Extracto
propiedades biofísicas y bioquímicas del microambiente regulan las respuestas celulares tales como el crecimiento, la diferenciación, morfogénesis y la migración de las células normales y cancerosas. Desde bidimensionales (2D) culturas carecen de las características esenciales del microambiente celular nativa, se han desarrollado en tres dimensiones (3D) de las culturas para imitar mejor la matriz extracelular natural. Hasta la fecha, los sistemas de cultivo en 3D se han basado principalmente en el colágeno y la hidrogeles Matrigel ™, lo que permite un control limitado sobre matriz de rigidez, capacidad de descomposición proteolítica, y la densidad de ligando. Por el contrario, los hidrogeles bioingeniería nos permiten investigar de forma independiente sintonía y sistemático de la influencia de estos parámetros en el crecimiento y la diferenciación celular. En este estudio, polietilenglicol (PEG) hidrogeles, funcionalizados con motivos del ácido arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), motivos de unión celular comunes en proteínas de matriz extracelular, y metaloproteinasas de matriz (MMP) sitios de escisión, se caracterizaron con respecto a su rigidez, propiedades que favorecen su dispersión, y la capacidad para apoyar el crecimiento de células de cáncer de próstata LNCaP dependientes de andrógenos. Se encontró que las propiedades mecánicas moduladas la cinética de crecimiento de células LNCaP en el hidrogel de PEG. En los períodos de cultivo de 28 días, las células LNCaP fueron sometidos a cambios morfogenéticos, formando estructuras similares a tumores en cultivo 3D, con hipoxia y núcleos apoptóticos. Asimismo, comparó proteínas y niveles de expresión génica entre las culturas 3D y 2D a la estimulación con el andrógeno sintético R1881. Curiosamente, la cinética de R1881 estimulados receptor de andrógenos (AR) translocación nuclear diferían entre las culturas 2D y 3D cuando se observa por la tinción de inmunofluorescencia. Por otra parte, los estudios de microarrays revelaron que los cambios en los niveles de expresión de genes sensibles a los andrógenos sobre el tratamiento R1881 diferían mucho entre las culturas en 2D y 3D. En conjunto, el cultivo de células LNCaP en los hidrogeles de PEG sintonizables revela diferencias en las respuestas celulares a la estimulación de andrógenos entre los entornos 2D y 3D. Por lo tanto, se sugiere que el sistema de cultivo 3D presentado representa una poderosa herramienta para pruebas de drogas de cáncer de próstata de alto rendimiento que recapitula microambiente tumoral
Visto:. Sieh S, Taubenberger AV, Rizzi SC, Sadowski M, ML Lehman, Rockstroh A, et al. (2012) Caracterización fenotípica de las células del cáncer de próstata LNCaP cultivadas dentro de un microambiente de bioingeniería. PLoS ONE 7 (9): e40217. doi: 10.1371 /journal.pone.0040217
Editor: Elizabeth Wilson, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Noviembre 2011; Aceptado: 6 Junio 2012; Publicado: September 5, 2012
Copyright: © Sieh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Tecnología de Queensland puesta en marcha de subvención para la silla de profesor DW Hutmacher, Prostate Cancer Foundation de Australia, Australia canadiense de próstata Cancer Research Alliance, cáncer de próstata australiana Centro de Investigación-Queensland y subvención NHMRC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es una de las enfermedades malignas más frecuentes entre los hombres en los países occidentales. La tasa de supervivencia a 5 años para los hombres diagnosticados con CaP localizado se acerca al 100%; mientras que, el pronóstico empeora rápidamente tras la progresión del CaP a la enfermedad avanzado y metastásico [1] - [2]. A pesar de avances en los métodos de detección y tratamientos, PAC sigue siendo una causa importante de muerte por cáncer en los hombres. Por lo tanto, es importante para obtener una mayor comprensión de la progresión del CaP localizado en avanzado utilizando sistemas fisiológicos relevantes. Al igual que muchas otras células cancerosas, las células de CaP se han estudiado ampliamente en dos culturas dimensionales (2D), a través del cual se ha obtenido un conocimiento básico importante de la biología del cáncer. Sin embargo, en los tejidos nativos, las células están incrustadas en la matriz extracelular (ECM) que proporciona no sólo el apoyo de arquitectura, sino también señales químicas y mecánicas a las células [3] - [4]. Recientemente, la importancia de las propiedades mecánicas de la microambiente tumoral se ha reconocido cada vez más. En general, el tejido canceroso y su estroma son más rígidos que los tejidos no malignos debido a la deposición anormal y remodelación de la ECM en el estroma [5] - [7].
