Extracto
Tipo de Niemann-Pick C2 (NPC2) juega un papel importante en la regulación de la homeostasis del colesterol intracelular a través de la unión directa con el colesterol libre. Sin embargo, poco se sabe acerca de la importancia de NPC2 en el cáncer. En este estudio, hemos identificado el impacto de diversos tipos de cáncer diferentes en la expresión NPC2. Una serie de anticuerpos monoclonales anti-NPC2 (mAbs) con el isotipo IgG2a se generaron y la detección de péptidos demostró que el epítopo reactivo eran residuos de aminoácidos 31-40 de la proteína NPC2 humano. La especificidad de estos mAb se confirmó por transferencia Western utilizando mediada shRNA knock-down de NPC2 en las células SK-HEP1 humanos. Por tinción inmunohistoquímica, NPC2 se expresa en riñón normal, hígado, mama, colon, pulmón, de esófago, de cuello uterino, de páncreas y tejido del estómago. Fuerte expresión de NPC2 se encontró en el túbulo contorneado distal y proximal de riñón y los hepatocitos de hígado. esofágico normal, uterino cervical, páncreas, estómago, mama, colon y tejido pulmonar teñidas moderadamente a débilmente. Cuando se compara con sus equivalentes de tejido normal, se observó la sobreexpresión NPC2 en los cánceres de mama, colon y pulmón. Con respecto al cáncer de mama, NPC2 regulación está asociada con receptor de estrógeno (-), receptor de progesterona (-) y el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (+). Por otro lado, NPC2 se encontró que se las reguladas en el carcinoma de células renales, la cirrosis hepática y los tejidos de hepatoma. Por captura de antígeno enzima inmunoensayo ELISA, la NPC2 suero se incrementa en pacientes con cirrosis y cáncer de hígado. Según los datos de transferencia Western, el cambio de patrón glicosilada de NPC2 en el suero se asocia con cirrosis y cáncer de hígado. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio inmunohistoquímico y serológica amplia investigación de la expresión de NPC2 en una variedad de diferentes cánceres humanos. Estos nuevos anticuerpos monoclonales deben ayudar con la aclaración de los papeles de NPC2 en el desarrollo de tumores, especialmente en los cánceres de hígado y de mama
Visto:. Liao YJ, Lin MW, Yen CH, Lin YT, Wang CK, Huang SF, et Alabama. (2013) Caracterización de Niemann-Pick Tipo expresión de la proteína C2 en múltiples tipos de cáncer utilizando un novedoso NPC2 anticuerpo monoclonal. PLoS ONE 8 (10): e77586. doi: 10.1371 /journal.pone.0077586
Editor: Ichiro Aoki, Escuela de Medicina de la Universidad de la Ciudad de Yokohama, Japón
Recibido: 30 de mayo de 2013; Aceptado: 4 Septiembre 2013; Publicado: 17 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Liao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia de la República de China (conceder NSC100-2325-B-010-008 y NSC102-2320-B-038-003) Universidad de Medicina y Taipei (subvención TMU101-AE1-B29). TLCN ha sido apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia desde 2005 (NSC 100-2325-B-182-006) y los Institutos Nacionales de Investigación en Salud, Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Tipo de Niemann-pick C2 (NPC2) la proteína es una pequeña glicoproteína soluble que contiene un diecinueve aminoácidos del péptido señal. La proteína se caracterizó por primera vez como una proteína secretora importante en el epidídimo humanos [1]. NPC2 juega un papel importante en la regulación de la homeostasis del colesterol intracelular a través de la unión directa con el colesterol libre [2]. Una deficiencia en NPC2 resulta en la acumulación de colesterol libre en el lisosoma [3]. Análisis de NPC2 ARNm mediante transferencia Northern reveló una única transcripción de 0,9 kb en todos los tejidos examinados, con los más altos niveles de mRNA en los testículos, los riñones y el hígado [4]. La proteína NPC2 humano maduro consta de 132 aminoácidos y se expresa como diferentes isoformas; éstos varían en tamaño desde 19 a 23 kD en una manera específica de tejido [5,6]. Recientemente, se demostró que NPC2 actúa coordinadamente con glicina N-metiltransferasa para regular la homeostasis hepática de colesterol y la enfermedad del hígado graso progresión [7]. Además, NPC2 es esencial para la formación de papilas y modula el crecimiento papilar [8]. NPC2 también se expresa en las células epiteliales alveolares tipo II del pulmón [9]. Desde NPC2 regula negativamente la fosforilación de ERK1 /2 activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) en células de fibroblastos [10], una alteración en la expresión NPC2 puede estar asociada con enfermedades humanas importantes, incluyendo el cáncer. Sin embargo, las expresiones de NPC2 en cánceres humanos no se han explorado en detalle. Por lo tanto, nuestros objetivos de investigación fueron: (a) desarrollar un panel de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra la proteína NPC2 y (b) para caracterizar sus propiedades y posibles aplicaciones clínicas. Por el uso de la tinción inmunohistoquímica, se encontraron fuertes niveles de expresión de NPC2 en el túbulo contorneado distal y proximal de riñón y en los hepatocitos de hígado. La expresión de NPC2 se encontró que era hasta reguladas en los cánceres de mama, colon y pulmón humano, mientras que, por el contrario, hubo baja regulación de la expresión NPC2 en riñón e hígado. Por último, hemos demostrado, además, que la sobre regulación de NPC2 se correlaciona con el estado de los receptores de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR) y el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2) expresión. Además, la desregulación de NPC2 sueros se asocia con cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (HCC).
Materiales y Métodos
Generación de anticuerpos monoclonales contra NPC2
Para generar una serie de mAbs contra NPC2, purificada GST-NPC2 o purificado su-NPC2 (Figura 1 a) proteína recombinante (RP) se mezclaron con adyuvante completo de Freund (para la inmunización inicial) o adyuvante incompleto de Freund (para las inyecciones de refuerzo) (Sigma Co., St. Louis, Mo., EE.UU.) y la mezcla resultante se utilizó como inmunógeno. Su-NPC2 RP se utilizó como antígeno para la detección de anticuerpos se levantó por GST-NPC2 RP. Ratón anticuerpos monoclonales fueron producidos por la técnica de hibridoma [11]. Los hibridomas se dispensaron en seis placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio seleccionado [12]. Los sobrenadantes de los cultivos fueron seleccionados utilizando un inmunoensayo enzimático con GST-NPC2 RP y Su-NPC2 RP como los antígenos. Las células de hibridoma que tienen una alta densidad óptica mediante inmunoensayo enzimático se confirmaron mediante ensayo de transferencia Western inmediatamente. Cada pocillo de células que produce un resultado positivo se subclonó en una placa de 96 pocillos con una densidad celular de 0,5 células por pocillo. Resultando clones individuales con un resultado positivo, entonces se inocularon a una dosis de 2 x 10
6 en un ratón BALB /c que habían sido cebados con 0,5 ml de adyuvante incompleto (Sigma) previamente. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del fluido ascético de ratón usando la proteína G más proteína A Agrose (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.) y después se concentró por Vivaspin 20 (GE Healthcare). El isotipo de cada mAb se determinó usando anticuerpo monoclonal de ratón isotipo Reactivos (Sigma).
(A) Construcción de los plásmidos de expresión de GST-NPC2 y Su-NPC2. (B) proteínas de fusión NPC2 bacteriana se expresaron en células BL21 y luego inducidas con IPTG 1 mM. SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie fueron utilizados para mostrar los pesos moleculares de las dos proteínas fueron aproximadamente de 43,3 kD de GST-NPC2 y 17 kD para Su-NPC2. (C) Análisis de transferencia de Western usando los anticuerpos monoclonales (14-8D, 5-5b, 5-4B, 4-12C, 3-6b, 2-7D, 1-5b y 1-2 g) en contra de GST-NPC2 y Su-NPC2 . (D) Análisis de transferencia de Western usando los anticuerpos monoclonales contra el epidídimo de ratón.
Las células y los plásmidos
células SK-HEP1, adquiridos de ATCC, se cultivaron en DMEM (Gibco BRL, Grand Island , NY) con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.), penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 mg /ml), aminoácidos no esenciales (0,1 mM), y L-glutamina (2 mM) en un incubador humidificado con un 5% de CO
2. El ADN del plásmido se transfectó usando el reactivo TurboFect ™ (Fermentas, Hanover, MD, EE.UU.). Las secuencias de los cebadores y las enzimas de restricción utilizadas para la de cuerpo entero y diferentes longitudes de genes humanos han sido NPC2 descried previamente por Liao, et al [7]. ShRNA plásmido que codifica para NPC2 (TRCN0000029323) se obtuvo de la Instalación Nacional de ARNi Core (Academia Sinica, Taiwán).
