Extracto
Tip60 (KAT5) es una histona acetiltransferasa (HAT enzima) que participan en múltiples procesos celulares incluyendo la regulación de la transcripción, reparación de daños en el ADN y la señalización celular. En el cáncer de próstata, los casos agresivos sobre-expresa Tip60 que funciona como un receptor de andrógenos co-activador a través de la acetilación directa de residuos de lisina en el motivo KLKK de la región bisagra receptor. El propósito de este estudio fue identificar y caracterizar un inhibidor acetylase Tip60. La selección de alto rendimiento reveló un isotiazol que inhibe tanto la actividad p300 HAT y Tip60. Esta sustancia (inicialmente identificado como 4-metil-5-bromoisothiazole) y otros isotiazoles se sintetizaron y se ensayaron contra Tip60. A pesar de una muestra auténtica de 4-metil-5-bromoisothiazole fue inactivo contra Tip60, en un
in vitro
ensayo de HAT en, 1,2-bis (isotiazol-5-il) disulfano (NU9056) fue identificado como una relativamente potente inhibidor (IC
50 2 M). La actividad celular se confirmó por análisis de la acetilación de las proteínas histonas y no histonas en un modelo de línea celular de cáncer de próstata. tratamiento NU9056 inhibió la proliferación celular en un panel de líneas celulares de cáncer de próstata (inhibición del crecimiento del 50%, 8-27 mM) y la apoptosis inducida por la activación de caspasa 3 y caspasa 9 de una manera de la concentración y dependiente del tiempo. Además, la disminución de receptor de andrógenos, el antígeno específico de la próstata, los niveles de p53 y la proteína p21 se demostraron en respuesta al tratamiento con NU9056. Además, el tratamiento previo con NU9056 inhibió tanto la fosforilación de ATM y la estabilización Tip60 en respuesta a la radiación ionizante. Sobre la base de la actividad de NU9056 y la especificidad del compuesto hacia Tip60 en relación con otras enzimas sombrero, estos estudios de biología química han identificado Tip60 como una posible diana terapéutica para el tratamiento de cáncer de próstata
Visto:. Coffey K, Blackburn TJ, Cook S, Golding BT, Griffin RJ, Hardcastle IR, et al. (2012) Caracterización de un inhibidor específico Tip60, NU9056, en el cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (10): e45539. doi: 10.1371 /journal.pone.0045539
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 18 de abril de 2012; Aceptado 21 de agosto de 2012; Publicado: 8 Octubre 2012
Copyright: © Coffey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionado por el Cancer Research UK (CRUK) (C240 /A7409; C29821 /A10348) (www.cancerresearchuk.org) y el Consejo de Investigación médica (MRC) del sistema (G0100100 /64424) (www.mrc.ac.uk). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. KH fue empleado por OSI Pharmaceuticals, Inc. compuestos discutidos en este artículo no están patentados , en el desarrollo o siendo comercializado por esta empresa. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
acetilación y desacetilación de histonas son acontecimientos clave en la regulación de la estructura de la cromatina. histona acetiltransferasas (HAT) catalizan la adición de grupos acetilo a la terminal de ε-amino de residuos de lisina dentro de histonas. resultados de acetilación en una estructura de cromatina abierta mediante la eliminación de las cargas positivas de las histonas, lo que induce cambios conformacionales en proteínas, lo que permite la maquinaria transcripcional para acceder al ADN y promover la actividad transcripcional. desacetilasas de histonas (HDAC) se oponen a este proceso mediante la promoción de una estructura de la cromatina cerrado, que se reprime transcripcionalmente. Por otra parte, las marcas de acetilación de histonas pueden funcionar como sitios de atraque para otras proteínas para interpretar el "código de histonas"; por ejemplo, el motivo tripartito que contiene 24 (trim24) se ha descrito recientemente como una proteína "lector", que reconoce tanto la histona H3 no modificado en la lisina 4 y la histona H3 acetilada en la lisina 23 de la misma cola de la histona resulta en una mayor expresión de genes [1] . Además, las proteínas no histonas tales como p53 [2], [3], ataxia telangiectasia mutada (ATM) [4] y el receptor de andrógenos (AR) [5], [6] también puede ser acetilada que resulta en actividad de la proteína alterada. Por lo tanto, la acetilación de proteínas y desacetilación puede tener efectos significativos sobre la función celular, y para las células para mantener el crecimiento normal y la diferenciación es importante que estas dos funciones mantener el equilibrio. En apoyo de este concepto, se han encontrado inhibidores de HDAC tener amplias efectos celulares y la actividad clínica en la leucemia [7], [8], con vorinostat (SAHA) está aprobado para uso clínico en esta enfermedad. La modulación de la acetilación de histonas tiene claramente un potencial terapéutico.
