia mediante el uso de anticuerpos primarios y secundarios apropiados. Después de los lavados, las membranas fueron reveladas por quimioluminiscencia (Roche Diagnostic, Meylan, Francia).
El aislamiento de ARN y la transcripción reversa
Los tejidos (≈30 mg) se interrumpe en 600 l de tampón RLT Plus ( Qiagen) usando un buque de tamaño adaptado para su interrupción y homogeneización con un Ruptor de tejidos. El ARN total se aisló usando el kit Prep Todo DNA /RNA mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se determinó por la absorción y ARN integridad se comprobó en los chips de ARN Nano (Agilent, Santa Clara, CA). La transcripción inversa (RT) las reacciones se realizaron en 1 g de ARN total usando el kit Improm-II (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Se recogieron las células T y él pellets para la purificación del ARN se procesaron inmediatamente en tampón de lisis RLT (Qiagen). El ARN total se aisló usando el kit RNeasy mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se trataron con DNasa I (kit libre de ADN, Ambion Inc., Austin, Texas) para eliminar trazas de ADN genómico contaminante. La transcripción inversa (RT) Las reacciones se realizaron en 1 g de ARN total usando hexámeros aleatorios y la transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
-PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR RT)
Q reacciones de RT-PCR se realizaron por triplicado en dos preparaciones independientes de RNA a partir de clones celulares utilizando el LightCycler480 SYBR Green I Master Mix y el instrumento de PCR en tiempo real LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) como se ha descrito anteriormente [12]. Los cebadores se resumen en la Tabla S2. Los cebadores fueron diseñados para amplificar un fragmento de aproximadamente 200 pb de la secuencia de codificación de 11 genes pertenecientes a las familias HDAC /SIR. El gen 28S RN se eligió como control. Análisis comparativo de los valores paso fronterizo de Ct (media de
Cp
) del 4 NP y los 7 biopsias pancreáticas normales para el conjunto de la HDAC y SIRT, así como los genes Nur77 reveló que eran de valores similares sin estadísticamente diferencia significativa (Figura 1, Tabla S3). Por lo tanto, las 11 biopsias muestras fueron diseñados como un grupo de control (CG) y su media
valores Cp
para todos los genes se determinaron y se utiliza como calibrador. El método 2
-ΔΔCt se utilizó para analizar la expresión génica relativa [22]. Los valores de Ct (Cp) promedio se calculó para ambos el objetivo y el gen 28S y el Ct (C
t,
target
-C
t,
28S
) era determinado. El CG se utilizó como calibrador [para el cálculo de ΔΔC
t = (C
t,
target
-C
t,
28S
) - (C
t,
CG objetivo
-C
t,
CG 28S
)] [22]. Para el CG, ΔΔC
t es igual a cero y 2
0 es igual a uno, de manera que el factor de cambio en la expresión génica con relación a la CG es igual a uno. Evaluación de 2
-ΔΔCt indica el cambio veces en la expresión de genes en relación con el GC
.
Mean Cp de las HDAC, sirts y los genes 28S y Nurr77 transcripciones de las muestras de tejidos del grupo de control. qPCR fueron desarrolladas por triplicado en dos preparaciones de ADNc independientes de tejidos pancreáticos como se describe en la sección Materiales y Métodos. La media Cp valores de Ct (media de Cp) se determinaron para las siguientes muestras: NP-1 a 4, páncreas normal; BD-1 y 2, las muestras normales páncreas de pacientes portadores de tumores de los conductos biliares. AP-1 a 3: normal de los tejidos adyacentes muestras ampulloma; G-R: tejidos adyacentes normales de las muestras después de la resección gástrica para el adenocarcinoma gástrico; Gastrinoma: los tejidos normales adyacentes muestras para gastrinoma del duodeno
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software Graph Pad 5.. Los datos se expresan como media ± la desviación estándar o mediana con rango intercuartil. Se analizaron las diferencias entre los dos grupos utilizando la prueba o test de Student U de Mann-Whitney t. Se realizó un análisis unidireccional de la varianza o de Kruskal-Wallis prueba para comparar más de dos grupos.
