Extracto
Objetivos
La hemoglobina (Hb) es la portadora principal de oxígeno y dióxido de carbono en las células de linaje eritroide y es responsable de la entrega de oxígeno a los tejidos que respiran del cuerpo. Sin embargo, Hgb se expresa también en células no eritroides. En el presente estudio, se investigó la expresión de hemoglobina en células de carcinoma de cuello uterino humano y su papel en el cáncer de cuello uterino.
Metodología
El nivel de expresión de hemoglobina en los tejidos de cáncer cervical se evaluó mediante cuantitativa PCR con transcriptasa inversa (QRT-PCR). Se aplicaron varios métodos, tales como RT-PCR, inmunotransferencia, y el análisis inmunohistoquímico, para confirmar la expresión Hgb en células de cáncer de cuello uterino. Los efectos de la expresión ectópica de Hgb y Hgb mutantes en el estrés oxidativo y la viabilidad celular fueron investigados por especies reactivas del oxígeno celulares (ROS) análisis y lactato deshidrogenasa (LDH) de matriz, respectivamente. Se utilizaron tanto ensayo de anexina V tinción por citometría de flujo y ensayo de actividad de caspasa-3, respectivamente, para evaluar la apoptosis celular.
Resultados
QRT-PCR análisis mostraron que HGB-α- (HBA1) y Hgb-β-globina (HBB) la expresión de genes fue significativamente mayor en el carcinoma cervical que en los tejidos cervicales normales, mientras que la expresión de factores de transcripción hematopoyéticos y genes marcadores específicos de eritrocitos no se incrementó. experimentos de inmunotinción confirmaron la expresión de hemoglobina en células de cáncer de cuello uterino. HGB ARNm y proteína también se detectaron en las líneas celulares de carcinoma cervical humano SiHa y CaSki, y la expresión de Hb fue hasta reguladas por el estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno. Es importante destacar que la expresión ectópica de tipo salvaje HBA1 /o HBB HBA1, en lugar de mutantes HBA1
H88R /HBB
H93R incapaz de obligar hemo, suprimió el estrés oxidativo y la mejora de la viabilidad celular.
Conclusiones
los presentes resultados demuestran por primera vez que Hgb se expresa en células de carcinoma de cuello uterino y puede actuar como un antioxidante, atenuar el daño oxidativo inducido por el estrés en células de cáncer de cuello uterino. Estos datos proporcionan un impacto significativo no sólo en globina biología, sino también en la comprensión de la patogénesis del cáncer de cuello uterino asociado con el estrés oxidativo
Visto:. Li X, Z Wu, Wang Y, Mei Q, X Fu, Han W ( 2013) Caracterización de α- Adultos y β-globina elevada por el peróxido de hidrógeno en células de cáncer cervical que juegan un papel citoprotector contra oxidativo insultos. PLoS ONE 8 (1): e54342. doi: 10.1371 /journal.pone.0054342
Editor: O. Russell Pieper, Universidad de California en San Francisco, Estados Unidos de América
Recibido: July 9, 2012; Aceptado: December 12, 2012; Publicado: 17 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación recibió el apoyo de los fondos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (sitio web es http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default 124.htm) (Nº 31201033, 31270820, 81230061 y 81001184) y fue apoyado parcialmente por las subvenciones de la National Science básica y el Programa de Desarrollo de China (sitio web es http://www.973.gov.cn/Default_3.aspx) (núm 2012CB518103 y 2012CB518105). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la hemoglobina (Hgb), la proteína heme importante de eritrocitos, facilita el transporte de oxígeno y dióxido de carbono en la sangre. La molécula de hemoglobina es un conjunto de cuatro subunidades de proteínas globulares. HgbA, el tipo más común de hemoglobina en los seres humanos adultos, es un tetrámero compuesto por dos alfa y beta subunidades que contienen hemo unido por interacciones no covalentes (α
2β
2) [1], [2] . Otros hemo que contiene proteínas de vertebrados con homología estructural con globina cadenas incluyen mioglobina, que se encuentra ampliamente en los corazones de vertebrados y de los músculos estriados y lisos [3], cytoglobin, descritos principalmente en los tejidos conectivos [4], y neuroglobina, ampliamente expresado en el cerebro [ ,,,0],5].