Las muestras humanas
Las diapositivas de tejidos HCC (n = 50) y los sueros (n = 165) se obtuvieron de la Red de cáncer de hígado Taiwán (TLCN) y el hospital de la ciudad de Taipei. Las características clínicas de estos pacientes se muestran en la Tabla S1 y la Tabla S2. de control sanos y los pacientes con infección crónica por hepatitis, hígado graso, cirrosis y carcinoma hepatocelular habían sido reclutados entre 2008 y 2010, del Departamento de Medicina Internacional, Hospital de la ciudad de Taipei, Ran-Ai Branch, Taipei, Taiwán y TLCN. Total de 33 sujetos con cáncer de mama invasivo fueron identificados en el Hospital Municipal de Kaohsiung Ta-Tung. Se procesaron todas las muestras de tejido en las mismas condiciones. El Comité de Ética de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Nacional Yang-Ming (IRB Nº 1.000.041) y la ciudad de Taipei el Hospital Institutional Review Board (IRB Nº TCHIRB980509) aprobaron las investigaciones clínicas, y todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito. El diagnóstico de HCC se confirmó mediante el examen histológico. La mama (BR721), colon (CO803), pulmón (LC1006), riñón (KD991), múltiples cáncer (BCN721), múltiples enfermedades del hígado (LV1201) y la cirrosis hepática y hepatitis (LV805) tejidos matrices fueron adquiridos de Biomax, EE.UU. . La información clínica y patológica en las muestras de cáncer individuales están disponibles y se obtuvieron del fabricante array.
cribado de péptidos, transferencia de Western e inmunohistoquímica (IHC) tinción
Se utilizó un ELISA placa recubierta con péptidos para mapear epítopos de los diferentes mAbs anti-NPC2. Estos péptidos (cada uno con una longitud de 10 A.A.) cubiertas de la longitud completa de la 1-40 A.A. región de la proteína NPC2. Para la transferencia Western, las proteínas celulares epidídimo o de ratón se separaron mediante SDS-PAGE. fosfato ERK1 /2 y ERK1 /2; fosfo-p38 y p38; fosfato JNK y JNK fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.). señales de inmunotransferencia se normalizaron utilizando α-tubulina o β-actina y cuantificados por densitometría. detección de IHC de la proteína se realizó utilizando NPC2 NPC2 monoclonal Ab (3-6b) a una dilución de 1: 200 [7]. secciones de tejido embebidas en parafina se incubaron con el anticuerpo primario y se detectaron usando universal LSAB
TM2 kit (DakoCytomation) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
de captura de antígeno enzima inmunoensayo ELISA
Brevemente, se añadieron 100 l de anticuerpo policlonal NPC2 (5 mg /ml) en tampón carbonato 0,1 M (pH 9,6) a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Corning Costar, Acton, MA) y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Entonces, el bloqueo con 5% de BSA en PBST (tampón de PBS que contiene 0,05% de Tween) a 37 ° C durante 2 horas. se añadió a placas de 96 pocillos y se incubó a 37 ° C durante 1 hora: suero de cada paciente (dilución 1 100 l en un 1). Después de tres lavados extensivos con PBST, anticuerpo NPC2 monoclonal: se añadió (1 dilución 1000) y se incubaron a 37 ° C durante 1 hora, seguido de incubación con sustrato 200 l (0,015% de dihidrocloruro de o-fenilendiamina) (Sigma-Aldrich) para otro 30 min a 37 ° C. Las reacciones se detuvieron por la adición de HCl 3 N; se midió la absorbancia con un espectrofotómetro a 490 nm.
glicosidasa digestión
microgramos Sesenta de proteínas hepáticas de sueros humanos se incubaron con o sin N-glicosidasa F (PNGasa F) según las instrucciones del fabricante (NE Biolabs, Beverly, MA). Los productos de reacción se sometieron a análisis de transferencia Western.