in vitro Estudios in
y pocos
in vivo
estudios han demostrado que la rigidez de la matriz circundante puede aumentar el crecimiento de células cancerosas, modular la señalización celular y facilitar la invasión de células [8] - [11]. Teniendo en cuenta el papel fundamental de la matriz de rigidez, las restricciones geométricas artificiales y la gran rigidez impuesta a las células en 2D plástico de cultivo tisular podría afectar el crecimiento del tumor, la adhesión, la polaridad celular, la morfología, la migración y los mecanismos de proteolisis [12] - [15].
en los últimos años, numerosos estudios han demostrado que el estudio de tumores en 3D reproduce mejores
in vivo
características de crecimiento y resistencia contra agentes quimioterapéuticos que un enfoque 2D [16] - [18]. Los modelos matriciales 3D más utilizados son animales derivados reconstituyeron extracto de membrana basal, Matrigel ™ [17], [19] - [20], y el tipo de colágeno de cola de rata matrices I [21] - [24]. A pesar de estas matrices de origen natural tienen propiedades biológicas similares a ECM, sus características inherentes limitar la flexibilidad de ajustar la rigidez de la matriz sin afectar de forma simultánea otras propiedades de la matriz como la capacidad de descomposición proteolítica y la densidad de ligando. Por otra parte, Matrigel ™ muestra variaciones de un lote a otro, lo que disminuye la reproducibilidad de los experimentos y la comparabilidad de los conjuntos de datos entre diferentes laboratorios. Para simplificar las de otro modo complejas interacciones celulares de los múltiples componentes que se producen en matrices de origen natural, existe un interés creciente en el uso de matrices de ingeniería con características biológicas y bioquímicas específicas de ECM naturales [25] - [28]. Estas matrices biomiméticos permiten un estudio más sistemático de los efectos de determinados componentes o propiedades del microambiente tumoral en las células cancerosas. Por lo tanto, los enfoques emergentes en la ciencia biomaterial se han centrado en el desarrollo de matrices sintéticas tales como matrices hyaluronon derivados o de alginato para células de cáncer de cultivo [25] - [28]. Otro ejemplo es hidrogeles basados en PEG que son inertes a sí mismos en términos de la activación de vías de señalización celular, pero puede ser equipado con (por ejemplo, sitios de degradación proteolítica) bioquímicos y funciones biológicas (por ejemplo, motivos RGD en una forma controlada) [29]. Ventajosamente, la rigidez de tales hidrogeles puede ser sintonizado con precisión, independientemente de su sensibilidad y ligando celular proteolítica densidad.
MMP-sensibles hidrogeles basados en PEG Previamente, nosotros y otros han usado en la que motivos RGD se incorporan en una la densidad se define [13], [30] - [32]. Los motivos RGD proporcionar sitios para la unión de las células a través de las integrinas, y las secuencias de escisión de MMP permitir que las células para degradar la matriz, lo que crea el espacio para la proliferación celular y la migración. Con este fin, no se ha informado de una caracterización fenotípica completa de las células de CaP cultivadas dentro de esta ECM biomimético. En este estudio, que tuvo como objetivo establecer y validar un sistema de cultivo de células LNCaP 3D que permite el modelado de la formación de tumores avascular etapa temprana. Para ello, se investigó el efecto de la rigidez de hidrogel sobre el crecimiento celular. A partir de entonces, se examinó la morfología, la expresión génica y la síntesis de proteínas de las células LNCaP cultivadas en hidrogeles 3D en comparación con cultivos 2D convencionales. También utilizamos este sistema de cultivo 3D para estudiar los efectos de la síntesis de andrógenos, R1881, en la señalización AR en comparación con cultivos 2D [33] - [34]
Nuestros resultados proporcionan ideas sobre el papel del microambiente. en la modulación del comportamiento celular y molecular de células cancerosas. Por otra parte, revelamos las diferencias en las respuestas celulares a los andrógenos entre las culturas en 2D y 3D. Este modelo es un trampolín para el desarrollo de sistemas de cultivo 3D replicar el
in vivo
tumor microambiente, lo que permite la creación de potentes herramientas para entender mejor la biología de CaP, en particular, en respuesta a los andrógenos.
