PLOS ONE: Caracterización del ARN pequeño Transcriptomes de andrógenos línea celular de cáncer de próstata dependientes e independientes por Deep Sequencing

Extracto

En vista de las importantes funciones de los genes miARN en la regulación post-transcripcional y sus implicaciones para el cáncer, la caracterización de miARN facilita nosotros para descubrir los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del cáncer de próstata independiente de andrógenos (PCA). La aparición de las tecnologías de secuenciación de nueva generación ha cambiado drásticamente la velocidad de todos los aspectos de la secuenciación de una manera rápida y rentable, lo que puede permitir una investigación imparcial, cuantitativa y en profundidad de los pequeños ARN transcriptoma. En este estudio, hemos utilizado de alto rendimiento de secuenciación de Illumina para representar exhaustivamente la dotación completa de ARN pequeño individual y para caracterizar los perfiles de expresión de los genes miARN, tanto en la línea celular Pca dependientes e independientes de andrógenos. Al menos 83 miRNAs son significativamente expresados ​​diferencialmente, de los cuales 41 están regulados hacia arriba y 42 están reguladas por, indicando estos miRNAs pueden estar involucrados en la transición de LNCaP a un fenotipo independiente de andrógenos. Además, se han identificado 43 nuevos miRNAs de la biblioteca CaP dependientes e independientes de andrógenos y 3 de ellos son específicos del CaP independiente de los andrógenos. Función de anotación de los genes diana indicó que la mayoría de estos miRNAs expresados ​​diferencialmente tienden a apuntar a genes implicados en la transducción de la señal y la comunicación celular, epically la vía de señalización MAPK. Las pequeñas transcriptomes de ARN obtenidos en este estudio proporciona una visión considerables en una mejor comprensión de la expresión y función de los pequeños RNAs en el desarrollo de cáncer de próstata independiente de andrógenos

Visto:. Xu G, Wu J, Zhou L, Chen B, Sun Z, Zhao F, et al. (2010) Caracterización del ARN pequeño Transcriptomes de andrógenos línea celular dependiente e independiente del cáncer de próstata mediante secuenciación profunda. PLoS ONE 5 (11): e15519. doi: 10.1371 /journal.pone.0015519

Editor: Patrick Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: August 1, 2010; Aceptado: 6 Octubre 2010; Publicado: noviembre 30, 2010

Derechos de Autor © 2010 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Provincial de Zhejiang Ciencias Naturales de China (Nº Y2100902), Wenzhou Ciencia y Tecnología de Proyectos (Y20100011), Zhejiang Provincial de Ciencia y Tecnología Plataforma de Análisis y Proyectos de tecnología de pruebas (2009F82G2090045) y el Programa de Investigación de alta Tecnología y Desarrollo Nacional de China (2006AA02A304). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia maligna más común del tracto genitourinario masculino y la tercera causa de muerte por cáncer [1], [2]. Dado que el crecimiento del CP depende inicialmente de los andrógenos para la supervivencia, la terapia de privación de andrógenos (ADT) ha sido el pilar del tratamiento para el CaP. Sin embargo, estos tumores con el tiempo progresar a un fenotipo independiente de andrógenos y dejar de responder al tratamiento ADT, convirtiéndose en el mayor obstáculo de la terapia clínica. La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del CaP independiente de los andrógenos arrojará luces considerables sobre las posibles estrategias de tratamiento para el CaP. miRNAs (microRNAs) son pequeños ARN, no codificante (~20-22 nucleótidos) que regulan negativamente la expresión génica a nivel [3] post-transcripcional. La acumulación de evidencias indican que los miRNAs pueden actuar como supresores de tumores y oncogenes [4], [5]. Teniendo en cuenta las importantes funciones de miRNAs en la regulación post-transcripcional, la identificación de estos miRNAs expresados ​​diferencialmente y novedosos nos facilitará descubrir los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del cáncer de próstata independiente de andrógenos.