la función común de HGBS como un portador de oxígeno y dióxido de carbono principal de vertebrados es una adaptación relativamente reciente durante la evolución, se requiere para asegurar la entrega correcta de oxígeno a todas las células del cuerpo a través de medios de la red vascular . Además de este papel clásico, HGBS puede realizar otras actividades celulares, incluido el transporte intracelular de oxígeno, sensor de oxígeno, la basura NO, captación de peróxido de hidrógeno, y la regulación del metabolismo del hierro [6]. Los estudios recientes informaron de la detección de cadenas de hemoglobina en otras células que las de la serie eritroide, incluyendo las neuronas [7], [8], [9], las células de la retina [10], [11], las células epiteliales alveolares [12], [ ,,,0],13], [14], [15] endometrio, riñón de rata células mesangiales [16], [17] hepatocitos y macrófagos [18]. Se especuló que la función de Hgb en las neuronas podría ser el almacenamiento de oxígeno [9]. En las células epiteliales alveolares, la expresión de Hgb inducida por hipoxia puede jugar un papel en la vía de detección de oxígeno [14]. análisis de microarrays de líneas de células dopaminérgicas MN9D transfectadas de forma estable con Hgb-α-globina (HBA1) y Hgb-β-globina (HBB) cadenas revelaron cambios en la expresión de genes implicados en la homeostasis de oxígeno y la fosforilación oxidativa mitocondrial [7]. Por otra parte, la sobreexpresión Hgb ha demostrado reducir el estrés oxidativo, lo que sugiere que las funciones de Hb como un antioxidante [16], [17].
El estrés oxidativo es causada por un desequilibrio entre la formación de metabolitos de oxígeno activo y la velocidad a la que se scavenged por antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, y se ha asociado con la patogénesis y las complicaciones de varias enfermedades, incluyendo el cáncer [19]. La sobreproducción o la eliminación inadecuada de especies de oxígeno reactivas (ROS) tales como peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo y anión superóxido se asocia con la carcinogénesis [20] y la invasividad [21]. Enzimática y los mecanismos de defensa antioxidantes no enzimáticos regulan el equilibrio redox celular y por lo tanto la patogénesis de muchas enfermedades. Sin embargo, nuestra comprensión de las funciones de oxidante y sistemas antioxidantes en la carcinogénesis y el desarrollo de tumores sigue siendo limitada. Sorprendentemente, un estudio reciente mostró que las funciones de hemoglobina como un antioxidante peroxidasa, la atenuación de peróxido de hidrógeno inducida por estrés oxidativo [22].
Los avances en la tecnología de microarrays de alto rendimiento han permitido la comparación de perfiles de expresión génica entre los tumores primarios y normales tejidos. Los análisis de la expresión génica basada en la Microarray identificado genes expresados diferencialmente de hemoglobina en los tumores sólidos, incluyendo cáncer de mama [23], carcinoma seroso de ovario [24], y el carcinoma colorrectal [25]. Un estudio reciente demostró que proteómico HBA1 suero y los niveles de HBB fueron significativamente elevados en pacientes con cáncer de ovario en comparación con mujeres sanas normales [26]. Aunque la fuente de libre Hgb en el suero era desconocido, se supone que es el resultado de la hemólisis inducida por el estrés oxidativo. Los mecanismos que subyacen a la regulación de la hemoglobina y sus consecuencias funcionales en tumores sólidos aún no se entiende completamente.
En el presente estudio, mostramos que HGB-α, la cadena de adultos 1 (HBA-A1), y Hgb- β, la cadena de adulto 1 (Hbb-b1) se expresan en células de carcinoma de varios tipos de tumores sólidos. Se detectó la expresión hb en especímenes clínicamente resecado de tejido cervical humana y fue hasta reguladas en los tejidos de cáncer cervical en comparación con los tejidos normales. Por otra parte, nuestros resultados indican que el estrés oxidativo hasta regula la expresión de hemoglobina. Es importante destacar que, Hgb sobreexpresión reduce el estrés oxidativo y la mejora de la viabilidad de células de cáncer cervical. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la hemoglobina puede ser un componente del sistema de defensa antioxidante endógeno, la protección de las células contra el daño oxidativo en pacientes con cáncer de cuello uterino.