Para comparar las variables categóricas, se utilizó exactamente la prueba de chi-cuadrado o de Fisher. método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar la supervivencia global y libre de enfermedad. Para todas las pruebas, un valor de p menor de 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
Expresión de HDAC, SIRT y Nurr77 de páncreas Panel de control de tejidos
11 de la normalidad se estudiaron páncreas especímenes quirúrgicos. Se evaluaron estas muestras de tejidos de HDAC, sirts y el estado Nur77 ARNm por cuantitativa en tiempo real PCR. Como se muestra en la Figura 1 y la Tabla S3) cuando se considera el punto de cruce (
Cp
) que define el punto en el que la fluorescencia se eleva sensiblemente por encima de la fluorescencia de tierra de nuevo, los valores observados para cada gen no eran estadísticamente significativamente diferentes (los valores de p variaron desde 0,13 hasta 1) lo que sugiere que los genes diana se expresaron en niveles similares en las muestras quirúrgicas examinadas. Esto nos permitió definir los 11 especímenes quirúrgicos como grupo control (GC), por lo tanto, el uso de los valores medios de su
Cps
como calibrador.
Comparativa de Q RT-PCR análisis de las HDAC sirts, y el cáncer de páncreas Nur77 expressionbetween, pancreatitis crónica, tumores benignos y grupo de control
en nuestro informe anterior [12] hemos demostrado que HDAC7 se expresa de manera significativa en los tejidos de las muestras de PA. Teniendo en cuenta que sólo se utilizaron 11 muestras de tejido PA y una biopsia de páncreas normales, se realizó un análisis de qPCR de
HDAC
,
sirts
y
Nur77
expresión en un total de 46 tejidos muestras que comprenden 29 PA. Por otra parte, 11 normales tejidos pancreáticos biopsias fueron utilizados como calibrador para definir con mayor precisión los observables del gen mRNA niveles de expresión entre los tejidos de PA, PP y B. La media de los valores de
Cp
(Ct) de
HDAC7
,
Nurr77
,
SIRT1
,
SIRT2
, fueron significativamente menores en el grupo PA en comparación con el GC (
p = 0,0010
; 0,040; 0,0420; 0,0366, respectivamente) (Figura 2). Este resultado demuestra que
HDAC7
,
Nurr77
,
SIRT1
,
SIRT2
fueron significativamente sobreexpresado en muestras de PA que en las CG.
Las muestras se analizaron por triplicado en dos preparaciones de ADNc independientes de tejidos pancreáticos como se describe en la sección Materiales y Métodos. los valores de punto (Cp) de cruce. Las comparaciones se realizaron mediante la prueba de Wilcoxon y se consideraron significativas a p & lt diferencias;.
0,05
A continuación se aplica el 2
-ΔΔCt método para analizar la expresión génica relativa en muestras de tejido de PA, B y PC [22]. Como se muestra en la Figura 3A, la expresión de
HDAC1,2,3,4,7 y Nur77
ha aumentado en muestras de PA en niveles significativamente más altos que los observados en el caso del grupo CP (
p
= 0,0160; 0,0114; 0,0227; 0,0440; 0,0136; 0,0004, respectivamente). Por otra parte, la expresión de HDAC7, fue significativamente mayor en el PA en comparación con muestras de tejido B (
p
= 0,05).
(B) SIRT genes de expresión en los tejidos tumorales pancreáticas. Las muestras de tejido de adenocarcinoma pancreático (PA), Benin tumoral (B) y la pancreatitis crónica (PC). Línea roja:. mediana de los niveles de transcripción de ARN relativos
análisis
Q RT-PCR mostró la expresión de ARNm diferentes sirts en los tejidos de PA, PP, y B (Figura 3B). Aunque alguna variación significativa en el nivel de
SIRT
s transcripción de genes podría ser evidenciado, los datos no permitieron identificar un
variación SIRT
niveles de expresión génica entre las muestras B PA, PC y.
Asimismo, comparó los niveles de expresión génica en algunos especímenes en el que pudimos recoger biopsias en la periferia del tumor. Como se muestra en la Figura 4A, PA muestras mostraron estadísticamente mayor media de los niveles de ARNm de transcripción de
HDAC7
y
HDAC2
en comparación con sus contrapartes biopsias tomadas en la periferia del tumor (
p
= 0,0346, 0,0053, respectivamente). A pesar de cierto grado de variación en
sirts
niveles de expresión génica podría evidenciarse entre muestras de tejido, no hay diferencia notable como los observados para
HDAC7
y
HDAC2
podría ser visto. Estos datos apoyan la idea de que entre los
HDAC
y
sirts
genes examinados,
HDAC7
y
¿Cuáles son HDAC2 dos genes con el mayor potencial de ser marcadores de la PA.
pancreáticos tumores de adenocarcinoma (PA), biopsias tejidos remotos (RB).