Para caracterizar el transcriptoma pequeños ARN , las tecnologías de la nueva 'profunda de secuenciación', tales como Roche 454 y Illumina Solexa, se han empleado los cuales tienen ventajas significativas sobre las metodologías basadas en la hibridación anteriores, tales como microarrays y ensayos basados ​​en PCR [6], [7]. En primer lugar, proporciona una visión más integrada del transcriptoma miRNAs. la secuenciación de alto rendimiento tiene la capacidad de identificar miRNAs abundantes modestos o incluso bajos que presentan diferencias de expresión entre las muestras distintas, en una medida que anteriormente no se pudo detectar con eficacia. En segundo lugar, la secuenciación directa también ofrece la posibilidad de detectar la variación de la longitud de miARN maduro y las posibles modificaciones enzimáticas. En tercer lugar, la secuenciación de alto rendimiento permite el descubrimiento exitoso de nuevos miRNAs, que no necesitan depender de consulta de regiones candidatas del genoma, sino más bien se puede lograr mediante la observación directa y la validación del potencial de plegamiento de la secuencia flanqueante genómico. En su conjunto, las tecnologías de secuenciación de próxima generación ofrecen un sistema muy robusto, preciso y escalable que establece un nuevo estándar para la investigación rápida, productiva y rentable de miARN transcriptoma.

Hasta ahora, hay seis todo el genoma miARN estudios de expresión en el cáncer de próstata como revisados ​​por Gandellini et al. [8]. El primero de perfiles de expresión de los genes miARN de cáncer de próstata se realizó por Lu et al [5], en el que se utilizó una técnica de citometría de flujo basado en perlas para evaluar el perfil de miARN en diferentes tipos de tumores. Los cinco estudios restantes aplican microarrays o método de hibridación basado en perlas para investigar miARN expresión firmas en el cáncer de próstata en comparación con el tejido normal, e identificaron una serie de miRNAs expresadas aberrantes en las células tumorales. Sin embargo, estos estudios sólo se centró en la comparación de los perfiles de expresión de genes miARN entre las muestras de CaP y tejidos no tumorales circundantes, mientras no revelar qué tipo de miARN podría estar correlacionada con la transición de andrógeno-sensibles a independiente de los andrógenos en el cáncer de próstata. Más recientemente, Sun et al. encontraron que varios miRNAs, en particular, miR-221 y miR-222, fueron significativamente sobre-expresado en células de cáncer de próstata independientes de andrógenos en comparación con los de la línea celular dependiente de andrógenos, e implicaban la participación de ambos miRNAs en el desarrollo y progresión de la independencia androgénica de cáncer de próstata [9]. deVere White et al. (2009) identificaron un pequeño conjunto de miRNAs se expresaron de manera aberrante en líneas celulares de CaP andrógeno-independientes que utilizan la tecnología de microarrays [10]. Una comparación detallada de los perfiles de expresión de genes miARN entre los cánceres dependientes de andrógenos y independientes de andrógenos puede descubrir cómo la vía miRNA está implicado en la progresión del cáncer de próstata a la independencia de andrógenos. Utilizando la secuenciación de próxima generación, hemos obtenido firmas de expresión de los genes miARN en el cáncer de próstata independiente de andrógenos e identificado 83 miRNAs expresados ​​diferencialmente en las líneas celulares LNCaP-AI, así como posibles dianas para estos miRNAs. Para nuestro conocimiento, este estudio representa el primer ejemplo de pequeños ARN de transcriptoma por secuenciación de alto rendimiento en el cáncer de próstata y se ha demostrado que la secuenciación de profundidad puede servir como una plataforma ideal, rápido y rentable para la caracterización de pequeños perfiles de expresión de ARN.

Materiales y Métodos

Cell Cultura y
La línea celular LNCaP andrógeno-dependientes se obtuvo de la American Type Culture Collection (Rockville, MD) y se mantuvo rutinariamente en un medio normal: rojo de fenol-positivo F-12 (Gibco) con 10% de FBS (BioWest) a 37 ° C en 5% de CO
2. Las células fueron alimentados dos veces por semana y se separaron una vez por semana con tripsinización (definida como un paso). Para establecer una línea celular independiente de los andrógenos, LNCaP se mantuvo primero en fenol DMEM libre de rojo /F-12 (Gibco) con FBS tratado con dextrano 10% de carbón /(BioWest). Después se cultivaron durante 5 semanas, las células se transfirieron al medio anterior con 1,0 × 10
-7 mol /L flutamida (Schering Plough) y se cultivaron durante otros 105 pasajes.

