Extracto
Más del 90% de la mortalidad por cáncer se deben al cáncer que ha hecho metástasis. Por lo tanto, es crucial para intensificar la investigación sobre la formación de metástasis y la terapia. A continuación, describimos por primera vez la capacidad de metástasis de la C33A línea celular de cáncer de cuello uterino humano en ratones desnudos atímicos después de la implantación subcutánea de células tumorales. En este modelo, hemos demostrado una progresión constante de lumbares y metástasis de ganglios linfáticos renales durante el desarrollo del tumor. Además se producen predominantemente metástasis linfáticas, visualizamos la formación de metástasis hematógenas utilizando la proteína fluorescente roja (RFP) que expresan las células C33A-RFP. Se encontraron células cancerosas positivas RFP migración en los vasos sanguíneos y la formación de micrometástasis en los pulmones de ratones portadores de tumores. A continuación, nos propusimos analizar la influencia de virotherapy oncolítico en el modelo C33A-RFP y se demostró una reducción mediada por virus eficiente del tamaño del tumor y la carga metastásica. Estos resultados sugieren que el modelo de cáncer cervical C33A-SP como una nueva plataforma para analizar las metástasis del cáncer, así como para probar nuevas opciones de tratamiento para combatir la metástasis
Visto:. Donat T, J Rother, Schäfer S, M Hess, Härtl B, Kober C, et al. (2014) Caracterización de Metástasis Formación y Viroterapia en el cuello del útero Cáncer Modelo C33A humano. PLoS ONE 9 (6): e98533. doi: 10.1371 /journal.pone.0098533
Editor: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Septiembre, 2013; Aceptado: 5 Mayo 2014; Publicado: June 2, 2014
Derechos de Autor © 2014 Donat et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la División de Investigación y Desarrollo de Genelux Corporation, San Diego, EE.UU., y una subvención de servicio a la Universidad de Würzburg, Alemania financiado por Genelux Corp. UD y SW recibieron beca postdoctoral. JR, CK, SS, y MH recibieron una beca de postgrado de Genelux Corporación concedida a la Universidad de Würzburg. AAS, JS, NGC, y RJA son empleados de la Corporación Genelux y tienen intereses financieros en Genelux Corporation. BH es un empleado a sueldo de Genelux GmbH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación y Desarrollo de Genelux Corporation, San Diego, EE.UU., y una subvención de servicio a la Universidad de Würzburg, Alemania financiado por Genelux Corp. UD y SW recibieron beca postdoctoral. JR, CK, SS y MH recibieron una beca de postgrado de Genelux Corporación concedida a la Universidad de Würzburg. AAS, JS, NGC y RJA son empleados de la Corporación Genelux y tienen intereses financieros en Genelux Corporation. BH es un empleado a sueldo de Genelux GmbH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Además de todos los intereses en competencia establecidas antes de que los autores añaden que los no alteran su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La extensión metastásica de los tumores es un proceso de varias etapas durante el cual las células malignas diseminan desde el tumor primario a órganos distantes [1]. Las células tumorales migran a través de dos rutas principales: el sistema linfático y la circulación de la sangre. Durante la metástasis linfática, una característica común de la mayoría de los carcinomas, células tumorales abandonan el sitio del tumor original y migran después de la liquidación en los ganglios linfáticos regionales a los lejanos [2]. El diagnóstico de metástasis en los ganglios linfáticos es de gran importancia. A pesar de que, metástasis de ganglios linfáticos a sí mismos rara vez son amenazantes para la vida que indican el estado de progresión del tumor [3]. La mayoría de las muertes por cáncer se deben al desarrollo de metástasis. Por lo tanto, es necesaria una mayor comprensión de la biología de la metástasis. Tres plataformas principales se utilizan actualmente para desarrollar
y modelos de metástasis in vivo. Estos incluyen la inducción química, en el que se administran los agentes carcinógenos para inducir la tumorigénesis y metástasis, los modelos singénicos y trasplante de xenoinjerto que implican el trasplante de células tumorales /tejido en huéspedes murinos y modelos de ratón genéticamente modificados [4] - [5]. En este caso, estamos trabajando con un modelo de trasplante xenogénico espontánea de metástasis. Un número de modelos de metástasis xenogénicas se han generado durante los últimos años, por ejemplo, para la próstata [6] - [8], colorrectal [9] - [10], de mama [11] - [12], gástrico [13] - [14] o de células renal [15] carcinomas. Además, también hay algunos modelos de virus del papiloma humano (VPH) cáncer cervical positivo se describe [16] - [18]
En el curso de un estudio de detección de cáncer cervical (VPH positivos y negativos líneas celulares VPH) para. virotherapy oncolítico se analizó los efectos del virus vaccinia oncolítico GLV-1h68 en estas líneas celulares. Los resultados indican que la presencia y el número de copias de ADN de VPH en las células de cáncer de cuello uterino no tuvieron un impacto en la eficacia terapéutica de GLV-1h68 (Tabla S1). Además descubrimos la formación de metástasis en los ganglios linfáticos después de la implantación subcutánea de células C33A negativos de VPH humanos cáncer de cuello uterino en ratones inmunodeficientes. Por lo tanto, en este estudio, nos centramos en la caracterización de la capacidad de metástasis de esta línea celular, que no ha sido descrito en la literatura hasta la fecha. Hemos analizado la linfática y la diseminación hematógena de células C33A-RFP en ratones desnudos después de la implantación subcutánea de células tumorales, con lo que la circulación linfática representa la principal vía de metástasis células tumorales. Por otra parte, se demostró una progresión constante de metástasis ganglionares en correlación con el crecimiento del tumor.