Tip60, recientemente rebautizada KAT5, es un miembro de la familia de enzimas MYST HAT identificado por primera vez en 1996 [9]. Desde entonces se han encontrado muchas funciones celulares para usar esta proteína. La pérdida de TIP60 en alteración de la reparación del ADN, como este sombrero se activa en respuesta a la radiación ionizante (IR), haciendo que la acetilación de histonas y la activación de p53 y ATM [4]. por lo tanto, la inhibición de la Tip60 debe sensibilizar a las células a agentes que dañan el ADN utilizados como agentes terapéuticos contra el cáncer. TIP60 funciones también en la ruta de NF-kB, a través de interacciones con las células B de CLL /linfoma 3 (BCL-3) [10] y dependiente de cAMP de señalización [11]. Además, Tip60 puede funcionar como un co-activador para un número de receptores de hormonas esteroides, incluyendo la AR, que está implicado en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata (CaP). Los estudios han demostrado que la AR puede ser acetilado por una serie de enzimas sombrero, incluyendo p300, p300 /CBP factor de asociado-(PCAF) y Tip60, para aumentar su actividad transcripcional [6], [12]. AR acetilación se cree que regulan el reclutamiento de co-activadores a la maquinaria transcripcional de genes sensibles a los andrógenos [13]. Además, Tip60 es funcionalmente hasta regulado en muestras de CaP clínicos y la expresión se correlaciona con la progresión de la enfermedad [14]. En contraste, un informe sugiere que Tip60 es necesaria para expresar la metástasis KAI1 supresor de tumores en líneas celulares de CaP, lo que sugiere que Tip60 es un gen supresor tumoral [15]. Del mismo modo, un estudio de genes knockout Tip60 propuso Tip60 como un supresor tumoral Haplo-insuficiente en las etapas pre y principios-tumorales de linfoma, mama y cánceres de cabeza y cuello [16]. Sin embargo, los estudios sobre muestras de próstata clínicos contradicen esta sugerencia y apoyan Tip60 como un oncogén en cáncer de próstata [13], [17]. Por lo tanto, la orientación de la actividad acetylase Tip60 podría ser una estrategia terapéutica útil en cáncer de próstata
.
Se han identificado un pequeño número de inhibidores de sombrero. El acoplamiento de un péptido de histona H3 a CoA para formar un inhibidor bisustrato de actividad HAT se ha descrito; sin embargo, el compuesto tiene poca permeabilidad de la membrana celular [18]. Los productos naturales de ácido anacárdico y garcinol son inhibidores de sombrero que sean permeable a las células; que sensibilizar a las células a IR, que podrían ser útiles como una terapia de combinación para el tratamiento del cáncer. Otros inhibidores de la función SOMBRERO incluyen butirolactonas alfa-metileno [19], acetonas bencilideno [20] y malonatos alquilideno [21]. Más recientemente, isotiazolonas, que se unen covalentemente a la HAT sitio activo tiol, se han descrito como un punto de partida eficaz para enfoques basados en la modelización molecular para la generación de inhibidores más potentes y específicos [22] - [24]. En el presente estudio se empleó un enfoque de cribado de alto rendimiento para identificar inhibidores selectivos de Tip60. Sobre la base de la molécula de plomo, compuestos estructuralmente relacionados se generaron y ensayaron para la inhibición HAT y especificidad Tip60 con el fin de identificar una herramienta molecular para estudios en modelos de líneas celulares de CaP.