Resultados
propiedades mecánicas y de difusión de hidrogeles biomiméticos dependen del contenido de PEG
para imitar las primeras etapas de la formación de tumores PAC en 3D, nos dispusimos a las células LNCaP de cultivo en PEG biomimético hidrogeles. Los precursores de PEG conjugados con los sitios de escisión de MMP y motivos RGD se incorporaron en la red de hidrogel para conferir características biomiméticos esenciales de la ECM natural (Figura 1A). Dado que las propiedades mecánicas del hidrogel se sabe que influyen en el crecimiento, la morfología y fenotipo invasivo de las células cancerosas [5], [10], [35], que primero dirigido a optimizar la rigidez del hidrogel para el cultivo celular. hidrogeles de PEG libres de células de rigidez variable se prepararon mediante el ajuste del contenido de PEG a 1,5, 2, 2,5% (w /v). La rigidez del hidrogel se determinó por ensayos de compresión no confinada utilizando un microtester (Figura 1B, izquierda) y microscopía de fuerza atómica (AFM) mediciones de indentación (Figura 1C, izquierda), que se convierte en una curva de tensión-deformación (Figura 1B, medio) .
(A) un esquema que muestra la preparación de hidrogeles biomiméticos. células LNCaP fueron mezclados con precursores de PEG que contienen sitios de escisión de MMP y péptidos RGD antes de la polimerización catalizada con FXIII. (B) la rigidez global de hidrogeles libres de células con diferente contenido de PEG (w /v) se midió utilizando un microtester. Una curva de tensión-deformación representante registran para un gel de PEG 2%. El (elástico) el módulo de Young, E, se calcula a partir de la pendiente de la línea ajustada a la curva de tensión-deformación en% de deformación 9-12 (medio). Un diagrama de dispersión que muestra los módulos de Young medido para diferentes hidrogeles de PEG (derecha). Las medianas se indican mediante las barras rojas. (C) la rigidez local de hidrogeles libres de células con diferentes contenidos de PEG (w /v) se midió utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). Una forma piramidal voladizo AFM se utilizó para llevar a cabo mediciones de indentación. Una fuerza representativa frente a la curva punta-muestra-separación se muestra a continuación el esquema de AFM. La línea roja representa el ajuste se utiliza para aproximar la curva de aproximación con un modelo de indentación hertziana. módulos de Young medidos para un hidrogel de PEG 2% se distribuyen normalmente en el intervalo de 4 kPa (medio). Diagrama de dispersión que muestra la mediana de los módulos de Young medidos para diferentes hidrogeles (derecha). Las barras rojas representan las medianas. Ambas mediciones microtester y de indentación AFM producen módulos de Young similar y muestran un aumento lineal de la rigidez con contenido de PEG. (D) Los diagramas de caja muestran los coeficientes de difusión, D medido para el E133 colorante alimenticio (794 Da) y FITC-BSA (66 kDa) en hidrogeles libres de células a diferentes contenidos de PEG. Los valores de D para E133 son un orden de magnitud mayor que para FITC-BSA. Al menos tres muestras se midieron a partir de tres experimentos independientes.
Mientras que el microtestor sondea las propiedades elásticas globales de los hidrogeles de PEG, las mediciones de AFM de sangría proporcionan información sobre su distribución de la rigidez local (Figura 1C). Ambos métodos mostraron un aumento lineal en módulos de elasticidad con el aumento de contenido de PEG y se indican módulos elásticos similares, que oscila entre aproximadamente 0,8 kiloPascal (kPa) a 10 kPa para los hidrogeles de PEG 1,5% y 2,5%, respectivamente (Figura 1B y 1C, derecha) . mediciones de AFM revelan una distribución homogénea del módulo de Young local, E en los hidrogeles sondadas (Figura 1C, medio). Cuando los hidrogeles 2.0% fueron probados mediante el microtester antes y después de más de 4 semanas de cultivo, no se encontraron cambios significativos en la matriz de rigidez global (2.5 hasta 4.2 kPa), que era consistente con la variación de las probadas 2% (hidrogeles Figura S1). Como se informó anteriormente en cultivos de células 3D dentro de matrices similares [5], [10], [35], esto indica que estos biomimético de hidrogel a base de PEG solamente se degradan localmente por las células incluidas, mientras que la rigidez global no se ve afectada por el analizado periodo de crecimiento.