Resultados
El aumento de expresión de genes de hemoglobina en cáncer de cuello uterino muestras
Para investigar los genes expresados diferencialmente en el cáncer de cuello uterino, se analizó un conjunto de datos de microarrays publicado anteriormente incluyendo cáncer de cuello uterino 33 y 24 muestras normales. En comparación con el epitelio normal de cuello uterino, cáncer de cuello uterino muestras mostraron una elevación significativa en la expresión de genes y HBA1 HBB (Tabla 1). Sin embargo, la expresión de factores de transcripción para la diferenciación eritroide [27], incluyendo NFE2, KLF1 /EKLF, TAL1 /SCL y GATA1 no aumentó. Además, la expresión de otros genes de la hemoglobina (HBD, HBE1, HBG2, HBQ1 y HBZ) y genes marcadores de eritrocitos específica, tales como SPTB, ERAF y ALAS2 no mostró un aumento significativo. Estos resultados sugieren que los niveles elevados HBA1 y expresión HBB en el cáncer cervical no eran el resultado de la eritropoyesis, sino de un mecanismo diferente.
Con el fin de validar el papel potencial de la Hb en el carcinoma cervical humano, los niveles de expresión HBA1 de HBB y se investigaron en 20 muestras de cáncer de cuello uterino y 10 muestras de tejidos normales del cuello uterino por QRT-PCR análisis. Los cebadores específicos de HBA1 y HBB fue diseñada para QRT-PCR de acuerdo con el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) de base de datos. La especificidad de los cebadores para la amplificación HBA1 y HBB se confirmó usando ARN extraído de la médula ósea humana y la sangre periférica como control positivo (Fig. 1A). En primer lugar, se realizó el experimento de RT-PCR para determinar los niveles de expresión de genes y HBA1 HBB en 20 muestras de cáncer de cuello uterino (Fig. 1B). De acuerdo con el conjunto de datos de microarrays, análisis de QRT-PCR mostró que la expresión de HBA1 y HBB fue significativamente mayor en tejidos de cáncer de cuello uterino que en los tejidos del cuello uterino normal (Fig. 1C y D). Sin embargo, la expresión de factores de transcripción para la eritropoyesis, incluyendo GATA-1, KLF1, y SCL /TAL1 [27], no se ha cambiado significativamente en los tejidos de cáncer de cuello uterino en comparación con los controles (datos no mostrados). La expresión de los genes marcadores de eritrocitos específicos, tales como SPTB, ERAF, no fue hasta reguladas en los tejidos de cáncer de cuello uterino, lo que indica que el aumento de la expresión de hemoglobina no se asoció con la eritropoyesis. Estos resultados sugieren que Hgb puede jugar un papel en el desarrollo del cáncer cervical humano.
(A) Para confirmar la especificidad de los cebadores y HbA1 HBB para QRT-PCR, expresión de HBA1 y HBB se examinó en la médula ósea humana y células de sangre periférica. Retrotranscriptase libre de (-) como un control negativo, H
2O como un control del sistema. Sr, Marcador. (B) ADNc a partir de muestras de cáncer de cuello uterino se preparó y se analizó para la expresión de HBA1 y HBB por RT-PCR. Los productos de PCR se separaron en 2% de geles de agarosa y se visualizaron con bromuro de etidio. GAPDH se utilizó como control de carga. H
2O como un control del sistema, T, representa muestras de tumores primarios. Los niveles de expresión de HBA1 y HBB se midieron mediante qRT-PCR en 20 muestras de cáncer cervical humano y 10 controles normales de tejido cervical. La cuantificación de la HBA1 normalizado indicado y los niveles de HBB (log
10) del cuello del útero total de no apareado normal (n = 10) y el cáncer cervical se muestran (n = 20) muestras. Las cajas de Tukey representan los cuartiles superior e inferior, dividido por la mediana y los bigotes son los valores mayor y menor, con exclusión de los valores atípicos representados por círculos. Todas las diferencias fueron estadísticamente significativas a
P
. & Lt; 0,05 (C y D) guía empresas
detección de la proteína hemoglobina en los tejidos de carcinoma cervical
La expresión de hemoglobina a nivel de proteínas se examinó usando anticuerpos comerciales contra altamente purificada Hgb humano. Debido a la alta homología entre globina proteínas de la familia, la especificidad del anticuerpo para la detección de las cadenas HbA1 y HBB se verificó mediante la transfección de riñón embrionario humano HEK293 células con vectores de expresión que llevan EGFP-etiquetados globina isoformas (HBA-a1, Hbb-b1 , HBA-x, Hbb-y, HBA-z), que no mostró reacción cruzada con otras globinas en los experimentos de inmunotinción (Fig. S1). Para evitar la reactividad cruzada con células de la sangre, los tejidos de cáncer de cuello uterino se lavaron extensivamente en PBS antes de la fijación. Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción de secciones de tejido de cáncer de cuello uterino mostraron bien carcinoma de células escamosas diferenciadas (Fig 2A y B).. En los tejidos cancerosos, y HBA1 HBB mostraron un patrón de tinción citoplasmática difusa (Fig. 2D y F). Un anticuerpo monoclonal IgG no específica se diluyó con PBS se utilizó como control negativo (Fig 2C y E).