Los análisis estadísticos
bondad de Chi-cuadrado de ajuste, no paramétrico de Wilcoxon o la prueba de Mann-Whitney se utilizaron para evaluar la asociación entre NPC2 expresión y enfermedades clínicos. Un
p valor Red de ≦ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales contra NPC2
Con el fin de desarrollar NPC2 mAb que detectan la expresión NPC2 en diferentes líneas de células y tejidos, que inicialmente se clonaron un fragmento NPC2 completa y expresaron la GST-NPC2 y Sus NPC2-proteínas de fusión en un sistema bacteriano (Figura 1A). Como se muestra en la Figura 1B, el GST-NPC2 y Sus-NPC2 proteínas recombinantes, con tamaños de 43,3 y 17 kD, respectivamente, aparecido en los lisados bacterianos inducidos por IPTG. El purificada GST-NPC2 y Sus-NPC2 proteínas recombinantes se utilizaron como los antígenos durante la generación de mAbs contra NPC2. En total, ocho mAbs (14-8D, 5-5b, 5-4b, 4-12C, 3-6b, 2-7b, 1-5b y 1-2 g) fueron finalmente generan y se encontraron para reaccionar con el GST-NPC2 proteínas recombinantes y Sus-NPC2 (Figura 1C). Desde NPC2 es una proteína secretora principal expresado en el líquido del epidídimo [1], hemos aplicado nuestro NPC2 mAbs para detectar la expresión NPC2 en epidídimo de ratón utilizando transferencia Western. Como se muestra en la Figura 1D, NPC2 se detectó en los extractos totales epidídimo como bandas de proteínas de aproximadamente 16 a 22 kD. determinación de isotipo identificó todos los mAbs como pertenecientes al isotipo IgG2a y sus cadenas ligeras se identificaron como cadenas kappa.
Para asignar la región reactiva reconocido por el mAb NPC2, transfectadas un conjunto separado de plásmidos que expresan diferentes longitudes de NPC2 -HA (incluidos los de larga duración NPC2 [1-151 aa], dominio a y B [1-80 aa], dominio B y C [40-105 aa], y el dominio C y D [81-151 aa]) para 24 hrs. Como se muestra en la Figura 2A, los ocho NPC2 mAbs puede reconocer longitud completa y la mitad N-terminal (1-80 A.A.) de pNPC2-HA. Si bien, los fragmentos que contienen la A.A. 41-105 región de NPC2 y el medio C-terminal (81 a 151 A.A.) de NPC2 no reaccionó con la NPC2 mAbs. Estos hallazgos sugieren que la totalidad de la NPC2 mAbs reconocen los aminoácidos 1-40 de la proteína NPC2. Para mapear los epítopos más reactivos reconocidos por la NPC2 mAbs, se realizó un ELISA usando un panel de péptidos que consta de cuatro péptidos que cubren los aminoácidos 1-40 de la proteína NPC2. Nuestros resultados indican que sólo uno de péptidos (aminoácidos 31-40) fue reconocido por seis de los mAb seleccionado NPC2 (14-8D, 5-4B, 3-6b, 2-7B, 1-5b y 1-2 g) (Figura 2B). Como se muestra en la Figura 2C, la sensibilidad y especificidad de la NPC2 mAbs (3-6b, 14-8D, 5-4B y 2-7B) a continuación, se detectaron utilizando células SK-HEP1 transfectadas con o sin shNPC2. Entre estos NPC2 mAb, seleccionamos uno mAb NPC2 (3-6b) como el mejor para la investigación más allá y su uso en aplicaciones clínicas.
mapeo (A) Región de epítopos de los anticuerpos monoclonales NPC2. Diferente longitud de pNPC2-HA incluyendo larga duración pNPC2-HA, la mitad N-terminal (1-80 A. A.), la mitad C-terminal (81 a 151 de AA) y 41 a 105 A. A. se transfectaron en células 293T y 24 horas más tarde se recogieron para análisis de transferencia Western. Carril 1, 1-2 g; Land 2, 1-5b; Carril 3, 2-7B; Carril 4, 3-6b; Carril 5, mAb-HA; Carril 6, 4-12C; Carril 7, 5-4B, Lane 8, 5-5b; Carril 9, 14-8D. placa (B) Un ELISA recubierta con cuatro péptidos que cubre el A.A. 1-40 se utilizó región de la proteína NPC2 para el mapeo de epítopo. Los resultados representativos de los anticuerpos monoclonales (14-8D, 5-4b, 3-6b, 2-7D, 1-5b y 1-2 g) se muestran. (C) El efecto de la caída shNPC2 en las células SK-HEP1 se detectó utilizando anti-NPC2 mAb (3-6b, 14-8D, 5-4B y 2-7B).