Además, se analizaron virotherapy oncolítico de tumores y metástasis C33A como una opción de tratamiento novedoso. Virus oncolíticos son capaces de replicarse selectivamente en las células cancerosas, lo que resulta en la destrucción del tejido tumoral, pero dejando los tejidos sanos ileso [19]. Aquí, nos centramos en el estudio del efecto de la descrita previamente atenuados, virus de la vacuna recombinante GLV-1h68 [20] - [21]. El efecto terapéutico de este virus en los tumores primarios se ha demostrado para muchos carcinomas como el de mama, de páncreas o el cáncer de próstata [21] - [23]. Además, recientemente hemos mostró un potencial terapéutico de GLV-1h68 en el tratamiento linfático y metástasis hematógenas procedentes de la próstata línea celular de carcinoma humano PC-3 [22], lo que indica que GLV-1h68 podría ser capaz de erradicar la metástasis en el C33A-modelo como bien. De hecho, aquí hemos demostrado una reducción drástica mediada por virus de tumores C33A-RFP y su carga metastásica.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
El cervical humano VPH-negativas línea celular de cáncer C33A se cultivó en DMEM de alta glucosa (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania) suplementado con 10% de FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania) y solución de gentamicina 1% (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania). La línea de células C33A fue proporcionado amablemente por Frank Stubenrauch, PhD (UKT, Universidad de Tübingen; [24]). La autenticidad de las células C33A se verificó mediante la DSMZ GmbH (Instituto Leibniz Colección DSMZ-Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania). células C33A-RFP se cultivaron en las mismas condiciones excepto por la adición de 5 mg /ml blasticidina. células de riñón epiteliales humanas (293FT) se obtuvieron de Invitrogen GmbH (Karlsruhe, Alemania) y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y 2 mM L-glutamina (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania).
Generación de células C33A-RFP
la secuencia de ADNc de la proteína fluorescente roja (
mRFP1
) se insertó en el genoma de la célula C33A usando Vira Poder Lentiviral del kit del sistema de Expresión (Invitrogen GmbH, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
mRFP1
-encoding plásmido pCR-TK-SEL-mRFP fue proporcionada por Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) y se utiliza para generar el
mRFP1-
que contiene los vectores lentivirales tal como se describe anteriormente [25]. Incompetente para la replicación
mRFP1
-encoding lentivirus fueron producidos en células 293FT por co-transfección de los plásmidos pLP1, PLP2, el PLP /VSVG que suministran proteínas estructurales y de replicación de lentivirus y el plásmido de expresión pLenti6 /V5-DEST-mRFP utilizando Lipofectamine ™ 2000. Después de la transducción de las células C33A con lentivirus mRFP-codificación y blasticidina (/ml 5 mg) de selección, se seleccionó un clon que expresa RFP estable C33A.
cepa del virus
La cepa de virus de la vacuna atenuada GLV- 1h68 se describió previamente por Zhang
et al
. [21]. Tres cajas de expresión que codifican para
Renilla
proteína de fusión luciferasa-GFP, β-galactosidasa, o β-glucuronidasa se recombinan en el
F14.5L
,
J2R
y
A56R
loci, respectivamente, del genoma del virus parental LIVP.