Secciones de tejidos de cáncer cervical humano embebidos en parafina se sometieron a cualquiera de H & amp;. E manchas o análisis immnunohistochemical con HBA1 y anticuerpos HBB. muestras de cáncer de cuello del útero mostraron carcinoma de células escamosas bien diferenciado (A y B). S, estroma. La tinción citoplasmática de HBA1 y HBB se detectó en muestras de biopsia de tejidos del cuello uterino (D y F). Un anticuerpo IgG monoclonal no específico diluido con PBS se utilizó como control negativo (C y E). Doble inmunotinción contra p16
INK4A, un marcador específico de cáncer cervical, demostró que la Hgb se expresó en células de cáncer cervical (I, K, M y O). Blanco precipitó cajas fueron aumentados digitalmente (J, L, N y P). Inmunofluorescencia y sin anticuerpo primario reveló señales insignificantes en células de cáncer cervical (G y H).
La expresión de la proteína hemoglobina en los tejidos de carcinoma uterino fue confirmada por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo específico contra la hemoglobina, que mostró distinta patrones de tinción citoplasmática difusa en los tejidos de cáncer de cuello uterino (Fig. 2I). La omisión del anticuerpo primario en el mismo sistema de inmunotinción sirvió como control negativo (Fig. 2G y H). Doble inmunotinción usando anticuerpos policlonales con reactividad cruzada contra HBA1 y HBB y un anticuerpo específico para p16
INK4A, un marcador específico de cáncer cervical utiliza para citología y diagnóstico histológico [28], [29], mostró la co-localización de Hb con p16
INK4A en tejidos de cáncer de cuello uterino (Fig. 2I-P). Estos resultados confirmaron que la proteína hemoglobina se expresa en células de cáncer de cuello uterino.
La detección de hemoglobina ARNm y proteínas en cultivos de células de cáncer cervical
La expresión de hemoglobina fue examinado en el mRNA y los niveles de proteína con las líneas de células de carcinoma de cuello uterino humano CaSki SiHa y se cultivaron
in vitro
para verificar nuestro
in vivo
resultados de la expresión de Hb en células de cáncer de cuello uterino. análisis de RT-PCR usando ARN de células de sangre humana como control positivo mostró la presencia del ARNm para la HBA1 y cadenas HBB de Hgb humano en células de cáncer cervical cultivadas (Fig. 3A). La secuenciación de los productos de PCR demostró que acertaron 100% con HBA1 (NM_000558) y las secuencias de ARNm HBB (NM_000518). De acuerdo con estudios anteriores en células alveolares y hepatocitos [12], [17], la expresión de HBA1 fue aproximadamente 9,6 veces más alta que la de HBB de QRT-PCR (datos no mostrados). El análisis de transferencia de Western usando anticuerpos específicos contra HBA1 y HBB mostró bajos niveles de expresión de la proteína Hgb en las líneas celulares analizadas. Proteína extraída de leucocitos de sangre periférica (PBL) se utilizó como control positivo (Fig. 3B). La inmunoprecipitación reveló una banda clara de 17 kDa que se enriqueció específicamente a partir de lisados de células (Fig. 3C). Aprovechando andibodies comerciales producidos contra HBA1 humana y HBB, se realizó análisis de inmunofluorescencia para examinar la localización de la proteína Hgb en las células SiHa, que mostró un patrón de tinción citoplásmica similar de la HBA1 y formas HBB que la de los tejidos de cáncer de cuello uterino (Fig. 3D-G). Haga doble inmunotinción reveló que la Hb fue co-localizada con el cáncer de cuello uterino marcador p16
INK4A (Fig. 3H-J). Se obtuvieron resultados similares en otra línea celular de cáncer cervical, CaSki (Fig. S2), lo que confirma la expresión de Hgb en células de cáncer cervical cultivadas. En particular, los dos tipos de células expresan más HBA1 de HBB en los niveles de mRNA y proteína. Como es probable que actúe como heterotetrámero de dos subunidades diferentes Hgb, nos aprovechamos de los experimentos de co-inmunoprecipitación para interrogar si HBA1 y expresión HBB en el cáncer de cuello uterino son capaces de formar heterodímeros. Como se puede ver en la Fig. S3, la débil presencia de HbA1 heterodímeros endógenos /HBB se confirmó por experimentos de co-inmunoprecipitación.