Expresión diferencial de NPC2 en tejidos normales y tumorales humanas
con el fin de investigar la aplicación clínica de NPC2 mAb, se detectó la expresión de NPC2 en varios tejidos normales y cancerosas utilizando tinción IHC. de esófago, de cuello uterino, de páncreas, de estómago, de mama, colon y pulmón tejido normal mostró moderada a débil tinción intensidad NPC2 (Figuras 3A y 3C). Como se muestra en la Figura 3B, la fuerte expresión de NPC2 fue encontrado en hepatocitos normales de hígado. En el riñón, NPC2 se expresó tanto en el túbulo contorneado distal y proximal, pero no en el glomérulo (Figura 3B)
Ampliación:. 200x. (A) NPC2 fue hasta reguladas en muestras de mama, de colon y de tumores de pulmón. (B) NPC2 se había reducido regulado en muestras tumorales de riñón y de hígado. (C) La expresión de NPC2 se mantuvo sin cambios en el páncreas, esófago, pares de muestras de tejido del cuello del útero y estómago uterinos.
La comparación entre estos tejidos normales (N) y sus correspondientes tejidos tumorales (T) se llevó y se encontró que NPC2 fue significativamente hasta reguladas en mama, colon y pulmón (Figura 3A). Entre los 23 pares de tumor de mama y tejidos normales ensayados, 18 (78%) de los tejidos tumorales mostraron mayores niveles de expresión NPC2 que sus tejidos normales (
p
& lt; 0,0001, Tabla 1). Fuera de 44 emparejado no pequeñas pares carcinoma pulmonar de células, muestras de tejidos tumorales 30 (68%) tenían una mayor expresión NPC2 que sus contrapartes normales (
p = 0,02
, Tabla 1). Por el contrario, NPC2 fue significativamente las reguladas en el carcinoma de células renales y cáncer de hígado (Figura 3B). Entre 33 pares de tumor renal y tejidos normales, 31 (94%) muestras de tejido tumoral tenían una expresión NPC2 mucho más baja que la muestra de tejido normal equivalente (
p
& lt; 0,0001, Tabla 1). Entre 50 pares de tejidos de tejido tumoral hígado y adyacente tumorales coincidentes, muestras de tejido 36 tumores (72%) mostraron expresión NPC2 mucho menor que su muestra de tejido de tumor adyacente (
p
= 0,02, Tabla 1). Sin embargo, no hubo diferencias entre las muestras normales y de cáncer de tejidos para el carcinoma del esófago, cuello uterino, páncreas y estómago (Figura 3C). . En conjunto, estos resultados indican que la expresión aberrante de NPC2 se asocia con diferentes tipos de cáncer, y que el cambio en la expresión puede ser ya sea hacia arriba o hacia abajo dependiendo del tejido
cánceres
T & gt; N n (%)
T = N n (%)
T & lt; N n (%)
p
valor
Aumento de tumor tissuesBreast (n = 23) 18 (78%) 4 (17%) 1 (4%) & lt; 0.0001Colon (n = 38) 18 (47%) 14 (37%) 6 (16%) 0.0523Lung
#(n = 44) 30 (68%) 5 (11%) 9 (20%) en 0.02Decrease tumor tissuesKidney (n = 33) 2 (6%) 031 (94%) & lt; 0.0001Liver (n = 50) 2 (4%) 12 (24%) 36 (72%) 0,02 . Tabla 1. resultados de inmunohistoquímica de la expresión NPC2 en humanos de mama, colon, pulmón, riñón y tejidos de cáncer de hígado emparejado
T, los tejidos tumorales; N, tejidos normales;
#, no microcítico de pulmón de células de carcinoma. Descargar CSV CSV
Relación entre la expresión NPC2 y el estado de ER, PR y HER-2