se espera que los cambios en el contenido de PEG para alterar el tamaño de poro de los hidrogeles de PEG [36], que podría afectar a la transferencia de moléculas pequeñas, tales como el andrógeno sintético R1881, y también factores de crecimiento presentes en el en nuestros experimentos medio. Para estimar la difusión de R1881, se midió el coeficiente de difusión D, de la E133 colorante alimenticio (792 Da), que tiene un peso molecular más alto que R1881 (284 Da). Se encontró que los valores medios de difusión disminuyó al aumentar el contenido de PEG (Figura 1D) de 2,99 ± 0,06 × 10
-6 cm
2 /s de 1,5% hidrogeles de PEG a 1,9 ± 0,13 × 10
- 6 cm
2 /s de 2,5% hidrogeles de PEG. Para probar si los factores de crecimiento esenciales tales como el factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento endotelial vascular y factor de crecimiento derivado de plaquetas (20-50 kiloDalton, kDa) también puede penetrar en el hidrogel, se investigó la difusión de la fluoresceína albúmina de suero bovino conjugado con isotiocianato de (FITC BSA) (66 kDa), que tiene un peso molecular más alto que estos factores de crecimiento. El coeficiente de difusión de FITC-BSA fue menor en comparación con E133 y disminuyó al aumentar el contenido de PEG (Figura 1D). D valores de 1,5-2,5% hidrogeles de PEG (1,5-3,0 × 10
-7 cm
2 /s) están dentro del mismo orden de magnitud (6 × 10
-7 cm
2 /s) reportado por Ramanujan
y col gratis (2002) y Erikson
y col gratis (2008) que mide la difusión de BSA en los geles de colágeno más suaves [37] -.. [38]. Cuando hidrogeles de PEG se incubaron con FITC-BSA durante 24 horas, se observó penetración generalizada de la FITC-BSA (Figura S2). A partir de estos resultados se puede concluir que, a pesar de transferencia de R1881 y factores de crecimiento puede ser ralentizado en geles con mayor contenido de PEG, el tamaño de los poros de todos los geles es lo suficientemente grande como para proporcionar células embebidas con factores solubles a partir del medio de cultivo.
proliferación de las células LNCaP dentro de hidrogeles biomiméticos está influenciada por el contenido de PEG y la rigidez de los hidrogeles
a continuación, para evaluar el efecto de la rigidez de la matriz sobre la proliferación celular, se cultivaron las células LNCaP en 1,5, 2,0 y 2,5% hidrogeles más de 28 días (Figura 2A, panel superior, derecha). Los cultivos monocapa (tiempo de duplicación, Td = 27 hr) creció exponencialmente hasta el día 5 y comenzó a estabilizarse a partir de entonces (Figura 2A, panel superior, izquierda). Por el contrario, las células proliferaron más lento en 1,5% (Td = 54 hr) y 2% (Td = 58,5 hr) hidrogeles de PEG. El crecimiento exponencial se produjo entre los días 7 y 14 en las culturas 3D (Figura 2A, panel superior, derecha). células LNCaP continuaron proliferando al menos hasta 28 días en los hidrogeles 2,0%, mientras que el número de células máximos se alcanzaron después de 14 días en los hidrogeles 1,5%. Las tasas de crecimiento más altas en el más suave 1,5% hidrogel en comparación con el hidrogel de 2,0% pueden ser debido a la tensión más baja ejercida sobre las células por el hidrogel circundante más suave [39] - [40]. La curva de crecimiento sigmoidal que observamos es comparable con el crecimiento observado de xenoinjertos de LNCaP con evidencia de crecimiento en la etapa temprana de crecimiento lento, exponencial en la etapa intermedia y ralentización del crecimiento en la etapa posterior [41] - [46]. Por otra parte, no se detectó ningún crecimiento en 2,5% hidrogeles como lo confirma el tinción-muertos viven (Figura 2A, panel inferior) que revela la presencia de células predominantemente no viables en el hidrogel 2,5% el día 24. Las imágenes de campo claro mostraron que las células fueron capaces de formar colonias en el 1,5 y 2,0%, pero no en el 2,5% hidrogeles.