(A) amplificación por RT-PCR de HBA1 y HBB de SiHa, células CaSki y RNA sangre humana. El HBA1 y transcripciones HBB se amplían claramente a partir de las líneas celulares de cáncer cervical humano, SiHa y CaSki. RNA extraído de sangre se utilizó como control positivo y se detectó GAPDH como control de carga. identidades de amplicón se confirmaron por secuenciación. (B) HBA1 y HBB se analizaron por Western Blot. leucocitos de sangre periférica (PBL) se utilizaron como un control positivo y β-actina se detectó como control de carga. (C) Cell lisados de células SiHa y CaSki se inmunoprecipitaron y a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. Una banda clara de 17 kDa se enriqueció a partir SiHa y CaSki lisados mediante inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti-hemoglobina humana. IgG no específica se utilizó como control inmunoprecipitación. La tinción citoplasmática de HBA1 y HBB se detectó en células de cáncer cervical (D y E, F y G). -Doble inmunotinción con p16 INK4A
, un marcador específico de cáncer cervical para citología y el diagnóstico histológico, demostró que la Hgb fue expresada por células de cáncer cervical (H-J). Los insertos se amplíen las imágenes de las áreas seleccionadas (pequeños cuadrados).
Sobre regulación de HBA1 y Expresión HBB en células de cáncer cervical por el estrés oxidativo
Para determinar si la función de la hemoglobina en nonerythrocytes es diferente de su papel más conocido como portador de oxígeno, se analizó la expresión de la proteína en las células SiHa y CaSki en respuesta al estrés oxidativo en base a evidencia previa de las propiedades antioxidantes de la Hb. El tratamiento de células SiHa con H
2O
2 aumentó la expresión de HBA1 y HBB en el ARNm y los niveles de proteína (Figs. 4A y B). Se obtuvieron resultados similares en otra línea celular de cáncer de cuello uterino, CaSki (Fig. S4). La inducción de la Hb por H
2O
2 se confirmó en células HEK293 (Fig. 4C), lo que sugiere que la expresión de hemoglobina puede ser de hasta reguladas por el estrés oxidativo en diferentes tipos de células.
(A ) HBA1 HBB y la expresión de ARNm en células SiHa fue inducida por H
2O
2 tratamiento. células SiHa se trataron con H
2O
2 (1 mM) durante 24 h y los niveles de Hgb de ARNm se determinaron mediante qRT-PCR. Los niveles de hemoglobina en los controles se normalizaron a 1. Los datos se expresaron como media ± SD (n = 3)
**
P
. & lt; 0,01. (B) la expresión de la proteína y HBA1 HBB fue inducida por H
2O
2 tratamiento. Lisados de células enteras obtenidos a partir de células SiHa tratados con o sin H
2O
2 (1 mM, 48 h) se analizaron para HBA1 y los niveles de HBB. β-actina se utilizó como control de carga. (C) HBA1 y HBB ARNm fueron reguladas por H
2O
2 de tratamiento en las células HEK293. Las células HEK293 fueron tratados con H
2O
2 (1 mM, 36 h). productos de la PCR de transcripción inversa se separaron en 2% de geles de agarosa y se visualizaron con bromuro de etidio. GAPDH se utilizó como control de carga. (D) de la dosis y el tiempo de dependencia de la respuesta de las células SiHa para H
2O
2 de tratamiento. células SiHa fueron tratados con una serie de concentraciones (0, 0,25, 0,5 y 1 mM) de H
2O
2 de 8, 16, 24 o 36 h. el nivel de ARNm HBA1 relativa se determinó mediante qRT-PCR. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (n = 3). Los valores se normalizaron al nivel HBA1 en el control (0 mM, 8 h), que se establece en 1. Se utilizó una vía de prueba de ANOVA para comparaciones múltiples para analizar las diferencias entre los tratamientos.