Ensayo de proliferación celular

Las células se sembraron a una densidad de 3 x 10
3 células /pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos en 90 l de medios de comunicación regular. Después de 24 horas de incubación a 37 ° C en 5% de CO
2, el medio de cultivo se cambió con medio de los pocillos reciben medio regular y un medio de recepción de andrógenos medio libre (fenol medio libre de rojo con 5,0 × 10
-6 mol /L flutamida). Las células se incubaron en 5% de CO
2 a 37 ° C durante 72 horas, 10 l de solución de CCK-8 (Dojindo) se añadió a cada pocillo, seguido de incubación durante 3 horas a 37 ° C, y la absorbancia finalmente fue determinada a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad).

Western Blot se llevó a cabo mediante los métodos descritos anteriormente [11]. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: conejo anti-Bcl-2 (1:200, Señalización Celular), de conejo anti-Bax (1:100, Señalización Celular) y el ratón anti-β-actina (1:1000, Señalización Celular)

ensayo de Ciclo celular

Las células se suspendieron en la hormona libre y medio regular, respectivamente, y después se plantaron en tres placas de 24 pocillos con un número de 3,3 × 10
5 células por bien. Después de la incubación en 5% de CO
2 a 37 ° C durante 24 horas, se añadió flutamida en los agujeros. Las células se recogieron después de incubar en 5% de CO
2 a 37 ° C durante 72 horas. El procedimiento de tratamiento previo de análisis del ciclo celular estaba siguiendo el manual de Prueba de ciclo
plusDNA kit de reactivos (Becton Dickinson). El análisis del ciclo celular se realizó utilizando un citómetro de flujo FACScan (BD Company)

Real-time RT-PCR

ARN pequeños (& lt; 200 nt). Se aislaron con
mirVana
™ Kit PARIS ™ (Ambion) según las instrucciones del fabricante. Para las reacciones de RT, 1 g de pequeños ARN se utilizó para la transcripción inversa con miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen), realizado en 37 ° C durante 60 min y una incubación final a 95 ° C durante 5 min. MiARN tiempo real de RT-PCR se llevó a cabo utilizando el kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen) en una máquina de PCR en tiempo real 7000 de Applied Biosystems (ABI). La reacción de PCR se realizó a 95 ° C durante 15 min, seguido de 40 ciclos de incubación a 94 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s, y 70 ° C durante 30 s. Cada PCR se repitió al menos tres veces. El nivel de expresión relativa de cada miARN se normalizó respecto a los niveles de ARNsn U6. Pliegue de cambio se calculó de acuerdo con el método 2
-ΔΔCt.

Pequeños ARN de construcción de biblioteca y de alto rendimiento de secuenciación

El ARN total aislado se fraccionó por tamaño en una tris 15% (TBE) urea gel de poliacrilamida-EDTA borato para enriquecer para las moléculas de 15-30 nt. El pequeño ARN se ligó con 3 '(5'-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT-3') y 5 '(5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3') adaptadores utilizando ARN ligasa de T4 y fue de nuevo el tamaño fraccionado en un gel de poliacrilamida TBE urea 15%. El ARN resultante se transcribe inversamente en ADNc con de Solexa pequeños ARN de RT-Primer (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 '). El cDNA se utilizó como molde para la amplificación por PCR usando conjunto de cebadores de ARN pequeño de Solexa (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 '; 5' AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3 '). Por último, aproximadamente 20 g de pequeños ARN se utilizaron para la secuenciación utilizando Illumina 1 G Genoma Analizador de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Leer filtro y de RNA de anotación

En lo profundo-lecturas de secuenciación producidas por Illumina genoma Analizador, baja calidad lecturas fueron filtrados para excluir a aquellos que más probablemente para representar la secuencia de errores y 3/5 'secuencias adaptadoras se cortaron posteriormente en longitud completa limpia lee formateada en un formato Fasta no redundante. Las ocurrencias de cada secuencia única lee fueron contados como etiquetas de secuencias (el número de lecturas para cada etiqueta refleja el nivel relativo de expresión) y sólo pequeñas secuencias de ARN de 18 a 30 nt se conservaron para su posterior análisis.