En lo que respecta al cáncer de mama, se recogieron más de 33 sujetos con cáncer de mama invasivo identificados en el Hospital Municipal de Kaohsiung Ta-Tung y analizado la relación entre la expresión y las características clinicopatológicas NPC2. Entre 33 pacientes, 18 (54,5%) muestras de tejido tumoral tenían una expresión NPC2 mucho más alta que la muestra de tejido normal equivalente (
p
= 0,002, Tabla 2). Los sujetos con NPC2 regulación eran más propensos a tener un estadio patológico después (
p = 0,018
), ER (-) (
p = 0,007
), PR (-) (
p = 0,005
), HER-2 (+) (
p = 0,006
), ER (-), además de PR (-) (
p = 0,011
) y ER /PR (-), además de HER-2 (+) (
p = 0,011
)
total
T & gt;. N n (%)
T = N n (%)
T & lt; N n (%)
p
valor
patients3318 total (55%) 13 (39%) 2 (6%) 0,002 TNM stageI95 (56%) 4 (44 %) 0 0,043 II166 (38%) 8 (50%) 2 (12%) 0,233 III87 (88%) 1 (12%) 0 0,018 ERPositive209 (45%) 9 (45%) 2 (10%) 0,090 Negative139 ( 69%) 4 (31%) 0 0,007 PRPositive188 (44%) 8 (44%) 2 (11%) 0,092 Negative1510 (67%) 5 (33%) 0 0,005 HER-2 ScorePositive (3) 2012 (60%) 7 (35%) 1 (5%) 0.006 negativo (0-2) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0,091 CombinationER (+), PR (+) 167 (44%) 7 (44 %) 2 (12%) 0,171 ER (+), PR (-) 42 (50%) 2 (50%) 0 0,180 ER (-), PR (+) 21 (50%) 1 (50%) 0 0,317 ER (-), PR (-) 118 (73%) 3 (27%) 0 0,011 ER /PR (+), HER-2 (+) 94 (44%) 4 (44%) 1 (11%) 0,076 ER /PR (+), HER-2 (-) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0,091 ER /PR (-), HER-2 (+) 118 (73%) 3 (27 %) 0 0,011 ER /PR (-), HER-2 (-) 000 0 N /Atable 2. expresión NPC2 y características clinicopatológicas de los pacientes de cáncer de mama
T, los tejidos tumorales.; N, tejidos normales; ER, receptor de estrógenos; PR, receptor de progesterona; HER-2, factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2; (+) Positivo; (-), Negativo. Descargar CSV CSV
La desregulación de la expresión NPC2 en la cirrosis y carcinoma hepatocelular humano
Dado que el hígado es la principal fuente de plasma y NPC2 biliar [13], el próximo examinó si el nivel NPC2 suero puede ser utilizado como un nuevo marcador biológico para las enfermedades hepáticas. Se midió la cantidad de nivel de NPC2 suero de 42 controles sanos, 20 pacientes con infección crónica por VHB, 2 pacientes con infección crónica por el VHC, 27 pacientes con hígado graso, 28 pacientes con cirrosis y HCC 46 usando un ELISA (Figura 4A). Los niveles de NPC2 en grupos con control sano, la infección por HBV crónica, la infección crónica por el VHC, hígado graso, la cirrosis y HCC fueron 3,29 ± 1,43 ng /ml, 4,51 ± 1,88 ng /ml, 9,66 ng /ml (valor máximo, 15,81 y mínimo valor, 3.504), 7,49 ± 2,30 ng /ml, 15,30 ± 2,02 ng /ml y 7,26 ± 2,11 ng /ml, respectivamente. Como se muestra en la Figura 4A, los niveles de NPC2 hubo diferencias entre el control sano, hepatitis crónica (VHB y VHC) y los pacientes con enfermedad de hígado graso. Es importante destacar que, los pacientes con cirrosis y HCC tenían niveles significativamente más altos de NPC2 que los controles sanos. Por otra parte, la tinción IHC demostró que NPC2 fue significativamente reducido regulado en los tejidos cirrosis, mientras que no hubo diferencia entre los tejidos normales y la hepatitis (Figuras 4B y 4C).