**
P Hotel & lt; 0,01;
***
P
. & Lt; 0,001, en comparación con el tratamiento 0 mM
Para examinar la posible dosis y el tiempo de dependencia de la H
2O
2-inducida sobre regulación de la hemoglobina, células SiHa fueron tratados con diferentes H
2O
2 concentraciones en distintos periodos temporales y analizados por QRT-PCR estándar. Como se ve en la Fig. 4D, H
2O
2 aumentó los niveles de Hb de ARNm de una manera dosis-y tiempo-dependiente. El efecto del estrés oxidativo sobre la expresión de GATA-1 y KLF1, que son factores de transcripción que regulan la expresión de Hgb durante la eritropoyesis, se examinó. En consonancia con un estudio previo en hepatocitos [17], la sobre regulación de la Hb por H
2O
2 no estaba mediada por GATA-1 y KLF1, lo que sugiere que un mecanismo subyacente diferente puede estar involucrado (Fig. S5 ).
Atenuación de ROS Generación y apoptosis inducción por HBA1 /o HBB HBA1, pero no HBA1
H88R /HBB
H93R sobreexpresión en células cervicales cáncer
Para investigar la biológica papel de la Hgb en células de cáncer cervical, y HBA1 HBB se sobreexpresa por transfección transitoria de células SiHa. El aumento de expresión de HBA1 y HBB se confirmó por inmunotransferencia (Fig. 5A). Sobre la base de un estudio previo que muestra que ciertos genes inducibles estrés oxidativo tienen funciones antioxidantes [30], la hipótesis de que la hemoglobina puede tener propiedades antioxidantes en las células de cáncer de cuello uterino en respuesta al estrés oxidativo. por lo tanto, se examinaron los niveles intracelulares de ROS en células tratadas con H
2O
2 utilizando sondas fluorogénicos y el anión superóxido. La expresión ectópica de HBA1 /HBB en las células SiHa tratados con exógeno H
2O
2 suprime la producción intracelular de H
2O
2 y anión superóxido como se determina por el análisis de inmunofluorescencia (Fig. 5B y C) . La cuantificación de la producción de ROS por citometría de flujo demostró que la intensidad de fluorescencia en las células que sobreexpresan HBA1 /HBB fue significativamente menor que en las células transducidas con lentivirus de control (Fig. 5D y E). Porcentaje por célula total de contar con altos niveles de cada ROS en células que sobreexpresan HBA1 /HBB fue significativamente reducido en comparación con la transfección con el vector vacío como control (
P
& lt; 0,05, n = 3 para cada grupo; Fig . 5F y G). Se observaron resultados similares en las células CaSki (datos no mostrados). El hecho de que el nivel de expresión de HBA1 en líneas celulares de cáncer de cuello uterino es mayor que la de HBB sugiere que múltiples moléculas bioactivas, no sólo las formas de heterodímero, sino también a las formas monoméricas o homodímero de la proteína HBA1 pueden estar presentes al mismo tiempo en el cáncer cervical Células. En apoyo de esta idea, las células SiHa fueron meramente transfectadas con HBA1 y luego tratados con exógenos H
2O
2. De acuerdo con un estudio reciente [31], el porcentaje total de células por conteo con los niveles intracelulares de ROS en células que sobreexpresan HBA1 fue significativamente más bajo que en las células transfectadas con el vector de control (Fig. 5H). Para descartar cualquier efecto generalizado o no selectiva debido a la sobreexpresión no específica de protiens, hemos generado una línea celular que expresa una forma inactiva de la Hb llevar a un cambio de aminoácido en la Su responsable de coordinar el grupo hemo prostético (HBA1
H88R [ ,,,0],31] y HBB
H93R, Fig. S6). Como se puede ver en la Fig. 5I, los niveles intracelulares de ROS en células que sobreexpresan HBA1
H88R /HBB
H93R no se redujo significativamente, en comparación con la de las células transfectadas con el vector vacío, lo que sugiere que se requiere la actividad de hemo de unión para la función antioxidante Hgb.