Todo secuencia única etiquetas que pasan por encima de los filtros fueron asignadas en el genoma humano de referencia utilizando el programa de SOAP 2.0 con un máximo de dos desajustes [12]. Posteriormente, las etiquetas de secuencias únicas fueron alineados contra miRBase14.0, computacionalmente predijo ncRNAs humana y Rfam 9.1 (http://rfam.sanger.ac.uk/), la anotación de RepeatMasker RepBase 14.09 (http: //www.girinst. org /), los genes humanos UCSC hg18 anotación (http://genome.ucsc.edu/) para clasificar conocido miARN, fragmentos de degradación de ARN, repeticiones genómicas y el ARNm no codificante, respectivamente. Secuencias que no se solapan con ninguna de estas anotaciones, pero podría ser alineados al genoma de referencia se denominan "sin clasificar".

Expresión diferencial Detección y Novel miARN predicción

Para comparar los miRNAs expresados ​​diferencialmente entre LNCaP y LNCaP-AI, leer el recuento de cada miRNAs identificados se normalizó al número total de miARN lee. La significación estadística (p-valor) se infiere basado en el método bayesiano, que fue desarrollado para el análisis de perfiles de expresión génica digitales y podría dar cuenta de la variabilidad de la muestra de etiquetas con recuentos bajos [13]. Un miARN específica se considere que se expresa de forma diferente significativamente si el
P
valor determinado por este método fue ≤0.001 y había por lo menos un cambio de 2 veces en la secuencia normalizada cuenta. Los genes diana para cada miARN expresados ​​diferencialmente se prevé utilizar TargetScan (http://www.targetscan.org/), Miranda (http://www.microrna.org/), PicTar (http: //pictar.mdc-berlin .de /) y RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/). Teniendo en cuenta que la predicción de genes miARN objetivos a menudo sufren de alto nivel de falsos positivos, sólo el gen diana apoyo de al menos tres herramientas independientes se tuvieron en cuenta. La ontología de genes (GO) y KEGG vías de determinados genes fueron anotados utilizando la herramienta de anotación de genes DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/UTH).

Las secuencias no anotadas y que podrían ser mapeados con el genoma humano se consideraron para detectar nuevos genes miARN candidato. En breve, se extrajeron 100 nucleótidos de la secuencia genómica que flanquean cada lado de estas secuencias y las estructuras secundarias de ARN se prevé utilizar RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). Candidato novela miARN se identificó utilizando MIREAP en la configuración por defecto, que ha sido ampliamente adoptados en los estudios relacionados [14], [15]

Todos los datos de secuenciación junto con los resultados de anotación puede estar disponible en http:. //59.79. 168,90 /PCA.

resultados

Establecimiento de una independiente de andrógenos-Line LNCaP Cell

sobre la base de los informes de que las células LNCaP de andrógenos sensibles (Fig. 1A) se puede convertir en células independientes de andrógenos [16], [17], que intentaron generar una línea celular independiente de los andrógenos mediante el cultivo continuo de células LNCaP
in vitro
. Después del inicio del cultivo de tres semanas en medio de la hormona-privada, la proliferación de las células disminuirá gradualmente su velocidad y un número considerable de células (aproximadamente 40-50%) se sometieron a la apoptosis (Fig. 1B). El resto de las modificaciones en la morfología de mostrar un fenotipo neuroendocrino similar (fig. 1B). Con el aumento de número de pases, las células aparecieron con variaciones morfológicas obvias y se convierten en pequeñas y planas, el desarrollo de la capacidad de crecer de una manera independiente de los andrógenos (un fenotipo que hemos designado como LNCaP-AI) (Fig. 1C). Para estimar los efectos del medio ambiente libre de andrógenos en células LNCaP-AI crecimiento celular, examinamos continuamente la tasa de proliferación de las células de la línea celular en diferentes pasajes. Se muestra que la tasa de crecimiento celular de células LNCaP-AI se muestra una tendencia a la baja gradual del paso 1, 2, 5, 10 a 20, sin embargo, como el número de pases aumentó, la tasa de proliferación de las células se incrementó gradualmente y casi alcanzó a 100% ( Fig. 1D). Después de 110 pasajes durante 2 años de cultivo, el crecimiento celular se estabiliza y puede crecer bien en el entorno de andrógenos empobrecido.