Ética declaración
Todos los animales fueron atendidos y manejados en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales tal como se define por las autoridades nacionales y órganos locales de bienestar animal (Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio publicada por los Institutos nacionales de Salud y el Bienestar Animal alemán Ley "TierSchG"). Los protocolos experimentales fueron aprobados por el gobierno de Baja Franconia, Alemania (números de protocolo 55.2-2531.01-17 /08 y 55.2-2531.01-25 /12) y /o el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de Explora BioLabs, ubicado en San Centro de Ciencia Diego (San Diego, EE.UU.) (números de protocolo: EB08-003; EB11-025).
implantación del tumor y el virus de la administración
Los tumores se generaron mediante la implantación de 5 × 10
6 células C33A-RFP en 100 l de PBS por vía subcutánea en el flanco derecho del abdomen de 6-8 semanas de edad desnudos atímicos
Foxn1
nu
ratones (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Alemania). Tumor y de los ganglios linfáticos volumen se controló en dos dimensiones usando un calibrador digital y se calcula como [(longitud) x (anchura)
2 × 0,52]. El volumen del tumor se midió en ratones vivos, mientras que se midió el volumen de los ganglios linfáticos
post mortem
, después de abrir el abdomen. Un ganglio linfático se definió que ser ampliada cuando el diámetro máximo excede 3 mm. Para estudiar el efecto de virotherapy oncolítico una dosis única de 5 × 10
6 unidades formadoras de placa (pfu) de GLV-1h68 en 100 l de PBS se inyectó por vía intravenosa (iv) en ratones portadores de tumor C33A-RFP, después de que el tumor El volumen fue de 200-250 mm
3. Los ratones fueron sacrificados de acuerdo con las Directrices para la eutanasia de roedores utilizando dióxido de carbono.
imágenes de fluorescencia
Imágenes de ratones portadores de tumores C33A-RFP fueron tomadas con el sistema de imágenes EX Maestro (Calibre, Hopkinton , MA, EE.UU.). imágenes de fluorescencia de los tumores, los riñones, los pulmones y ganglios linfáticos de los ratones portadores de tumor C33A-RFP se realizó con un MZ16 Stereo-FA microscopio de fluorescencia (Leica, Wetzlar, Alemania). Para obtención de imágenes de los ratones con el sistema de imágenes de Maestro EX, los animales fueron anestesiados usando 2-3% de isoflurano. Las imágenes digitales fueron procesadas con Photoshop 7.0 (Adobe Systems, de San Francisco, EE.UU.).
Medición de la intensidad de fluorescencia
La medición de la intensidad de fluorescencia de la señal de solicitud de propuesta en los ganglios linfáticos y riñones de C33A- ratones portadores de tumores de RFP se realizó mediante ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij). RGB-imágenes de la señal de solicitud de propuesta de los riñones y ganglios linfáticos se convirtieron en escala de grises de 8 bits con un rango de intensidad 0-255. La intensidad de fluorescencia representa el brillo promedio de todos los píxeles relacionados RFP.
Inmunohistoquímica
para histología, tumores, ganglios linfáticos y los riñones fueron extirpados y fijo durante 16 h en paraformaldehído al 4% /PBS, pH 7.4. Preparación de 100 micras secciones y procedimientos de etiquetado se realizaron como se describe anteriormente [26] utilizando el Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Suiza). Después del marcaje, las secciones de tejido se montaron en Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). Para la preparación de 10 micras secciones de muestras de tejido se seccionaron con el criostato 2800 Frigocut (Leica, Wetzlar, Alemania). Después de la deshidratación en 10% y 30% de sacarosa (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) especímenes fueron embebidos en Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetek Europa BV, Alphen aan den Rijn, Países Bajos). Crio-secciones se almacenaron a -80 ° C y se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 h. Después de lavar con PBS, las secciones se tiñeron durante 1 h con anticuerpos secundarios y, finalmente, montados en Mowiol 4-88.