(a) curvas de crecimiento de células LNCaP más de 7 días para cultivos 2D (izquierda) y 28 días para los cultivos 3D ( derecha) en los medios normales de crecimiento medidos por el contenido de ADN total (media ± dE). En cultivos 2D células proliferan mucho más rápido alcanzar la confluencia plazo de 7 días (panel superior, izquierda). El perfil de crecimiento de las células depende de las propiedades mecánicas de las matrices de PEG bioingeniería, donde la tasa de crecimiento es mayor en 1,5%, seguido por las células cultivadas en 2% hidrogeles (panel superior, derecha). No proliferación celular se detecta en los hidrogeles más rígidos (2.5%). examen en vivo-muerto se realizó mediante tinción con yoduro de fluoresceína diacetato-propidio en el día 24 de células LNCaP cultivadas en diferentes contenidos de PEG (panel inferior). La tinción-muertos viven revela que la mayoría de las células son viables (verde) en ambos 1,5 y 2,0% hidrogeles pero no viable (rojo) en 2,5% hidrogeles. Las imágenes fueron tomadas con CLSM (10 × 0,4 NA). imágenes de campo claro también confirman que las células en 2,5% hidrogeles no se formaron colonias como se observa en el 1,5% y el 2,0% hidrogeles a los 28 días (B) (panel superior) Un representante proyecciones 3D CLSM de colonias LNCaP marcadas con faloidina (actina, rojo ) /DAPI (núcleos, azul) desde el día 7 al día 28 (20 ×, 1,0 NA). Las colonias son más redondeados en el día 7 y el día 14, pero se convierten en agregados irregulares a partir del día 21 en adelante. Los diagramas de caja de tamaño de las colonias y el factor de forma analizado desde seis imágenes CLSM (panel inferior) muestran un aumento significativo en el tamaño de esferoides y disminución en el factor de forma (p & lt; 0,001) en el día 28 con relación al día se detectan 7 culturas. (C) Una sección representativa de la histología día 28 culturas revelan la formación de invasoras 'dedos' (flecha) que penetra el hidrogel circundante (izquierda). El H & amp; E mancha (centro) muestra un núcleo hueco. La inmunohistoquímica mancha de la caspasa 8 (derecha) confirma células apoptóticas dentro del núcleo (marrón). parcelas (D) de dispersión de tamaño de la colonia, el número de células y el tamaño del núcleo en su caso analizados a partir de 10 micras de espesor secciones histológicas. Esto demuestra que cada tamaño de la colonia aumenta linealmente con el número de células. tamaño Core también aumenta linealmente con el tamaño de la colonia. Al menos tres experimentos independientes se realizaron para cada análisis. Las barras de escala: (A, izquierdo, B) de 250 micras, (A, derecha) de 100 micras y (C) 50 micras
En base a este estudio de proliferación, hemos seleccionado 2.0% para hidrogeles de PEG. la realización de experimentos posteriores. Hasta la fecha, la rigidez local dentro del tejido glandular de la próstata es desconocida. Sin embargo, la rigidez de los 2% en geles de 4 kPa están dentro del rango informado de los tejidos blandos (1-10 kPa) y tejido glandular mamario (4 kPa) [5], [47].
esferoides LNCaP en hidrogeles biomiméticos varían morfológica y fenotípicamente a partir de células LNCaP en cultivos 2D
a continuación, se examinó la morfología de las células LNCaP cultivadas durante 28 días en un 2% de hidrogeles de PEG biomiméticos. Confocal de imágenes de faloidina y 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) hidrogeles teñidas (Figura 2B, panel superior y la Figura S3, izquierda) y el lapso de tiempo videomicroscopy (Video S1) mostraron que las células individuales proliferaron en colonias de hasta 200 micrones de diámetro en el hidrogel. Estas colonias se parecían a la morfología de las colonias LNCaP cultivadas en Matrigel ™ (Figura S3, derecha) como nosotros y otros han descrito anteriormente [48] - [49]. El tamaño de las colonias se incrementó de 7 días a 21 días y se mantuvo constante a partir de entonces (Figura 2B, panel inferior). Los agregados celulares eran de forma esférica hasta el día 21 que pasó a ser irregular, según lo confirmado por una disminución significativa en factor de forma en el día 28 (Figura 2B, panel inferior). La faloidina-DAPI y Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinciones de secciones congeladas revelaron que el día 28 colonias formaron estructuras '' en forma de dedos y, a menudo presentan un núcleo central hueco (Figura 2C). La presencia de células apoptóticas en esta región, como se detecta a través de la caspasa 8 de tinción, también se observó. Este aumento del número de células apoptóticas dentro del núcleo que ha sido descrito en otras
Tarjetas telefónicas cultivos in vitro 3D tumorales [17], [19]. Además el examen histológico de los cultivos 3D apoya que el aumento en el tamaño de cada colonia era proporcional al número de células y tamaño de núcleos formados (Figura 2D). Apoptóticos formaciones básicas se observaron con mayor frecuencia en los días 28 culturas comparación con los otros puntos de tiempo (datos no mostrados).