Resultados
Alto Rendimiento pantalla (HTS) y Hit Validación
una campaña de cribado de alto rendimiento para los inhibidores TIP60 se realizó en OSI Pharmaceuticals Ltd. los ensayos basados en la pantalla ALPHA ™ y formatos DELFIA ™ se han desarrollado y utilizado para rastrear una colección de compuestos estructuralmente diversos (~80,000 miembros). Se identificó una serie de éxitos de la pantalla principal ALPHA ™. Sin embargo, la mayoría de ellos no mostraron una actividad significativa en la pantalla secundaria. Un solo compuesto OXA-10 (inicialmente identificado como 4-metil-5-bromoisothiazole, 1), fue identificado como un éxito en ambas pantallas y la actividad se repitió con el material de la recompra. Recomprar OXA-10 mostró actividad contra Tip60 (IC
50 1,1 M - Figura 1) y p300 (IC
50 2,7 M) (Tabla 1), pero no otros acetiltransferasas de histonas, por ejemplo PCAF y GCN5 (IC
50 & gt; 100 mM). análisis LC-MS de la muestra readquirido de OXA-10 indicó la presencia de ~ 80% de 4-metil-5-bromoisothiazole 1, pero mostró que contenía ~ 20% de una impureza desconocida. Con el fin de validar 1 como el inhibidor activo de Tip60 en OXA-10, se llevó a cabo la síntesis de 1, junto con análogos, a fin de desarrollar relaciones de actividad de estructura. Los detalles de la síntesis química (Figura 2) se pueden encontrar en la información complementaria.
Para evaluar la actividad frente a Tip60 HAT,
in vitro
ensayos Hat utilizando
3H acetil-CoA se llevaron a a cabo utilizando las histonas como sustratos. Los ensayos se realizaron por cuadruplicado y se repitieron dos veces. Para los compuestos que producen & gt; 50% de inhibición a 100 M, IC se calcularon
50 valores. Se presentan individuales IC
50 valores. Para otros compuestos se presenta el% de inhibición a 100 mM.
La especificidad de NU9056 para Tip60 acetiltransferasa
NU9056 (7), así como los compuestos 5 y 6, se ensayaron para
in vitro
actividad frente a un panel de enzimas recombinantes HAT, incluyendo p300, PCAF y GCN5, para determinar si presentan una mayor especificidad hacia Tip60 que el compuesto 1. ICR CCT129182, que se ha demostrado tiene actividad inhibidora frente a p300 y PCAF, también fue probado [24]. Se encontró un número de compuestos para inhibir la actividad de Tip60 a bajas concentraciones micromolares (Figura 1; Adicional Figura S1). Sin embargo, se encontró especificidad hacia Tip60 sobre otras enzimas HAT probados para ser más grande con el compuesto 7 (NU9056) como se muestra en la Tabla 1 (16.5-, 29- y & gt; 50 veces para la selectividad para Tip60 sobre PCAF, p300 y GCN5, respectivamente ).
NU9056 Inhibe la acetilación de proteínas en líneas celulares de cáncer de próstata
Tip60 acetylates proteínas histonas, las histonas H2A y H4 en concreto, en un contexto nucleosomal [25]. Además,
in vitro
estudios han demostrado que Tip60 puede también núcleo acetylate histonas H2A (Lys 5), H3 (Lys 14) y H4 (Lys 5, Lys 8, Lys 12 y Lys 16) [26], [27]. Para probar si NU9056 podría inhibir la acetilación de las proteínas endógenas dirigidas por Tip60, se utilizaron células LNCaP ya que son un modelo representativo de la tapa dependientes de andrógenos. El estado de acetilación de la histona H4 en la lisina 8 (H4K8) y 16 (H4K16) y la histona H3 en la lisina 14 (H3K14) se ha investigado en estas células por transferencia Western. Además, el nivel de Tip60 se evaluó después del tratamiento con NU9056 y el compuesto de control, 1,2-bis (4-piridil) etano (Figura 3A) que demuestra que los niveles de TIP60 mismos no se ven afectadas. A medida que los niveles basales de estas marcas de histona acetilados son bastante bajos, se introdujo el tricostatina inhibidor de HDAC A (TSA) para eliminar la influencia de la actividad HDAC en la acetilación en el ensayo celular. En presencia de TSA solo, acetilación se incrementó a H4K8, H4K16 y H3K14 (Figura 3B), en consonancia con los informes anteriores [28] - [30]. Las concentraciones crecientes de NU9056 como resultado niveles disminuidos de acetilado histona H4K16, H3K14 y H4K8, objetivos para la acetilación mediada por Tip60 (Figura 3C). Por otra parte, el compuesto de control, 1,2-bis (4-piridil) etano, no afecta a ninguna de las modificaciones de las histonas estudiados
Parte 1 -. La síntesis de compuestos 4-7. Parte 2 - Síntesis de los compuestos 1 y 11.