Los anticuerpos y reactivos
vasos sanguíneos endoteliales se tiñeron con un hámster monoclonal anti-CD31 anticuerpos (Chemicon International, Temecula, EE.UU.; MAB1398Z) y los vasos linfáticos endoteliales con un anticuerpo policlonal de conejo anti-LYVE-1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab14917). Los núcleos se Hoechst 33342 marcado con (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania). DyLight488 anticuerpos secundarios conjugados (burro) se obtuvieron de Jackson ImmunoResearch (Pensilvania, EE.UU.). Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron 1:100 en PBS /0,3% de Triton-X-100
La microscopia de fluorescencia
Imágenes del tumor, las secciones de los ganglios linfáticos y renales fueron capturadas con los siguientes microscopios.: un microscopio de fluorescencia estéreo MZ16 FA (Leica) equipado con una cámara CCD digital y el software Leica IM1000 4.0 (1300 × 1030 píxeles imágenes RGB-color), un TCS SP2 AOBS confocal microscopio láser (Leica) equipado con el software LCS 2.16 ( 1024 × 1024 píxeles de imágenes a todo color RGB) y un microscopio Axiovert 200 M (Zeiss) con el software Axiovision 4.5 (1388 × 1040 píxeles de imágenes en escala de grises), respectivamente. Las imágenes digitales fueron procesadas con Photoshop 7.0 (Adobe Systems, EE.UU.) y se fusionaron para dar color seudo imágenes. Imágenes de células sembradas en placas de 24 pocillos fueron capturados, ya sea con el microscopio de fluorescencia estéreo MZ16 FA (Leica) o con el microscopio Axiovert 200 M (Zeiss).
Preparación de suspensiones de células individuales y el análisis FACS
Para la preparación de suspensiones de células individuales de tumores, lumbar y de los ganglios linfáticos renales, pulmones y riñones de los tejidos de ratones portadores de tumor C33A-RFP se pesaron, picada y se incubaron individualmente en medio DMEM de alta glucosa suplementado con 2% de FCS, 10.000 U /ml de colagenasa I (Sigma, Steinheim, Alemania) y 5 MU /ml de DNasa I (Calbiochem, Darmstadt, Alemania) a 37 ° C. Los tejidos tumorales se incubaron durante 35 min tejidos, LN y RN durante 30 min, los riñones de 20 min y los pulmones durante 15 min. Posteriormente, los tejidos se pasaron a través de 70 micras filtros de malla de nylon (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica) y se transfirieron a medio DMEM de alta glucosa suplementado con 2% de FCS. Después de la centrifugación (1000 g, 10 min) sedimentos se resuspendieron en el volumen de 2x de PBS /2% de FCS, con respecto al peso del tejido. Subsiguientes, 100 l de las suspensiones de células individuales se analizaron mediante Accuri C6 citómetro y el software de análisis FACS Cflow versión 1.0.227.4 (Accuri Citómetros, Inc. Ann Arbor, MI, EE.UU.). Las células fueron cerrada en función de su tamaño (FSC) y la granularidad (SSC). Además, 100 l de las suspensiones de células individuales fueron sembradas en placas de 24 pocillos en 1 × 10
-1 a 1 × 10
-4 diluciones. Las diluciones se prepararon en medio DMEM de alta glucosa suplementado con 10% FCS. Tres días después de la siembra medios suspensión de células se complementó con 5 mg /ml blasticidina, para seleccionar células C33A-RFP. lavado de células y la renovación de medios se realizaron dos veces por semana. Después de una semana de selección blasticidina células C33A-RFP en las placas de 24 pocillos se tiñeron con cristal violeta durante 3 h, se lavó y se secó. Posteriormente, se contaron las colonias de células.
El análisis estadístico
Se utilizó
t
prueba de Student de dos colas para el análisis estadístico.
Los valores de P
≤0.05 se consideraron estadísticamente significativos. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre los grupos experimentales. (* Indica p = 0.05; ** indica p≤0.01; *** indica p≤0.001)
Resultados
Cinética de crecimiento de C33A- subcutánea tumores RFP y los ganglios linfáticos de metástasis formación
Un observó la ampliación de lumbares y los ganglios linfáticos renal en ratones portadores de tumor C33A indicó la presencia de células tumorales metástasis. Para permitir la visualización de la propagación de células C33A metastásico, la secuencia de ADNc de la proteína fluorescente roja (
mRFP1
) se insertó en el genoma de la célula C33A. La expresión de RFP en células C33A se confirmó por microscopía de fluorescencia (Fig. 1a). Posteriormente, 5 × 10
6 células C33A-RFP fueron por vía subcutánea (s.c.) implantado en el flanco derecho de ratones desnudos. Cada semana hasta 49 días después de la implantación de seis a siete C33A-RFP se examinaron los ratones portadores de tumores. Como parte de estos análisis volúmenes de los tumores, lumbar (LN1, LN2) y renal (RN1, RN2) se midieron los ganglios linfáticos (Fig. 1b + c) se realizó y la fluorescencia de formación de imágenes de tumores y metástasis de ganglios linfáticos (Fig. 1d) . Nos mostró un aumento constante del volumen del tumor de semana en semana después de la implantación de las células C33A-RFP. Al mismo tiempo, los volúmenes de lumbar y de los ganglios linfáticos renales fueron aumentando, así, lo que indica un posible proceso de colonización de las células tumorales resulta en la expansión de volumen de los ganglios linfáticos. imágenes de fluorescencia confirmó señales RFP en los ganglios linfáticos agrandados, lo que demuestra metástasis C33A-RFP. En particular, el volumen de LN1, el nodo linfático lumbar situado más cercano al tumor C33A-RFP primaria, estaba aumentando primero y más grande, como sería de esperar para las metástasis de ganglios linfáticos regionales.