Dado que la mayor parte de la caracterización previa del fenotipo de células LNCaP se basa en cultivos 2D, nos propusimos examinar la morfología celular LNCaP cultivadas 3D. Como se muestra en la figura 3A, las células LNCaP en 2D se extendió a cabo con la morfología de huso similares. En las culturas 3D, sin embargo, las células se disponen en los agregados de células compactas, con lo cual las células individuales adoptan una morfología más redondeada en comparación con las células en monocapa. Dentro de la colonia LNCaP, el marcador de E-cadherina epitelial (Ecad) co-localizada con contactos célula-célula, mientras que en cultivos 2D Ecad se distribuyó más uniformemente en la superficie celular. A continuación realizó la tinción de marcador de hipoxia con pimonidazole en ambas culturas para evaluar la disponibilidad de oxígeno a las células, detectar un nivel de hipoxia mayor en 3D que en 2D culturas. Esta observación es consistente con xenoinjertos tumorales y tumores clínicos en los que la hipoxia y la apoptosis /necrosis central es una característica común en los tumores sólidos vascularizados mal y culturas anterior esferoide 3D independientes de tipos de células [42], [50] - [54]. Nuestro informe también mostró que en las culturas anteriores 3D (día 14), donde el tamaño de esferoides fue menor (Figura S4), menos tinción pimonidazole fue evidente en comparación con el día 28 culturas (Figura 3). Esto sugiere que los agregados multicelulares, dependiendo del tamaño de las colonias pueden influir en la transferencia de oxígeno dentro de la colonia. Del mismo modo, cuando las células LNCaP fueron cultivadas en geles más suaves (por ejemplo colágeno I y Matrigel ™), la hipoxia se detectó con tinción pimonidazole en día 24 de crecimiento del cultivo (Figura 3B). Esferoides en cultivos en suspensión también se encuentran con el agotamiento del oxígeno en especial hacia el centro de los esferoides [42], [50], [55]. Esto indica que la limitación de la transferencia de oxígeno no es específico para la matriz de hidrogel PEG, pero también es probable que la influencia por el estrecho contacto célula-célula y de alta densidad celular en cultivos 3D.
(A) Una comparación de las culturas 2D (día 6) y secciones histológicas de las culturas 3D (día 28) revela diferencias en la morfología celular y el fenotipo. la organización del citoesqueleto (actina, rojo) de las células en cultivos 2D revela una extensión y morfología celular alargada (panel superior). El tamaño de celda y el núcleo (azul) de cultivos 2D es más grande que los cultivos 3D. En las culturas en 3D, las células adoptan una morfología de adoquines y la disposición de pila compacta. También forman extensa contacto célula-célula dentro de la colonia. marcadores epiteliales, E-cadherina (cadE, verde) se localiza en la membrana celular y en los contactos célula-célula para ambas culturas (panel central). tinción con hipoxia pimonidazole (verde) indica que hay menos células hipóxicas en cultivos 2D relativos a las culturas 3D (panel inferior). La hipoxia se detecta dentro de la colonia LNCaP en presencia de un núcleo apoptótica (flecha). tinciones (B) pimonidazole realizaron en células LNCaP cultivadas en los hidrogeles de PEG, el colágeno I y Matrigel ™ durante 24 días muestran presencia de hipoxia en todas las matrices. CLSM imágenes fueron tomadas a 40 aumentos y 1,25 NA. Barras de escala: (a) 75 micras y (B) 100 micras
Las proteínas y los niveles de mRNA de los marcadores de LNCaP en cultivos 3D difieren a partir de cultivos 2D a la estimulación con 1 nM R1881 durante 48 h
.