Patrones y niveles de expresión de HDAC7 y Nur77
Cuando se utiliza HDAC7 mAb, la tinción fue negativa o ligeramente positivo en los casos de control (NP), mientras que una fuerte reactividad inmune positiva se encuentra en todos los PA (Figura 5A). Para analizar con más precisión el nivel de la inmunotinción en muestras de tejidos, seis zonas manchadas cada imagen de inmunofluorescencia para se cuantificaron midiendo la intensidad de MSF zonas manchadas. Todo PA exhibió valores de MSF estadísticamente más altas que las muestras de control. El promedio de la intensidad de MSF encontrado con mAb a HDAC7, fue significativamente superior en el PA (media = 173,78 ± 4,46) en comparación con las muestras de control (media = 54,31 ± 13,26) (Figura 5B) (
P = 0,0004
) . Análisis de seis zonas manchadas cada imagen de inmunofluorescencia mediante la medición de la intensidad de MSF para mostró que el promedio de los valores de MSF encontrado con mAb a Nur77 fue significativamente mayor en PA (media = 146,50 ± 8,07) en comparación con las muestras de control (media = 110,00 ± 4,41 ) (Figura 6) (
P = 0,0225
).
Una ligera coloración se encuentra en NP. En PA, una fuerte tinción se encuentra en el citoplasma y en asociación con la membrana plasmática de la célula. Aumento original 250x. La determinación cuantitativa de fluorescencia media específica (MSF) (B). Se midieron seis áreas en cada caso. Las medianas de las intensidades de MSF obtenidos con tejidos PA y NP están representadas por las líneas horizontales y el rango intercuartil se representan por cajas. (*
P Hotel & lt; 0,0004) guía empresas
Una tinción moderada se encuentra en el citoplasma de la PN.. células PA están fuertemente teñidas en el citoplasma y se observó una tinción moderada en las membranas plasmáticas de células. Aumento original 250x. La determinación cuantitativa de fluorescencia media específica (MSF) (B). Se midieron seis áreas en cada caso. Las medianas de las intensidades de MSF obtenidos con tejidos PA y NP están representadas por las líneas horizontales y el rango intercuartil se representan por cajas. (*
P Hotel & lt; 0,0225).
Impacto de
HDAC7, HDAC2 y Nurr77
expresión en el resultado del paciente con adenocarcinoma de páncreas
a continuación, examinó la posible relación de los niveles de transcripción de genes (
HDAC7
,
HDAC2
y
Nurr77
) y el resultado de la enfermedad. Como se muestra en las figuras 7, 8, 9 y 10, ninguna diferencia estadísticamente significativa podría ser visto entre los grupos en términos de supervivencia global y libre de enfermedad cuando se consideran los individuos que expresan más de menos de 4 veces el nivel basal de transcripción génica. Sin embargo, cuando analizamos el número de recurrencias y la muerte al final del seguimiento, el número de la muerte y recurrencias fueron significativamente mayores en los pacientes con sobreexpresión
HDAC7 gratis (4 veces el nivel basal de transcripción de genes) (Figura 8) .
en general (línea continua) y la supervivencia libre de enfermedad (línea discontinua) guía empresas
N:.. de nivel de línea base de la transcripción en CG
N :. de nivel de línea base de la transcripción en CG
N:. de nivel de línea base de la transcripción en CG
Desarrollo de líneas de células pancreáticas humanas estables, en que expresan o sobreexpresan HDAC7
Para evaluar la posible participación de HDAC7 en la capacidad de proliferación de las células, hemos generado Panc-1 clones de células tumorales humanas recombinantes utilizando un conjunto de cuatro construcciones shRNA disponibles en el mercado y el correspondiente plásmido de control. Por otra parte, se utilizó el plásmido pCDNA3-HDAC7-Flag para lograr la sobreexpresión de la proteína HDAC7. Las transfecciones se realizaron usando un vector vacío pCDNA3 como control. La transcripción del gen que codifica la HDAC se analizó por Q RT-PCR.