células LNCaP se trataron con concentraciones crecientes de NU9056 o el compuesto de control, 1,2 bis (4-piridil) etano durante 24 horas. (A) Los niveles de Tip60 se evaluaron por Western Blot. (B) células LNCaP fueron tratadas con 2 mM TSA durante 6 horas y los niveles de la histona H4 acetilada-lisina 16, la histona H4 acetilada-lisina 8 y la histona H3 acetilada la lisina 14 se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. células LNCaP se trataron con concentraciones crecientes de NU9056 o el compuesto de control durante 2 horas, después se trató con el inhibidor de HDAC TSA (2 M) durante otras 4 horas. (C) Los niveles de histona H4 acetilado lisina-16, la histona H4 acetilado lisina-8 y la histona H3 acetilada lisina 14 se evaluaron por Western Blot. (D) células LNCaP se trataron con 24 mM NU9056 más de 4 días y los niveles de tubulina acetilada se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. células LNCaP (E) se trataron con concentraciones crecientes de NU9056 o el compuesto de control durante 2 horas, después se trató con el inhibidor de HDAC TSA (2 M) durante otras 4 horas. Los niveles de tubulina acetilada se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. Alfa-tubulina se utilizó como control de carga. borrones representativos se muestran para los experimentos duplicados.
Para definir aún más la actividad inhibitoria de HAT NU9056, la acetilación de la no histonas proteínas α-tubulina también se investigó. Cuando se incubaron células LNCaP con NU9056 (24 M) durante 24 horas se observó una disminución en la tubulina acetilada. Sin embargo, a las 72 horas acetilación había regresado a los niveles basales (Figura 3D). Para confirmar que este efecto era debido a NU9056, tubulina acetilada se controló pero no se observó cambio en los niveles dentro de las 6 horas a diferencia de las alteraciones de las modificaciones de histonas (Figura 3E). Densitometría para todas las transferencias de Western se muestra en la Figura Adicional S2.
NU9056 Inhibe el crecimiento de células
Hemos observado que desmontables de Tip60 en las células LNCaP dio lugar a una inhibición de la proliferación celular en aproximadamente un 33% (p -valor = 0,0019) (Figura 4A). desmontables eficiente de Tip60 ARNm en estas células fue confirmada por PCR en tiempo real (Figura 4B, el 70% desmontables; p-valor = 0,0313) y Western Blot (Figura 4C). Si la acción NU9056 fue mediada a través de la inhibición de la actividad enzimática Tip60, se esperaría que la inhibición de la proliferación celular por NU9056. De hecho, se encontró que la proliferación de reducirse en presencia de NU9056 en todas las líneas celulares ensayadas CaP medido por sulforrodamina B de ensayo (SRB) (Tabla 2, Figura complementario S3, S4). Es interesante que las células LNCaP, que son andrógeno sensible y expresan un AR mutado, pero funcional, así como p53 de tipo salvaje, y las células PC3 metástasis ósea procedentes, que no expresan un AR funcional y son p53 nula, muestran GI similares
50 concentraciones (24 M ± 2 y 27 ± 2 M para las células LNCaP y PC3, respectivamente). Sin embargo, las células LNCaP-AI, una sub-línea de células LNCaP en serie mantenido en los medios de esteroides agotado, que todavía expresan un AR funcional y son un modelo de terapia post ablación de andrógenos tapa a prueba de castración, tienen un IG más bajo
50 ( 24 M ± 2 y 16 mM ± 1 para LNCaP y LNCaP-AI, respectivamente). Otros modelos de la línea celular de la independencia de andrógenos, por ejemplo, LNCaP-CdxR, que se mantiene en serie en la presencia de bicalutamida y CWR22rv1, muestran significativamente mayor sensibilidad a NU9056 de la línea celular LNCaP parental (GI
50 valores de 12 M ± 2,5 y 7,5 M ± 0,2 (p & lt; 0,05 y p & lt; 0,0005, respectivamente)). TIP60 niveles se midieron mediante Western Blot en estas líneas celulares (Figura 4D) para revelar que la línea celular más sensible, CWR22rv1, en realidad expresa el más Tip60.