tumores y ganglios linfáticos de seis a se analizaron siete ratones por punto de tiempo (7 y 21 dpti: n = 7; 14, 28, 35 y 49 dpti: n = 6). un campo brillante (BF), RFP y superponer imágenes de células C33A-RFP, barra de escala representa 100 micras. la curva b Tiempo de crecimiento del tumor C33A-RFP. c Volumen de lumbares y los ganglios linfáticos renales con el tiempo. d Imágenes representativas de tumores (fila superior) y que corresponde ganglios linfáticos (fila inferior) de ratones portadores de tumores C33A-RFP en los días indicados después de la implantación de las células tumorales. Las imágenes de los tumores (T) fueron tomadas de ratones vivos utilizando el sistema de imágenes EX Maestro. se llevó a cabo de imagen de lumbares (LN1, LN2) y renales (RN1, RN2) metástasis en los ganglios linfáticos en el abdomen de ratones portadores de tumores
post mortem
, después de abrir el abdomen y la extirpación de órganos. Las barras de escala representan 2 mm. e Porcentaje de todos los ganglios linfáticos positivos para RFP con el tiempo. f Porcentaje de LN1, LN2, RN1 y RN2, respectivamente, positivo para RFP por punto de tiempo.
Por otra parte, la imagen de fluorescencia durante el transcurso de tiempo de 49 días reveló un aumento constante de la cantidad de ganglios linfáticos positivo para RFP después de la implantación de células tumorales, a partir de 21% de RFP ganglios linfáticos positivos en el día 7. la cantidad aumentó a 88% ganglios linfáticos positivos para la expresión de RFP en el final del experimento (Fig. 1e). Además, el porcentaje de RFP positivo LN1, LN2, RN1 y RN2 se analizó por punto de tiempo. En el día 7 después de la implantación del 86% de todos los LN1s detectados fueron positivos para la solicitud de propuestas, mientras que no hay señal RFP fue detectable en LN2, RN1 o RN2 que conduce a la suposición de que la colonización metastásica con células C33A-RFP se produce por primera vez en el LN1 los ganglios linfáticos regionales. Catorce días implantación de células tumorales post (dpti) todos LN1s detectados (100%) y el 50% de RN1s fueron positivos para la solicitud de propuestas, lo que indica que después de metástasis a ln1 las células C33A-RFP se extendió a la siguiente ganglios linfáticos locales (linfáticos renales nodo RN1) . Metástasis células C33A-RFP en LN2 y RN2 se detectó por primera vez en el día 28 después de la implantación (Fig. 1f). Tomados en conjunto, nos mostró una progresión continua de la metástasis de los ganglios linfáticos lumbares y renales coincidiendo con el crecimiento del tumor C33A-RFP de semana en semana después de la inyección s.c. implantación de células tumorales.
células tumorales C33A-RFP metastatizan a través tanto de la linfático y las vías hematógenas
Durante nuestros estudios microscópicos hemos detectado la presencia de células C33A-RFP en los vasos linfáticos que conectan lumbar y renal metástasis en los ganglios linfáticos en C33A-RFP ratones, lo que demuestra los vasos linfáticos como ruta de metástasis secundaria en este modelo portadores de tumor (Fig. 2a, b) .Además, en circulación también se detectaron células C33A-RFP en eritrocitos que contiene vasos sanguíneos situados junto a LN-RN-conectar los vasos linfáticos, lo que refleja la ruta hematógena de la migración metastásica de células tumorales (Fig. 2c). En particular, imágenes de fluorescencia reveló señales de RFP en los pulmones de ratones portadores de tumor C33A-RFP que por lo general es el primer órgano para conseguir metástasis en caso de diseminación metastásica por vía hematógena. Hasta el día de implantación de células tumorales 28 después no se encontró pulmón para ser positivo para la solicitud de propuestas, mientras que el día 35 tres de seis y en el día 49 cinco de los seis pulmones se pusieron a prueba positiva para los puntos de RFP (Fig. 2d).