(A) La morfología de las células LNCaP parentales, que se cultivaron en medio normal durante 3 días. (B) fenotipo neuroendocrino de células LNCaP. células LNCaP se mantuvieron en medio de andrógenos empobrecido y se cultivaron durante 3 pasajes. (C) Morfología de las células LNCaP-AI. células LNCaP fueron cultivadas con flutamida en un medio de andrógeno-agotado para 110 pasajes. (D) Las tasas de crecimiento celular de células LNCaP cultivadas andrógenos empobrecido en diferentes pasajes cuando se crece en medio de privación de andrógenos. (E-F) Los efectos del ambiente de andrógenos agotado y flutamida en LNCaP-AI (E) y el ciclo de FGC LNCaP (F) de la célula. (AI: medio vaciado-andrógenos; Gripe: 1.0 × 10
-7 mol /l de flutamida; norma: medio regular). Las células Bcl-2 y Bax expresión en LNCaP y LNCaP-AI (G).

A fin de probar que las células LNCaP-AI han adquirido la capacidad de adaptarse al medio libre de hormonas, más estudios son necesarios para la visión de los efectos de la flutamida o ambiente libre de andrógenos en el ciclo celular de las células LNCaP por citometría de flujo, y se incluyeron las células LNCaP dependientes de andrógenos como control. Como era de esperar, flutamida o ambiente libre de andrógenos no tuvieron ningún efecto significativo sobre la distribución del ciclo celular en las células LNCaP-AI (Fig. 1E). Por el contrario, este tratamiento en las células LNCaP se indujo una acumulación de células en la fase G0 /G1 y acompañado con una disminución de la fase S, y el efecto de inhibición era mucho más fuerte cuando los dos se combinaron (Fig. 1F). estudio previo ha puesto de manifiesto que Bcl-2 se sobreexpresa en la progresión a cáncer de próstata refractario a los andrógenos [1]. Para caracterizar la expresión tanto de Bcl-2 y Bax (proteína X asociada a Bcl-2) las proteínas en las dos líneas celulares (LNCaP y LNCaP-AI), se llevó a cabo análisis de transferencia Western (Fig. 1G). Hemos encontrado un aumento de la expresión de la proteína Bcl-2 en células LNCaP-AI en comparación con las células LNCaP. Mientras tanto, las células LNCaP expresan un nivel similar de la proteína Bax. Estos resultados sugieren que las células LNCaP-ai ganaron una actividad anti-apoptótica mejorada. Sobre la base de las observaciones anteriores, hemos establecido con éxito una línea celular LNCaP andrógeno-independiente a través de la cultura a largo plazo de las células LNCaP.

Pequeños ARN Transcriptomes y anotación

Para investigar pequeñas transcriptomes ARN, Illumina la tecnología de secuenciación de alto rendimiento se empleó para ambas bibliotecas pequeñas de ARN-AI LNCaP y LNCaP. Inicialmente, un total de 9.107.833 y 10.083.251 secuencia de bajo nivel Lee fueron producidos por LNCaP y LNCaP-AI, respectivamente. Después de filtro y el recorte de las lecturas de baja calidad y el adaptador, 3.978.524 y 4.734.866 secuencia de lecturas se obtuvieron correspondiente a 302325 (LNCaP) y 416.924 (LNCaP-AI) etiquetas únicas. Observación de la distribución de la longitud de los pequeños RNAs, se encontró que la mayoría de ellos de las bibliotecas de ambos eran 22 nt en tamaño (Fig. 2A), que es coherente con el tamaño típico de miARN de productos de digestión Dicer. Mientras tanto, hubo un alto porcentaje de las etiquetas de secuencias idénticas (88.90%) entre LNCaP y LNCaP-AI. Estos resultados indican que los miRNAs se han enriquecido sucesivamente a partir de las dos bibliotecas.

(A) Distribución de la longitud de la secuencia lee. Ambas bibliotecas acumularon 22-nucleótidos ARN pequeños, lo cual es consistente con el tamaño típico de miRNAs. B) Las proporciones de las diversas clases de ARN pequeños detectados en LNCaP y LNCaP-AI. Se indica que la mayoría de los lee en ambas bibliotecas pertenecientes a las familias de genes miARN.