(A) ELISA análisis de suero NPC2 niveles en 42 controles sanos, 20 pacientes con infección crónica por VHB, 2 pacientes con infección crónica por el VHC, 27 pacientes con hígado graso, cirrosis y 28 de 46 pacientes con HCC. (B) tinción inmunohistoquímica de la expresión de proteínas en los tejidos NPC2 hepatitis y cirrosis normales, crónicas. análisis (C) IHC de expresión NPC2 hepática en 44 normales, 21 de hepatitis crónica y cirrosis 60 muestras de tejido (*,
p Hotel & lt; 0,05, Mann-Whitney U test). (D) Los sueros humanos (60 mg) se incubaron con péptido N-glucosidasa F (PNGasa F) y se sometió a análisis de transferencia Western. (E) Análisis de transferencia Western de la expresión NPC2 en suero en 14 controles sanos, hígado graso 7, 4 cirrosis y 4 pacientes con HCC. Cada línea se cargó 100 g de proteína.
Desde la N-glicosilación es importante para la correcta orientación y la función de NPC2 [14], A continuación utiliza la digestión PNGasa F para confirmar si la heterogeneidad de proteína de suero se debe NPC2 a la modificación de glicosilación postraduccional. Después del tratamiento con PNGasa F, NPC2 se visualizó como una única banda inmunorreactiva (Figura 4D). Para examinado si la forma glicosilada de NPC2 se asocia con la progresión del cáncer de hígado, las muestras de suero se sometieron a análisis Western Blot. Glicosilada y NPC2 naciente se expresaron en una proporción de 1: 1 en suero humano normal (Figura 4E). Curiosamente, a pesar de que no se encontró ninguna diferencia en la expresión entre los pacientes NPC2 suero hígado sano y graso, la expresión NPC2 glicosilada fue la forma importante tanto en la cirrosis y pacientes con HCC (Figura 4E). Estos datos sugirieron que las cantidades y los cambios en el patrón de NPC2 glicosilada se asocian con la cirrosis y el desarrollo de HCC.
Efectos de NPC2 de señalización MAPK
Para identificar el mecanismo NPC2 dependiente, enfatizamos sobre el estado de la señalización de MAPK. Como se muestra en la Figura 5, sostenido fosforilación de ERK1 /2 se ha observado en células NPC2 desmontables. Sin embargo, p38 y JNK no se activen en las células NPC2 desmontables.
total y fosforilados ERK1 /2, p38, JNK se detectaron mediante transferencia Western de las células SK-HEP1. Desmontables de resultados NPC2 en la activación de ERK1 /2.
Discusión
NPC2 proteína se une con el colesterol libre y controla la homeostasis del colesterol intracelular [2]. La mutación del gen de NPC2 en la acumulación de colesterol en el último compartimiento endosomal /lisosomal de las células [6]. Sin embargo, los papeles de expresión NPC2 en cánceres humanos no se entienden completamente a pesar de su conocido papel en el colesterol de unión. En este estudio, hemos generado y caracterizado una serie de NPC2 mAb y luego evaluó su inmunorreactividad utilizando múltiples arrays de tejido tumoral. A partir de los datos de mapeo de epítopos, se encontró que la NPC2 mAbs dirigidos residuos de aminoácidos 31-40 de la proteína NPC2 humano (Figura 2B). Desde los residuos de aminoácidos 31 a 40 son altamente conservados entre los diferentes ortólogos de mamíferos [2], estos mAbs NPC2 debe ser amablemente al llevar a cabo la investigación sobre el papel de NPC2 en una amplia gama de especies de mamíferos en el futuro. La sensibilidad y especificidad de NPC2 mAbs se evaluó por knock-down de la proteína NPC2 en las células SK-HEP1 (Figura 2C).