(A) Para confirmar que la inhibición de Tip60 puede reducir celular proliferación 2,5 nM siRNA dirigidos específicamente contra Tip60 en las células LNCaP o se utilizó un control no silenciar. La proliferación se determinó mediante ensayos de proliferación de control a los 3 tiempos de duplicación después de siRNA transfección en medio de cultivo normal sulfordamina B (SRB). Para confirmar Tip60 caída, el ARN se recogió a las 96 horas a partir de un experimento paralelo y se evaluó para la expresión Tip60 usando (B) PCR en tiempo real y (C) inmunotransferencia de tipo Western. los niveles de (D) TIP60 en líneas celulares de cáncer de próstata se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. (E) la supervivencia de células de cáncer de próstata se evaluó mediante el tratamiento de las células LNCaP con 24 NU9056 mu M durante 24 horas después del chapado a diferentes densidades de células (3 × 10
3, 1,6 × 10
4 y 3 × 10
4 ) y permitiendo colonias para formar más de 2 semanas. Las colonias se fijaron con fijador de Carnoy y se tiñeron con cristal violeta. Las colonias se contaron entonces y la eficiencia de formación de colonias calculan. La media de 3 experimentos ± desviación estándar se muestra en los gráficos de barras. * P-valor. & Lt; 0,05
Para probar si NU9056 puede reducir la supervivencia de las células de CaP, la capacidad de formación de colonias se evaluó después de la exposición de las células LNCaP a 24 mM (GI
50) NU9056 durante 24 horas. la capacidad de formación de colonias se redujo después de la exposición NU9056, que fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). (Figura 4E)
Tratamiento NU9056 causa apoptosis mediante caspasa activación
Los efectos de NU9056 en fase del ciclo celular distribución y la inducción de apoptosis también se probaron en las células LNCaP. Para evaluar los efectos apoptóticos, se utilizó el análisis FACS para activar la caspasa 3 y caspasa 9 activada. NU9056 resultó en tanto la caspasa 3 y caspasa 9 de activación en un tiempo y manera dependiente de la concentración (Figura 5A, complementario de las figuras S5 y S6). Los niveles de apoptosis también se compararon con otros inhibidores de HAT que demuestran que NU9056, con su mayor especificidad para Tip60, puede inducir la apoptosis en niveles similares a los inhibidores más promiscuos (Figura S7). El análisis de la población sub-G1 en las células LNCaP (Figura 5B), se confirmó la inducción de apoptosis de una manera tiempo y dependiente de la concentración para NU9056. Sin embargo, en condiciones de ausencia de exposición a NU9056 nos observamos ninguna detención del ciclo celular G1 o G2M en las células LNCaP; solamente la acumulación en la fase sub-G1 se observó (Figura 5C, D). Para determinar si las líneas celulares resistentes de castración son más sensibles a NU9056 como se sugiere por GI
50 determinación de una comparación de las células LNCaP con células LNCaP-CdxR LNCaP-AI y después del tratamiento con NU9056 durante 24 horas se llevó a cabo. De hecho, las células LNCaP y LNCaP-AI-CdxR parecen ser más sensibles a NU9056 que las células LNCaP tal como se muestra por una población mayor de estar en la fase sub-G1 del ciclo celular (Figura 5E). Al usar la LNCaP GI
75 dosis (36 mM) un aumento significativo en Sub-G1 se observó en las células LNCaP-AI (p = 0,036) en comparación con las células LNCaP. Se observaron tendencias similares para LNCaP-CdxR aunque esto no fue estadísticamente significativa (p = 0,1679)
.