A continuación, el 18-30 nt se seleccionaron secuencias de ambas bibliotecas para mapear con el genoma humano, y un total de se detectaron 3,747,159 (94,18%) y 4,433,423 (93,63%) secuencias para que coincida con el genoma con un máximo de dos desajustes, respectivamente (Fig. 2B). Sobre la base de las anotaciones del genoma humano y un número de bases de datos de ARN bien caracterizados (ver Materiales y Métodos), estas pequeñas secuencias de ARN fueron anotados como conocido miARN, fragmentos de degradación de ARN no codificante (tRNA, rRNA, snRNA /snoRNA et al.) , repita genómico, ARNm o no clasificado. Como era de esperar, la categoría de ARN más abundante de ambas bibliotecas era conocido miRNAs: 65.22% para LNCaP y 62,33% para LNCaP-AI. El resto de categorías menos abundantes fueron no codificante del ARN y repeticiones genómicas. Además, una pequeña proporción de lee podría ser asignada a las secuencias de codificación, que es probable que sean productos de degradación de ARN. La evidencia acumulada indica que algunos genomas también pueden transcribir las transcripciones no codificantes funcionales cortos, como los pequeños ARN de interferencia o ARN interferentes endógenos asociados a repetir, que se ha caracterizado para regular la represión de retrotransposition [18]. Por ejemplo, se revela que L1 retrotransposition es suprimida por pequeños RNAs de interferencia endógenamente codificados en células cultivadas humanos. Por lo tanto, hay que destacar que estos pequeños RNAs pueden contener también importante función biológica que merece mayor atención.

expresados ​​diferencialmente miARN Entre LNCaP y LNCaP-AI

Sobre la base de miRBase, 360 miRNAs (285 miRNAs y 75 miRNAs *) y 380 miRNAs (282 miRNAs y 98 miRNAs *) se detectaron en LNCaP y LNCaP-AI, respectivamente (Tabla S1). En primer lugar, se encontró que los diferentes miRNAs mostraron significativamente diferentes niveles de expresión tal como se mide por la frecuencia de los recuentos de lectura, lo que indica una divergencia funcional notable de estos miRNAs. En LNCaP-AI, por ejemplo, aproximadamente 8,99% de miRNAs y miARN * s están en los recuentos de lectura es alto (& gt; 1000), entre las cuales la hsa-let-7 de la familia (HSA-let-7c, hsa-let-7F, hsa-let-7a, hsa-let-7d, hsa-let-7b y hsa-let-7e) es uno de los miRNAs más abundantes en nuestro conjunto de datos, lo que contribuye & gt; 8,94% del total de miARN lee. miARN contar dentro de los rangos de intermedia 100-1000 lee eran hasta el 17,4% y el miARN restante cuenta de aproximadamente el 73,7%.

El recuento relativo de secuenciación lee podría ser utilizado para cuantificar los niveles de expresión de los genes miARN entre LNCaP y LNCaP -AI. Con base en el número normalizado de lecturas por muestra (miARN specifc /etiquetas total de secuenciación en la biblioteca), la mayoría de los miRNAs (256) se expresaron en partes aproximadamente iguales entre las dos bibliotecas. Sin embargo, se identificaron 83 de ellos para ser expresadas diferencialmente con un pliegue cambios & gt; 2,0 y
P-valor
& lt; 0,001 (. Tabla 1, Figura 3A y en la Tabla S1). Entre ellos, 41 fueron reguladas y 42 se redujeron reguladas. A fin de validar estos miRNAs expresados ​​diferencialmente, se seleccionaron 29 miRNAs individuales para llevar a cabo el ensayo de RT-PCR cuantitativa a partir de réplicas biológicas independientes. Estos 29 miRNAs seleccionados cubiertos ambos miRNAs altamente expresadas (miR-222, miR-30a *, miR-100, miR-10b, miR-148b, MIR-1323, el miR-221, miR-7, miR-223, miR-374b , miR-486-5p, miR-7a *, miR-125 ter-2, miR-27a y miR-423-5) y miRNAs expresadas inferiores (miR-15b, miR-21, miR-17, miR-28-5p , miR-532-3p, miR-200c, miR-93, miR-96, miR-200b *, miR-331-3p, miR-200b, miR-106a, miR-301b y miR-301a). Como se muestra en la Fig. 3B, una fuerte correlación (correlación de Pearson = 0,91) fue revelado entre los datos de secuenciación profunda Illumina y las mediciones cuantitativas de RT-PCR, lo que indica la robustez de secuenciación profunda basada en el análisis de expresión.

(A) Nivel de expresión de LNCaP y LNCaP AI-miRNAs. El recuento de cada miARN se trazó después de la normalización. círculo de color rojo muestra diferencialmente expresado miRNAs entre LNCaP y LNCaP-AI con al menos un cambio de 2 veces y
p-valor
por debajo de 0,001. (B) Solexa vs. QRT-PCR de los genes miARN los factores de cambio.