La tinción IHC mostró que la expresión NPC2 se incrementó en mama, colon y pulmón (Figura 3A). Desde fuerte expresión de NPC2 se observa en papiloma humano intraductal de mama, pólipos en el colon, el carcinoma papilar de pulmón y de ovario fimbria [8,15], proteína NPC2 puede contribuir a la formación de papilas. Los estudios epidemiológicos demostraron que el HER-2 subtipo [HER-2 (+), ER (-) y PR (-)] y el triple negativo [HER-2 (-), ER (-) y PR (-)] tenía el peor supervivencia, mal pronóstico y una mayor recurrencia locorregional [16-19]. Nuestro estudio encontró que NPC2 sobreexpresión se asocia con HER-2 subtipo (Tabla 2), lo que sugiere que NPC2 regulación puede ser un predictor pronóstico favorable para el cáncer de mama.
homeostasis del colesterol es importante para los cuerpos lamelares II de las células que sirven para producir surfactante pulmonar tipo alveolar. proteína NPC2 está presente en el tipo alveolar pulmonar células II y los macrófagos alveolares y regula el contenido de colesterol de tensioactivo [9,20]. Nuestros resultados demostraron que NPC2 es mejorada en el tejido de adenocarcinoma de pulmón (Figura 3A). análisis de proteómica también ha demostrado que la expresión de NPC2 se aumenta en adenoma de pulmón y derrame pleural [21,22]. Aunque no es claro aún si NPC2 juega un papel en el adenocarcinoma de pulmón, la presencia de proteína en NPC2 derrame pleural de pacientes con adenocarcinoma de pulmón sugiere que puede tener un uso como marcador de diagnóstico potencial para el cáncer de pulmón.
La reducción de expresión de NPC2 se observó específicamente en los tejidos de riñón y tumorales del hígado, en comparación con sus homólogos normales. Desde NPC2 desmontables células de fibroblastos se ha demostrado una fosforilación sostenida de ERK1 /2 MAPK [10], NPC2 puede regular negativamente /2 activación de MAPK ERK1. De hecho, se observó la activación de ERK1 /2 en el NPC2 células SK-HEP1 desmontables (Figura 5). Con respecto al efecto de la terapia de reemplazo NPC2 en NPC2 - /- ratones, se encontró que la infiltración de macrófagos hepática y el número de células cargadas de grasa mejoraron significativamente [23]. Desde la acumulación de lípidos y, posteriormente, la inflamación acelerar la progresión de la cirrosis y cáncer de hígado [24,25], la administración NPC2 puede mejorar el desarrollo del cáncer de hígado. Dado que el hígado es la principal fuente de plasma y NPC2 biliar [13], el aumento de NPC2 sueros de pacientes con HCC cirrosis y puede relacionado con el daño severo de los hepatocitos. En el presente estudio también se observó cambios en los patrones de expresión NPC2 glicosiladas en el suero de ambos cirrosis y HCC pacientes, lo que sugiere que tales cambios pueden servir como un indicador de la cirrosis hepática y el cáncer. N-glicosilación es importante para la correcta orientación y la función de NPC2 [14]. Se necesitan más estudios para aclarar las funciones de NPC2 glicosilada usando cirrosis y más casos de CHC.
En los riñones, NPC2 es abundantemente expresa en el túbulo contorneado distal y proximal (Figura 3B). Desde NPC2 está regulado en los tejidos de riñón de rata Dahl sensibles a la sal que recibieron una dieta alta en sal [26], se ha sugerido que NPC2 podría regular la reabsorción de sodio en la nefrona. Sin embargo, la relevancia funcional de NPC2 en el carcinoma de células renales sigue siendo poco clara y se necesitan más estudios para dilucidar el papel de NPC2 en el riñón, tanto fisiológica como patológica.
Nuestros hallazgos indican que nuestro anticuerpo monoclonal NPC2 tiene aplicaciones potencialmente útiles en las áreas de diagnóstico clínico y la progresión del cáncer a través de múltiples tejidos.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
#, VHB o VHC indican los casos estaban infectados por el VHB y VHC, respectivamente
No B & amp.; no C indican pacientes que no estaban infectados por el VHB y el virus HCV. *, La clasificación de los estados de la patología fueron según AJCC, la UICC y CUPI
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077586.s001 gratis (DOC) sobre Table S2.
#, VHB o VHC indican los casos estaban infectados por el VHB y VHC, respectivamente.
doi: 10.1371 /journal.pone.0077586.s002 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos TLCN para proporcionar las muestras de tejido HCC y los datos clínicos relacionados. Esta red incluye actualmente cinco centros médicos principales (Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Chang-Gung Memorial Hospital-Linko, Veterano Hospital General-Taichung, Hospital Chang Gung-Memorial, de Kaohsiung y del Hospital General de Veteranos, Kaohsiung).