(a) lisados de células enteras a partir de células SiHa transfectadas con un plásmido control o HBA1 y HBB plásmidos de expresión se analizaron con un anticuerpo anti-Hb para confirmar la sobreexpresión de proteínas de globina. Control y células que sobreexpresan HbA1 /HBB- se tiñeron con sondas fluorogénicos para detectar intracelular H
2O
2 y anión superóxido y se expusieron a extracelular H
2O
2 (1 mM) durante 10 min. La inmunotinción confirmaron que la generación intracelular de H
2O
2 (B) y anión superóxido (C) fue suprimida en las células /HBB-overexpressing HbA1. Citometría de flujo análisis confirmó estos resultados (D y E) y demostró que los niveles intracelulares de H
2O
2 y anión superóxido fueron más altos en las células expuestas a los estímulos extracelulares que en las células no tratadas (B y C). Los análisis cuantitativos confirmaron que la generación intracelular de H
2O
2 (F) y anión superóxido (G) se inhibió en las células HbA1 /HBB sobreexpresan (columna negro) más que en las células control (columna gris;
P Hotel & lt; 0,05). Los análisis cuantitativos confirmaron que la generación intracelular de ROS se redujo en las células HbA1 sobreexpresan (columna negro, H), pero no en HBA1
H88R /HBB
H93R que sobreexpresan las células (columna negro, I) más que en el control Las células que sobreexpresan vector (columna gris). *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01;
N
P Hotel & gt;.
0,05
Un lactato deshidrogenasa (LDH) ensayo de citotoxicidad, que mide la liberación de LDH en el medio de cultivo, se realizó para examinar la viabilidad celular bajo estrés oxidativo. células SiHa sobreexpresan HBA1 y HBB mostraron tasas de liberación de LDH de 22,1 ± 2,2% y el 32,5 ± 3,4% en respuesta al tratamiento con 0,5 mM y 1 mM H
2O
2 durante 24 h, respectivamente, en comparación con 29,6 ± 3,1 % y 34,6 ± 2,1%, respectivamente, en las células transfectadas con el vector vacío (
P
& lt; 0,01 y
P
& lt; 0,05 para 0,5 y 1 mM H
2O
2, respectivamente; n = 3 para cada grupo) (figura 6A).. la viabilidad celular SiHa también se mejoró por la sobreexpresión HBA1 y HBB cuando las células se trataron con 0,5 mM y 1 mM H
2O
2 durante 36 h (
P
& lt; 0,01). Se obtuvieron resultados similares en HBA1-sobreexpresión células SiHa (Fig. 6B). a continuación, se investigó si la función de Hb para mejorar la viabilidad de las células depende de su actividad de unión a hemo, utilizando el HBA1
H88R /HBB
H93R mutantes, que son incapaces de unirse hemo, pero conservar la cadena de conformación. Como se puede ver en la Fig. 6B, la mutación del Su responsable de coordinar el grupo prostético hemo (HBA1
H88R y HBB
H93R) de HgbA perjudica su capacidad para mejorar la viabilidad celular.
(a) la viabilidad de las células SiHa tratados con 0, 0,5, y 1 mM h
2O
2 para 12, 24 y 36 h como el estrés oxidativo extracelular se evaluó por el ensayo de liberación de LDH. células SiHa transfectadas con los vectores de HBA1 /HBB que expresan (columna negro) mostraron una mayor resistencia contra H
2O celular inducida por 2
comparación con las células transfectadas con el vector de control (columna gris). Similares experimentos se realizan en las células tanto HBA1-sobreexpresión y HBA1
H88R /HBB
células H93R-sobreexpresión (B). células SiHa fueron transfectadas con los plásmidos indicados. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células fueron tratadas con 1 mM H
2O
2 o dejan sin tratamiento durante 22 h. El porcentaje de células apoptóticas se controló mediante tinción con Anexina V seguido por el análisis FACS (C). SiHa células fueron transfectadas con los plásmidos indicados y cuarenta y hora más tarde, fueron tratados como en (A), la actividad de la caspasa-3 en diferentes grupos se midió usando el sustrato de la caspasa específico AcDEVD-pNA como se describe en Materiales y Métodos. Los valores de la absorción se expresaron como el control que se estableció como 1 (D y E). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces, y los resultados se expresan como medias ± S.E.M. *
P
. & Lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01;
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0,05