Nuevos genes miARN

Una de las ventajas más importantes para la secuenciación de alto rendimiento de los pequeños ARN transcriptoma es que permite al descubrimiento de potenciales nuevos miRNAs. Para identificar candidatos nuevos miRNAs en LNCaP y LNCaP-AI, primero se han filtrado las etiquetas de secuencia de Illumina que han sido clasificados en categorías anotadas, como miRNAs conocidos, ARN no codificante, repeticiones genómicas o secuencias de codificación. Se encontró que 235.058 y 259.454 de las pequeñas etiquetas de secuencias de ARN en LNCaP y LNCaP-AI, respectivamente, se deriva de las regiones unannotated del genoma humano. Estas etiquetas no clasificados, junto con secuencias de acompañamiento de 100 pb fueron analizados por MIREAP, una sofisticada herramienta utilizada para identificar nuevos miRNAs a partir de datos de secuenciación de alto rendimiento [14], [15]. De esta manera, se identificaron 43 putativo novela miRNAs de las dos bibliotecas (Tabla 2 y la Tabla S2): 22 en LNCaP y 31 en LNCaP-AI (Tabla 2 y la Tabla S2), y sólo 10 de ellos son compartidos por ambas bibliotecas

también observado que estos 43 miRNAs tienen un intervalo de tamaño de 20 a 24 nt y la longitud de sus estructuras de horquilla predichas varían desde 65 hasta 98 ​​nt, que es similar a miRNAs humanos conocidos (Tabla S2) . Las energías libres mínimos de sus precursores van -18,20--67,40 kcal /mol con el valor medio de -52,70 kcal /mol. A fin de validar estos nuevos miRNAs, se realizó análisis en tiempo real RT-PCR en todos los 10 candidatos novela miARN con una frecuencia de la secuencia normalizada mayor que 10 (los otros fueron excluidos en vista de su bajo nivel de expresión y la sensibilidad de tiempo real análisis de RT-PCR). Como resultado, hemos validado con éxito ocho de ellos (Tabla 2), lo que indica que el 80% podría ser validada por un método de secuenciación independiente.

En comparación con otros miRNAs en nuestro estudio, estos nuevos miRNAs tienen una nivel de expresión mucho más bajo con una frecuencia de secuenciación normalizado promedio de 45, lo que indica que la mayoría de ellos no puede exhibir funciones importantes en el cáncer de próstata. Entre ellos, tres miRNAs específicos LNCaP-AI exhibieron secuencia relativa cuenta grande de 10 y validado por tiempo real de RT-PCR, que implican a su posible implicación en el desarrollo de LNCaP-AI, y por lo tanto merecen mayor evaluación funcional.

objetivos de predecir expresados ​​diferencialmente miRNAs

para explorar la función biológica de los miRNAs expresados ​​diferencialmente identificados en nuestro análisis, hemos realizado el análisis computacional usando cuatro algoritmos independientes, incluyendo TargetScan, Miranda, RNAhybrid y PicTar, para la identificación de predijeron dianas de ARN mensajero para cada miARN sean significativamente expresados ​​diferencialmente. Tabla S3 listas de objetivos predijo que fueron apoyadas por al menos tres de los cuatro algoritmos anteriores, en el que un total de 6902 genes fueron blancos potenciales de estos miRNAs. Curiosamente, entre estos objetivos previsto, Akt3 participó en 11 miRNAs expresados ​​significativamente baja. Akt3 codifica un miembro de /treonina de la familia de la proteína quinasa de serina, que se sabe están involucrados en una amplia variedad de procesos biológicos incluyendo la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y la tumorigénesis. La sobre-expresión de Akt3 en líneas celulares de cáncer de próstata andrógeno-independiente revela que puede contribuir al fenotipo más agresivo de los carcinomas de próstata andrógeno-independiente [19].