Durante la etapa inicial de la PAC, la gran mayoría de los tumores son dependientes de andrógenos y sensible; Además, la vía de señalización AR desempeña un papel importante en el desarrollo del tumor y es importante durante la progresión [56] - [57]. Por esta razón, las células LNCaP dependientes de andrógenos son ampliamente utilizados en cultivos 2D para el estudio del receptor de andrógenos (AR) de señalización, que se activa por los andrógenos y análogos tales como R1881. Con el fin de ampliar nuestro conocimiento de la respuesta de LNCaP de R1881 en experimentos de cultivo basados en 2D, se investigaron los efectos de R1881 en la expresión de marcadores de la PAC en 3D culturas (Figura 4). tinción de inmunofluorescencia reveló la translocación de AR en el núcleo celular en cultivos 2D y 3D después de 7 h de tratamiento 1 nM R1881 (Figura 4A). Está bien establecido en cultivo 2D que una vez que se une al AR R1881, se transporta al núcleo donde se inicia la transcripción de genes diana, por ejemplo antígeno específico de próstata /calicreína 3 (PSA) [58]. Nuestro estudio preliminar indicó que AR genes diana, tales como PSA, fueron inducidos en los niveles superiores de tratamiento R1881 después de prolongada (después de 36 h), tanto en las culturas 3D (Figura S5A) y 2D. Por lo tanto, hemos elegido para este estudio un tratamiento R1881 48 h para ambas culturas. Curiosamente, sin embargo cultivos 2D y 3D respondieron a la 48 h de tratamiento R1881, como se evidencia por un aumento en el ARNm y los niveles de proteína de PSA, la localización de la AR en núcleo de la célula se detectó en menor medida en cultivos 3D en comparación con cultivos 2D. Sin embargo, ni la localización ni la intensidad del marcador epitelial luminal, citoqueratina 8 (CK8) se vio afectada por el tratamiento R1881 en cultivos 2D o 3D.
(A) tinciones de inmunofluorescencia de células LNCaP después del tratamiento con R1881 7 h espectáculo co -localization del núcleo celular y AR tanto en 2D (día 6) y 3D (día 28) los cultivos (panel superior). Correspondiente localización AR en ambas culturas se muestra en imágenes en escala de grises (panel inferior). (B) Los fenotipos de células de 2D (día 6, panel izquierdo) y 3D (día 28, panel derecho) los cultivos que crecen en medios de andrógenos empobrecido o R1881 complementan los medios de comunicación (48 h) se compararon mediante tinciones de inmunofluorescencia. Las proteínas de interés están en verde, rojo y actina en el núcleo en azul. En cultivos 2D, AR se localiza en el núcleo y en el citoplasma de PSA tras la estimulación R1881. Sin tratamiento, el AR permanece en el citoplasma y el PSA no se detecta. El marcador epitelial luminal, CK8 se detecta en ambas culturas, independientemente de la condición de tratamiento. En las culturas en 2D, CK8 tiñe claramente las fibras de filamento, mientras que en 3D, CK8 se localiza en el borde de la celda. En cultivos en 3D, la localización extranuclear AR se observa en tanto no tratada y tratada R1881 agregados multicelulares. PSA también se produce en abundancia en cultivos tratados con R1881 3D, pero sólo a un nivel muy bajo cuando no se tratan. regiones amplificadas de cada tinción y la cultura condición específica (cajas blancas) A continuación se muestran las imágenes correspondientes. imágenes CLSM se tomaron a 60 × magnificación (1,4 NA) para A y 40 aumentos (1,25 NA) para B. Escala de barras:. (A) 30 m, (B) 75 micras y 25 micras (regiones ampliadas)
Para examinar el efecto de R1881 en los niveles de proteínas, nos centramos en la expresión de la AR, PSA y CK8 mediante la realización de análisis de Western blot. Tras el tratamiento R1881, los niveles de PSA y CK8 se mejoraron en cultivos 2D y 3D en comparación con los controles no tratados de etanol, aunque la elevación de la proteína CK8 por R1881 no era evidente en la tinción de inmunofluorescencia en cultivos 2D y 3D, que puede atribuirse a la falta de la sensibilidad (del anticuerpo utilizado) (Figura 5A, B). Curiosamente, en cultivos 2D tratados, los niveles de proteína de AR fueron elevados en comparación con los