ROS (superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo) son oxidantes intracelulares potentes e inductores de daño oxidativo, que se han propuesto como reguladores críticos de la apoptosis [32] y los tratamientos con antioxidantes protegen a las células de la apoptosis [33]. Dado que la presencia de Hgb (ya sea HBA1 o HBA1 /HBB) conduce a reducir la producción de ROS interacellular, es concebible que estas células conservan la capacidad para protegerse de insultos oxidativos. Por lo tanto, hemos planteado la cuestión de si la protección mediada por la Hb contra la muerte celular en las células SiHa fue simplemente debido a la reducción de la acumulación intracelular de ROS. Hemos explorado esta posibilidad mediante la determinación del efecto de HBA1 tipo salvaje /HBB, HbA1 y mutantes HbA1c
H88R /HBB
H93R-sobreexpresión en H
2O
2 inducida por la apoptosis mediante análisis de citometría de flujo utilizando células SiHa. Como se muestra en la Fig. 6C, los resultados mostraron que la población de las células apoptóticas inducidas por H
2O
2 se inhibió tanto en HBA1 y células /HBB-sobreexpresión HbA1, pero no en HBA1
H88R /HBB
H93R -overexpression células. La activación de una cisteína proteasa, llamada caspasa-3 y la generación de ROS se considera pasos clave en la inducción de la muerte celular [34] y se sabe que la generación de ROS en la mitocondria activa la caspasa-3 a través de la cooperación de citocromo
c
, Apaf-1 y la caspasa-9 [35]. A continuación se investigó el efecto de la Hgb en la activación de caspasa-3. De acuerdo con el ensayo de unión de Anexina V, se encontró que el aumento de la activación de la caspasa-3 causada por 0,5 mM y 1 mM H
2O
2 después de la incubación durante 12, 24 y 36 h, respectivamente, se podría reducir significativamente tanto en células HBA1 /HBB-sobreexpresión HBA1 y, en comparación con el vector vacío (Fig. 6D). Por el contrario, la expresión ectópica de HBA1
H88R /HBB
H93R en las células SiHa no fue eficaz en la prevención de H
2O
2 inducida por la activación de la caspasa-3 (Fig. 6E), lo que sugiere que heme- se requiere la actividad de unión para su función. En resumen, estos resultados sugieren que tanto HBA1 y HBA1 /HBB sobreexpresión pueden tener un efecto antioxidante a través de la compactación de los ROS, protegiendo así las células de cáncer de cuello uterino contra el daño oxidativo inducido por el estrés.
Discusión
el presente estudio, se demostró que la expresión de Hb fue elevado en los tejidos de cáncer de cuello uterino en comparación con los tejidos normales del cuello uterino. Esta es la primera evidencia de que las cadenas alfa- y β-globina de Hb se expresan en células de cáncer de cuello uterino. Se utilizaron las líneas celulares de carcinoma cervical SiHa y CaSki para examinar HGB-α y β-Hb ARNm y la expresión de proteínas usando tres enfoques diferentes: RT-PCR, la inmunotinción y Western blot. Por otra parte, la Hb atenuada peróxido de hidrógeno inducida por el estrés oxidativo en las células de cáncer cervical, que actúa como antioxidante.
La larga noción de que la hemoglobina se expresa sólo en las células de linaje eritroide ha sido cuestionado en estudios recientes que muestran Hgb expresión en nonerythrocytes, incluyendo las neuronas [7], [8], [9], células de la retina [10], [11], las células del epitelio alveolar [12], [13], [14], endometrio [15], de riñón de rata células mesangiales [16], [17] hepatocitos y macrófagos [18]. La función principal de Hgb en los eritrocitos es el transporte de oxígeno desde los pulmones a los tejidos y para el transporte de dióxido de carbono desde los tejidos a los pulmones. La función biológica de la hemoglobina en las células no eritroides que queda por esclarecer y su función fisiológica es todavía un tema de debate. Hgb sobreexpresión en una línea de células dopaminérgicas murino, MN9D, altera la expresión de diversos genes implicados en la homeostasis de oxígeno y la fosforilación oxidativa mitocondrial, lo que sugiere que Hgb puede funcionar como una molécula de almacenamiento de oxígeno en las neuronas [9]. sobreexpresión hb en la rata renales línea celular mesangial SV40-MES13 y la línea celular de cáncer hepatocelular humano HepG2 reducido por hidrógeno peróxido induce estrés oxidativo, lo que sugiere que las funciones de hemoglobina como antioxidante [16], [17].
Aunque