una migración de células C33A-RFP en un vaso linfático LN1 conexión y RN1 42 dpti. Las barras de escala representan 2 mm. b LYVE-1 tinción de 100 micras secciones transversales de la parte entre LN1 y RN1. Las barras de escala representan 200 micras. c migración de las células C33A-RFP en un linfático (punta de flecha llena) y en un eritrocito que contiene los vasos sanguíneos (punta de flecha abierta) 32 dpti. Las barras de escala representan 2 mm (izquierda) y 500 m (derecha). d señales RFP en los pulmones de los ratones portadores de tumores C33A-RFP. Arriba: imagen representativa de un pulmón 42 dpti. La barra de escala representa 2 mm. Abajo: porcentaje de los pulmones dio positivo por puntos RFP lo largo del tiempo. Se examinaron los pulmones de seis a siete ratones por punto de tiempo (7 y 21 dpti: n = 7; 14, 28, 35 y 49 dpti: n = 6) guía empresas
En resumen, hemos demostrado claramente. que las células C33A-PP no está utilizando el linfático, así como las rutas hematógenas para la diseminación metastásica en SC implantado tumor-teniendo ratones desnudos.
Asimismo, se observó una acumulación de la señal de RFP en los riñones de estos ratones por imágenes de fluorescencia durante el transcurso de tiempo de 49 días (Fig. 3). El análisis histológico de los tumores, los LN y enfermeras de ratones portadores de tumores 31 dpti revelaron una estructura organizada de las células que expresan RFP C33A en tumores y metástasis en los ganglios linfáticos, lo cual no era cierto para RFP en los riñones (Fig. 4a). Por otra parte, hemos demostrado que las señales RFP renales se encuentran principalmente en la corteza y CD31 etiquetados vasos sanguíneos en la médula y la pelvis de los riñones (Fig. 4b). Las imágenes de la corteza renal con mayor aumento revelaron la acumulación de RFP en las nefronas, mediante el cual RFP parecía estar situada por células de forma independiente en los patrones de manchas similares (Fig. 4c). No se observaron micrometástasis en los riñones. Por lo tanto, se supone que la señal de RFP fuerte en los riñones de los ratones portadores de tumor C33A-RFP podría ser causada por la deposición de RFP en la corteza renal, después de la filtración de sangre en nefronas. En contraste con lo que hemos observado en los riñones, se detectaron micrometástasis en los pulmones de los ratones portadores de tumores C33A-RFP 42 dpti (Fig. 4d izquierda). Por otra parte, se encontraron células C33A-RFP individuales en los vasos sanguíneos de los pulmones, así como fragmentos de RFP similares a los observados en la corteza renal de los riñones (Fig. 4d derecha).
Se analizaron seis a siete ratones por punto de tiempo (7 y 21 dpti: n = 7; 14, 28 y 35 dpti: n = 6). Imágenes representativas de una señal de solicitud de propuesta en los riñones. Fila superior: superposición de imágenes de campo claro y RFP. Fila inferior: las imágenes de la señal de solicitud de propuesta. Las barras de escala representan 2 mm. b intensidad media de fluorescencia de la señal de solicitud de propuesta en los riñones de ratones portadores de tumores C33A-RFP lo largo del tiempo.
Los núcleos de a, b y c se tiñeron con colorante Hoechst. Superposiciones de un campo brillante, RFP y Hoechst imágenes de 10 micras secciones de un tumor, LN, RN y riñón 31 dpti. Las barras de escala representan 50 micras. b Imágenes de 100 micras secciones de un riñón dpti 31, teñidas con anticuerpos anti-CD31 y el colorante Hoechst. La barra de escala representa 2 mm. c 10 micras sección de riñón teñidas con colorante Hoechst. A la derecha: imagen confocal. Las barras de escala representan 100 micras (izquierda) y 10 m (derecha). d CD31 y tinción de Hoechst de 100 micras secciones de pulmón 42 dpti. punta de flecha llenado: en un vaso sanguíneo migración de células C33A-RFP; punta de flecha vacía: fragmentos positivos RFP. Las barras de escala representan 250 micras (izquierda) y 50 m (derecha). Todas las imágenes son ejemplos representativos.