células LNCaP (A) se sembraron en placas de 6 pocillos durante 24 horas, luego se aplicaron dosis crecientes de NU9056 para ( i) 24 horas, (ii) 96 horas o (iii) GI
25 (17 M) o (iv) GI
50 (24 mM), se aplicó durante 4 días. Se recogieron todas las células y se fijaron con Cytofix /Cytoperm (BD), entonces la caspasa Se han usado 3 y caspasa 9 kits de ensayo (BD) para evaluar su actividad por citometría de flujo. La fluorescencia se detecta en el canal de FL-1 de la FACSCAN. Análisis (B) de la población subG1 se realizó en estas mismas células por medio de yoduro de propidio para teñir el ADN celular. células LNCaP fueron sembradas en placas de 6 pocillos durante 24 horas, a continuación, NU9056 se aplicó para (C) 1 o (D) 4 días. (E) LNCaP, LNCaP-AI y las células LNCaP-CdxR se sembraron a cabo en placas de 6 pocillos y NU9056 se aplicó durante 24 horas. Se realizó un análisis de subG1 como se describe anteriormente. Se recogieron todas las células y se fijaron con Cytofix /Cytoperm (BD) a continuación, el análisis del ciclo celular se realizó usando yoduro de propidio para teñir el ADN celular. Todos los datos se analizaron mediante FACS WinMDI. Todos los experimentos se llevaron a cabo 3 veces y se muestra la media ± error estándar. * Valor de p & lt; 0,05; ** Valor p & lt; 0,005; *** P-valor. & Lt; 0,001
Tratamiento NU9056 reduce la expresión de PSA en células LNCaP
Tip60 ha sido reportado como un AR co-activador [31], que desempeña un papel en el desarrollo del CaP. Para confirmar el papel de Tip60 en la expresión de PSA, siRNA se utilizó para desmontables niveles TIP60 en las células LNCaP y los niveles de PSA de ARNm monitorizadas en respuesta a andrógenos (dihidrotestosterona (DHT)) estimulación. En presencia de un no silenciar siRNA PSA fue inducida por aproximadamente 10 veces en respuesta a DHT (Figura 6A). Sin embargo, después desmontables de Tip60 (Figura 6B) sólo un incremento de 2,5 veces se observó (Figura 6A). Para investigar los efectos de NU9056 en función de AR, las células LNCaP se trataron con 24 NU9056 mu M durante un período de 48 horas, después de lo cual los niveles de proteína de AR y PSA se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western. Además, se investigaron los niveles de p53 y p21 su gen diana, como p53 es también un objetivo para Tip60. Hemos descubierto que los niveles tanto de AR y p53 se redujeron después de 24 horas por 2 y 3 veces, respectivamente, y que los productos de los genes diana, p21 y PSA, también se redujeron en 3 y 2 veces, respectivamente (Figura 6C, D). Este resultado sugiere que, efectivamente, Tip60 participa en la señalización AR y p53 en esta línea celular y que puede NU9056, modulando la actividad de acetilación Tip60 afectan a estas abajo objetivos importantes.
Para confirmar los efectos de Tip60 sobre la actividad del receptor de andrógenos se utilizó 2,5 nM siRNA dirigidos específicamente contra Tip60 en las células LNCaP, o el control no silenciar. Desmontables se logró después de 48 horas en medio de esteroides agotado después de lo cual se aplicó 10 nM DHT para inducir la actividad del receptor de andrógenos y expresión de PSA. ARN se recogió después de 24 horas de estimulación DHT, la transcripción y la PCR en tiempo real realizado inversa. La expresión de PSA (A) y (B) Tip60 se normalizó con respecto a HPRT1 expresión. las células LNCaP (C) se trataron con 24 mM NU9056 más de 48 horas y las muestras de proteína se recogieron en tampón de muestra SDS. El análisis de proteínas se llevó a cabo por SDS-PAGE y Western blot para p53, p21, AR, PSA y alfa tubulina. (D) La densitometría se realizó en transferencias de Western. Todos los experimentos se realizaron dos veces y se muestra la media ± desviación estándar.
NU9056 Inhibe la respuesta al daño del ADN en las células del cáncer de próstata
Tip60 se conoce por desempeñar un papel en el daño del ADN la respuesta [25]. A se activa la exposición a IR Tip60, lo que resulta en la acetilación de las proteínas histonas y la activación de ATM y p53 [4]. Para probar si NU9056 podría inhibir la respuesta al daño del ADN mediante la inhibición de la actividad de acetilasa Tip60, la activación de ATM se evaluó mediante transferencia Western en respuesta a IR después del pre-tratamiento con NU9056. En respuesta a IR, los niveles de patm se incrementaron dramáticamente dentro de 10 minutos. Con el tiempo los niveles patm cayeron gradualmente. Sin embargo, en presencia de NU9056 esta disminución fue mucho más rápido (Figura 7A). Además, en respuesta a los niveles de IR de proteína Tip60 fueron estabilizado resulta en la acumulación. Las células que fueron tratadas previamente con NU9056 no demostraron Tip60 acumulación (Figura 7B), lo que puede explicar una mayor rotación de los niveles de patm.