Para evaluar las funciones de genes diana, se anotaron estos predica miARN objetivos con la ontología de genes (GO) y esquemas de KEGG utilizando DAVID. miARN objetivos previstos pobladas muchas de las principales categorías GO, y para algunos de ellos, el número de objetivos de genes fue significativamente enriquecido (
P Hotel & lt; 0,001, con corrección de Benjamini). Las tres clasificaciones GO, función molecular, biología del proceso y los componentes celulares fueron evaluados por nivel, pero sólo en términos significativos en el nivel 5 del proceso biológico se enumeran en la Tabla S3. Como era de esperar, la mayor parte de los términos de GO importantes estaban relacionados con la regulación de la transcripción (por ejemplo GO: 0045449, GO: 0006351 y GO: 0006357). También hay una serie de categorías GO enriquecido significativamente, incluyendo la morfogénesis celular (GO: 0000902), el transporte intracelular (GO: 0046907), y la apoptosis (GO: 0006915). Para analizar el papel que juegan los miRNAs en las redes de regulación, asignamos miARN objetivos putativo en KEGG vías, y se identificaron 14 de ellos fueron enriquecidos significativamente (
P Hotel & lt; 0,001, con corrección de Benjamini). La mayoría de estos miRNAs tienden a apuntar a genes implicados en la transducción de la señal y la comunicación celular (Tabla S4). Por ejemplo, se encontró que 130 genes diana (2,3%) podrían ser asignados a la vía de señalización MAPK, que está implicado en una amplia gama de respuestas celulares, incluyendo la expresión génica, la diferenciación, la proliferación y la apoptosis [20]. En el cáncer de próstata, MAPK vías de señalización se consideran en general para promover el crecimiento del tumor y la aparición de la enfermedad refractaria a las hormonas [21], [22], [23].

Discusión

En este estudio , hemos identificado un gran conjunto de miRNAs que se expresan de forma diferente que subyace a la progresión del cáncer de próstata independiente de andrógenos, que también fueron verificados por QRT-PCR. Algunos de estos miRNAs están bien soportados por los estudios publicados recientemente. Un ejemplo notable viene de la expresión excesiva de miR-221 y miR-222 en la muestra LNCaP-AI por un aumento del pliegue 10-20, donde ambos se encuentran entre los miRNAs más abundantes en la línea celular LNCaP-AI. La sobreexpresión de miR-221 o miR-222 en LNCaP podría reducir significativamente el nivel de la dihidrotestosterona inducida sobre regulación de la expresión del antígeno específico de la próstata y aumentar el crecimiento independiente de andrógenos de las células LNCaP [9]. Varias líneas de evidencia sugieren que miR-221 y miR-222 podrían disminuye la p27 supresor de tumor en las células LNCaP, y su sobreexpresión podría ser uno de los factores que contribuyen a la progresión del carcinoma de próstata [24]. Por otra parte, el aumento de expresión de miR-125 ter, MIR-30c, miR-100 que hemos observado en las líneas celulares LNCaP-AI también se identificó a ser regulados hasta en cinco líneas celulares AI tapa [25], y
in vitro
experimento mostró que el miR-125b, podría estimular el crecimiento de AI y regular a la baja la expresión de BAK1 [25]. La reducción de miR-141, miR-19b, miR-22, miR-29a y miR-29b en que aquí también se observó entre los 15 miRNAs que se vieron reducidos en cuatro carcinomas de próstata hormono-refractario como se describe en Porkka et al. basada en el estudio de microarrays s [26].

también identificó un conjunto de miRNAs expresados ​​diferencialmente, que no ha sido documentado en la tumorigénesis de próstata o el desarrollo de AI. Por ejemplo, el miR-124, miR-148b, miR-320a y miR-423-5p fueron hasta reguladas por 2 a 14 veces, mientras que el miR-29a, miR-93, miR-200 y miR-1277 fueron abajo regulados por 2 a 10 veces, lo que sugiere que estos miRNAs podrían ejercer un papel como genes supresores de tumores u oncogenes en el desarrollo del cáncer de próstata. Es de interés señalar que los cinco miembros de la familia de miRNA-200 (miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 y miR-429) fueron significativamente las reguladas en las células LNCaP-AI. También se identificaron todos estos miRNAs a ser down-expresado en las células que se habían sometido a transición epitelio mesénquima [27], que es visto como un primer paso esencial para la progresión de las células tumorales no invasivas en los carcinomas metastásicos [28]. Objetivos de estos microRNAs se encontró que eran E-cadherina represores transcripcionales ZEB1 y SIP1, factores previamente implicados en la metástasis del tumor [27]. Un estudio más reciente reveló que la expresión ZEB1 podría mejorar la migración transendotelial de células de cáncer de próstata [29].