En su conjunto, los análisis histológicos revelaron una estructura clara y organizada de las células que expresan RFP C33A en tumores y metástasis en los ganglios linfáticos, mientras que la señal de solicitud de propuesta en los riñones parecía ser principalmente el resultado de la deposición de proteínas y no sólo de las células tumorales positivas RFP metástasis. señal de RFP en los pulmones parecía estar causada por tanto, metástasis y se instaló células C33A-RFP y deposición RFP.
La detección de células C33A-RFP viables en los tumores, los LN, enfermeras, pulmones y riñones de ratones portadores de tumores
Para investigar más a fondo si la señal de solicitud de propuesta en los tumores, los LN, enfermeras, pulmones y riñones de ratones portadores de tumores C33A-RFP resultó de células viables C33A, suspensiones de células individuales de estos tejidos de 5 ratones se prepararon 49 y dpti se analizaron por FACS. Se encontró que el 83% de las células en suspensiones de células tumorales fueron positivas para RFP, 42% en LN, 32% en RN, 11% en el pulmón y 18% en suspensiones de riñón (Fig. 5a). Por lo tanto, las células tumorales positivas RFP fueron detectables en todos los tejidos analizados de ratones portadores de tumor C33A-RFP.
Se analizaron tejidos de los 5 ratones (n = 5). a Cantidad de RFP positivo (RFP +) y negativos (células RFP-) en suspensiones de células individuales de tumor, LN, RN, pulmón y riñones. 10.000 eventos se analizaron por FACS. b Crecimiento de diferentes diluciones (10
-1-10
-4) de suspensiones de células individuales C33A-RFP en pocillos de placas de 24 pocillos después de una semana de la selección blasticidina. Imagen de la izquierda: el consumo de medios en los pozos que contienen los medios de comunicación 2 días de edad. Imagen de la derecha: los pozos después de la tinción con cristal violeta. Números c de formación de colonias de células C33A-RFP por tumor gramo, LN, RN, pulmón y riñón, respectivamente. las colonias de células fueron contados para cada órgano después blasticidin-selección y tinción de cristal violeta.
Para determinar cuántas de estas células positivas RFP eran de hecho las células tumorales viables, se realizó un ensayo de selección blasticidina. Después de una semana de consumo de medios de selección blasticidina (indicado por el cambio de color de rojo de fenol de rojo a amarillo) correlacionado con la cantidad de células viables (5b Fig., Izquierda). tinción con cristal violeta demostró, además, que el tumor, LN y RN suspensiones contenía células C33A-RFP más viable que las suspensiones pulmón y riñón (Fig. 5b, derecha). Sólo se observaron unas pocas colonias positivas de células C33A-RFP en pocillos de pulmón y riñón suspensiones en 10
-1 diluciones, mientras que las células positivas RFP se observaron en todas las diluciones del tumor, LN y RN suspensiones.
a continuación, las colonias de células C33A-RFP teñidas se contaron en las diluciones apropiadas y se determinó el número de células formadoras de colonias C33A-RFP por gramo de tejido para tumores, metástasis y órganos. Resultó que el 8,6 × 10
6 (± 2,9 × 10
6) se detectaron células C33A-RFP formadoras de colonias por tejido tumoral gramo, 1,7 × 10
7 (± 5,9 × 10
6 ) en LN y 1,5 × 10
7 (± 1,7 × 10
7) en RN. En contraste con esto sólo 4,8 × 10
3 (± 9,7 × 10
3) se detectaron formadoras de colonias de células C33A-RFP en los pulmones y 8,1 × 10
3 (± 1,7 × 10
4) en los riñones (Fig. 5c).
por lo tanto, hemos demostrado una menor cantidad significativa de células C33A-RFP viables en los pulmones y riñones que en los tumores y metástasis en los ganglios linfáticos de ratones portadores de tumores, revelando que C33A-RFP formación de metástasis se produce principalmente a través de la vía linfática.