Para demostrar la inhibición de la actividad Tip60 por NU9056, los niveles de patm, Tip60 y γH2AX fueron investigados en respuesta a IR en presencia y ausencia de fármaco. células LNCaP se trataron con 24 mM NU9056 o vehículo de control durante 1 hora antes de 0,5 Gy IR. Proteína lisados se recogieron en varios puntos de tiempo post-IR y se analizaron por Western blot para (A) y patm niveles (B) TIP60. (C) 293T, (D) LNCaP y (E) las células LNCaP-CdxR se pretrataron con NU9056 (24 M) o vehículo de control durante 1 hora antes de 2 Gy IR. Las células se fijaron y se tiñeron para γH2AX focos con el tiempo y focos determinada por inmunofluorescencia para las células 293T y citometría de flujo para LNCaP y LNCaP-CdxR. Los experimentos se repitieron 3 veces con imágenes representativas mostrados y datos cuantitativos se muestran como medias células teñidas para γH2AX% ± desviación estándar.
Tip60 acetylase actividad es necesaria para facilitar la ubiquitina ligasa ubiquitinación UBC13 mediada y posterior destrucción de γH2AX [32]. Por lo tanto, la inhibición de la actividad acetylase Tip60 evitará que la baja regulación de la señal γH2AX. Para probar esto, 293T células se trataron con NU9056 (24 M) o vehículo de control para la exposición de 1 hora antes de la IR (2 Gy). Las células fueron fijadas y γH2AX focos visualizaron por inmunofluorescencia. En comparación con el control del vehículo, la formación γH2AX todavía estaba claramente enriquecido tanto como 24 horas después de la estimulación IR (Figura 7C) lo que sugiere que la reparación del daño del ADN se ve afectada. Esto también se ve en las células LNCaP y LNCaP-CdxR que se evaluaron por citometría de flujo para γH2AX. En las células LNCaP, el número de focos fueron significativamente más altos después de la recuperación de 24 horas en presencia de inhibidor (p = 0,0277) (Figura 7D), mientras que en las células LNCaP-CdxR se observa una diferencia significativa después de la recuperación horas 4 (p = 0,0324) ( Figura 7E). Un aumento en γH2AX también se ve en la recuperación de 24 horas, pero no se ha encontrado para ser estadísticamente significativa.
Discusión
acetilación de proteínas, como un mecanismo de regulación, está demostrando ser importante en muchas vías celulares , no sólo la transcripción de genes a través de la modificación de histonas. Ambos conjuntos de las enzimas responsables de la regulación de acetilación, los sombreros y las HDAC, se des-regulados en estados de enfermedad. Por lo tanto, la orientación de ambos tipos de enzimas con inhibidores de molécula pequeña como una estrategia terapéutica es válido. Se han encontrado inhibidores de las HDAC en contra de tener éxito en los ensayos clínicos; Sin embargo, los inhibidores de HAT están en una fase temprana de desarrollo. Recientemente, ha habido algunos inhibidores putativos HAT descritos, aunque ninguno parece capaz de distinguir significativamente entre los diferentes miembros de la familia HAT y ninguno ha sido desarrollado específicamente contra Tip60, una enzima HAT que parece jugar un papel particular en el desarrollo y la progresión del CaP. Para hacer frente a este punto, hemos identificado un inhibidor de HAT, utilizando HTS y síntesis de compuestos dirigidos, que inhibe Tip60 sobre otras enzimas sombrero.
El requisito para validar plenamente HTS realiza a través de resíntesis es ampliamente aceptado como material de colecciones de compuestos comerciales puede incluir impurezas no identificadas, o puede degradar en el almacenamiento, típicamente como soluciones de DMSO congelados, dando falsos positivos. En este caso, una síntesis literatura para 1 no estaba disponible y una ruta tuvo que ser desarrollado. El primer esquema intentó (Parte 1) no dio los compuestos diana, 1, o su análogo desmetil; sin embargo, se prepararon los isocianato y disulfuro de análogos de 4-7. El compuesto 1 se preparó con éxito a través de una ruta alternativa (Parte 2)
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La actividad biológica observada para los disulfuros 5 y 7 (NU9056), nos llevó a investigar la actividad de otros disulfuros aromáticos y heteroaromáticos simples. Curiosamente, estos compuestos fueron desprovistos de la actividad inhibidora Tip60, lo que indica que la inhibición Tip60 no se debe únicamente a la presencia del grupo disulfuro. Del mismo modo, el análogo bromotiofeno de isotiazol 1 fue inactivo.