la lucha contra la metástasis en el modelo C33A-RFP
Una vez, la diseminación metastásica de las células C33A-RFP en ratones desnudos después sc la implantación de células tumorales se caracterizó, nos propusimos analizar la posibilidad de un virotherapy oncolítico como una opción de tratamiento para los tumores novela C33A-RFP y metástasis. Recientemente, se ha demostrado, que el virus vaccinia oncolítico GLV-1h68 es un agente eficaz en la lucha contra hematógena, así como metástasis linfáticas en el modelo de cáncer de próstata humano PC-3 [22], [27]. En base a esto, GLV-1h68 parece ser un candidato prometedor para erradicar la metástasis C33A-RFP. Inicialmente, 12 ratones portadores de tumor C33A-RFP se inyectaron 11 dpti con 5 × 10
6 unidades formadoras de placa (pfu) de GLV-1h68 o PBS como control, respectivamente. Tan pronto como 14 días después de virus /PBS volumen de inyección (dpi) tumor en el grupo tratado GLV-1h68 empezó a disminuir. A partir de 18 dpi en una reducción estadísticamente significativa de los volúmenes de tumor C33A-RFP se logró debido al tratamiento virus en comparación con el PBS tratada tumores de control (Fig. 6a). Los volúmenes tumorales se reducen al tamaño inicial. Análisis histológicos de los tumores tratados con el virus y de control 21 dpi reveló una masiva difusión de GLV-1h68 en los tumores del grupo de virus, asociada con una intensidad de fluorescencia inferior de RFP y Hoechst, indicando mediada por virus, necrosis pronunciada de tejido tumoral (Fig. 6b ). Además, los volúmenes de lumbar y los ganglios linfáticos renales en el grupo PBS fueron significativamente mayores en comparación con aquellos en el grupo tratado con virus 21 dpi, indicando un efecto de metástasis GLV-1h68 (Fig. 6c) inhibidores. En otros análisis, los ganglios linfáticos positivos para C33A-RFP se determinó por microscopía de fluorescencia. Resultó que 16 de los 22 ganglios linfáticos agrandados (72,3%) fueron positivos para la RFP en el grupo PBS, mientras que sólo 1 de cada 15 de los ganglios linfáticos agrandados (6,7%) se dieron positivo a la solicitud de propuesta en el grupo tratado GLV-1h68 ( Fig. 6D), lo que demuestra el efecto terapéutico mediada por virus en la formación de metástasis de ganglios linfáticos. Por otra parte, los análisis microscópicos de secciones de metástasis de ganglios linfáticos lumbares mostraron que ni el PP ni el virus codificado GFP es detectable 21 días después de la inyección de virus. En contraste con esto, se detectó una señal fuerte RFP en los ganglios linfáticos de PBS tratados tumor C33A-RFP ratones portadores. Finalmente, RFP en los riñones y pulmones de los ratones portadores de tumor C33A-RFP se analizó microscópicamente y se compara en PBS y los grupos tratados con el virus. En ambos casos se observó una reducción drástica de RFP debido al tratamiento virus (Fig. 6f, g).
una curva de tiempo del crecimiento del tumor C33A-RFP en 12 ratones después de la administración del virus vaccinia oncolítico GLV-1h68 y PBS, respectivamente (n = 6). Los análisis de los tumores C33A-RFP y metástasis en b-g se realizaron 32 dpti y 21 días después de la administración de GLV-1h68 o PBS (ppp). Seis ratones fueron examinados por grupo (n = 6). b Izquierda: C33A-RFP ratones portadores de tumores 21 dpi. Derecha: 100 micras secciones de un PBS y un tumor tratado GLV-1h68. Los núcleos se tiñeron con colorante Hoechst, GFP se expresa por GLV-1h68 y RFP por las células C33A. c Volumen de lumbar y de los ganglios linfáticos renales y porcentaje d de RFP ganglios linfáticos positivos en PBS y GLV-1h68 tratada ratones portadores de tumor C33A-RFP (izquierda). Derecha: Imágenes de los nodos linfáticos lumbares y renal en PBS y ratones GLV-1h68 tratada. e 100 micras secciones de un PBS (izquierda) y un GLV-1h68 (derecha) tratados metástasis en ganglios linfáticos lumbares. f Izquierda: Porcentaje de riñones positivos para RFP en PBS y GLV-1h68 ratones tratados. Derecha: Las imágenes de los riñones en el grupo PBS y virus. g Porcentaje de pulmones positivos para la RFP en PBS y el grupo GLV-1h68. Todas las imágenes son ejemplos representativos. Todas las barras de escala representan 2 mm.
En total, hemos demostrado una reducción mediada por virus eficiente del tamaño del tumor y la carga metastásica en ratones portadores de tumores C33A-RFP 21 dpi.
Discusión
Desde la diseminación metastásica de los carcinomas representa la principal causa de muerte relacionada con el cáncer, hay una necesidad urgente de intensificar la investigación se centra en el campo de la metástasis tumoral.