Las isotiazolonas se ha informado anteriormente para orientar la actividad de muchas enzimas acetylase HAT incluyendo p300 y PCAF [24]. Sin embargo, un inhibidor específico para Tip60 no se ha descrito. Hay muchos beneficios que pueden obtenerse dirigiéndose a esta proteína, debido a los diversos procesos celulares en los que está implicada Tip60. Por ejemplo, no sólo esta función de la proteína para aumentar la actividad transcripcional de AR y p53, pero también puede desempeñar un papel en la reparación del ADN en los que puede acetilar proteínas histonas para marcar los sitios de daño de ADN y activar ATM [25].
en este informe, hemos preparado un compuesto de isotiazolona, NU9056 (7) que se dirige la actividad HAT Tip60 resultante selectivamente en la acetilación de las histonas reducida de proteínas
in vitro
. Tip60 se ha encontrado que se expresa de forma aberrante en un número de cánceres, incluyendo los cánceres de próstata y de la piel. Específicamente, Tip60 puede acetilar la AR, un factor de transcripción clave en CaP, para promover el aumento de la actividad transcripcional de AR [6] y la expresión Tip60 También se ha demostrado que se correlaciona con la progresión de la enfermedad [14]. Por lo tanto, la orientación de la actividad acetylase de esta proteína podría ser beneficioso para los pacientes que sufren con tapa a prueba de castración que ya no responde a la terapia de privación de andrógenos. Por lo tanto, para poner a prueba la capacidad de los NU9056 para inhibir la actividad HAT en las células que hemos utilizado modelos de líneas celulares de CaP. En estas líneas celulares se ha demostrado el efecto inhibidor de NU9056 contra la actividad HAT de Tip60. Además, se encontró la acetilación de las proteínas no histonas tales como tubulina que reducirse en estas líneas celulares en respuesta a NU9056. Curiosamente, los niveles de AR y p53 disminuyeron ligeramente después del tratamiento NU9056 en las células LNCaP de soporte informes anteriores que la acetilación mejora la estabilidad de estas proteínas [33], [34]. Debido a la importancia de la AR y p53 y su presencia en las células LNCaP, esto puede explicar por qué tanto la apoptosis se incrementa y se disminuye la proliferación en respuesta a NU9056 de una manera dependiente de la concentración y el tiempo. Sin embargo, existen diferencias en la sensibilidad entre diferentes líneas celulares de CaP que no pueden explicarse únicamente por el estado de AR o p53. Esta última observación sugiere que la actividad de Tip60 hacia AR y p53 no es un factor que contribuye a la respuesta celular a la droga. Sin embargo, en respuesta a DNA IR dañar, que activa la actividad de acetilasa Tip60, encontramos que NU9056 inhibe el desarrollo de la señal de patm e impide la estabilización de sí mismo Tip60, potencialmente a través de la inhibición de la auto-acetilación. Además, NU9056 perjudica la supervivencia celular en respuesta a IR y deteriora la eliminación de la marca γH2AX potencialmente obstaculizar la reparación del ADN.
Curiosamente, los modelos de línea celular de resistencia a la castración parecen ser más sensibles a NU9056. los niveles y la estabilidad de Tip60 aumentado en las células andrógeno-insensible, debido al crecimiento crónica en condiciones de andrógenos ablación, se ha informado en otros modelos similares de líneas celulares [35], xenoinjertos de CaP humanos y las muestras de biopsia de pacientes resistentes castración [14]. Es posible que las células andrógeno-insensible son más dependientes de los niveles de TIP60 para su crecimiento, en comparación con sus contrapartes sensibles a los andrógenos, lo que resulta en una mayor sensibilidad a NU9056. De hecho, los estudios iniciales muestran que los niveles de proteína Tip60 varían entre las líneas celulares analizadas, con los más NU9056 líneas celulares sensibles, CWR22rv1 y LNCaP-CdxR que demuestran los niveles más altos de Tip60. Las diferencias en la actividad enzimática de Tip60 entre las líneas celulares también pueden ser importantes. Esta hipótesis debe ser completamente probado en estudios futuros en una serie de líneas celulares y
in vivo
sistemas modelo para determinar de manera concluyente el mecanismo de la sensibilidad. En cuanto a si NU9056 es generalmente tóxico para las células; creemos que esto es poco probable en su mayor parte. En primer lugar, no hubo ningún cambio en la tinción γH2AX cuando NU9056 se aplicó a las células sugiere que no hay inducción de daño del ADN. En segundo lugar se observaron efectos diferenciales en función de la línea celular sugiriendo general toxicidad no fue la causa de los efectos celulares nocivos.