controles no tratados, indicativa de la estabilización de ligando unido AR y /o un aumento en la producción de AR [59] - [60]. En contraste, no se detectaron cambios significativos en los cultivos 3D. Tomados en conjunto, esto sugiere una regulación diferencial de la expresión de la proteína AR en cultivos 2D y 3D en respuesta a R1881. El efecto de R1881 en los niveles de mRNA en cultivos 2D y 3D se procedió a investigar por cuantitativa en tiempo real-reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR). De acuerdo con el aumento de los niveles de proteínas, PSA y los niveles de ARNm de CK8 aumentado en ambos cultivos (Figura 5C). Al igual que en el análisis de transferencia Western, el nivel de ARNm de AR no se vio afectada significativamente por el tratamiento R1881 en 3D culturas, pero mostró una tendencia a la baja cuando el tratamiento se prolonga (Figura S5B). A pesar de una mayor expresión AR en cultivos 2D comparación con los cultivos 3D, la expresión de PSA fue similar entre los cultivos, como se muestra en la Figura 5C. Curiosamente, en cultivos no tratados, el nivel de ARNm de PSA basal fue significativamente mayor en el 3D en relación con cultivos 2D. los niveles de mRNA de AR y PSA en xenoinjertos de tumores LNCaP de inmunodeficiencia combinada (NOD /SCID) intacta para no obesos diabéticos /grave (Figura S5C) fueron comparables a la R1881 cultivos estimulados con 3D, pero no las culturas 2D. Por lo tanto, nuestros resultados indican que nuestras culturas 3D reflejen mejor
in vivo
tumores.
(A) Un representante de Western blot revela un aumento del nivel de todas las proteínas estudiadas en cultivos 2D cuando son tratados con R1881 en comparación con la no tratada (control de etanol), mientras que en los cultivos 3D, sólo el PSA y CK8 son significativamente elevada. (B) Relación de señal de proteínas relativas a alfa-tubulina de transferencias Western de R1881 tratados y los grupos de control de etanol (-R1881) se presentan como media ± SE. Las cuantificaciones de proteínas apoyan los cambios que se muestran en las inmunotransferencias anteriores. (C) QRT-PCR que representa la expresión de marcadores de células LNCaP (media ± DE), donde el PSA y CK8 están regulados a nivel de ARNm tras el tratamiento en cultivos 2D y 3D en comparación con los grupos 2D o 3D no tratados. La AR es elevado solamente en cultivos 2D. diferencia significativa (p & lt; 0,05) entre las muestras tratadas y no tratadas dentro de los grupos similares (ya sea culturas 2D o 3D) se denota por (*) y entre un tratamiento similar de los diferentes grupos se indican mediante (Δ). muestras por triplicado fueron analizados a partir de al menos tres experimentos independientes.
respuesta androgénica de células LNCaP en 3D culturas se altera en comparación con cultivos 2D bajo una condición R1881 privados
Teniendo en cuenta las diferencias mencionadas anteriormente en PSA y AR expresión y localización de AR entre los cultivos de células LNCaP en 2D y 3D, se realizó un análisis de microarrays para evaluar globalmente transcripcional diferencias entre cultivos de células 2D y 3D bajo LNCaP andrógeno privado y R1881 condiciones tratado, centrándose en los genes sensibles a andrógenos. Encontramos regulación diferencial de 4157 (1896 hasta 2261 hacia abajo) y 3306 (1304 hasta 2002 hacia abajo) los genes sensibles a andrógenos en cultivo celular 2D y 3D LNCaP tratadas con R1881, respectivamente. El tratado 2D-R1881 (R1881 + 2D) y 3D (3D + R1881) culturas compartieron 2862 genes sensibles a andrógenos comúnmente regulados (1165 hacia arriba y hacia 1697 genes regulados) en comparación con los respectivos controles de etanol (Figura 6A). Curiosamente, el factor de cambio en el nivel de expresión de 898 (31%) de estos genes se redujeron sustancialmente en 3D + R1881 en comparación con 2D + R1881. Esto fue particularmente evidente para los genes regulados, como se muestra en los gráficos de dispersión (Fig. 6A), lo que sugiere una respuesta androgénica en ausencia de andrógenos cuando se cultivaron las células LNCaP en el cultivo 3D. La comparación de los controles 3D y 2D etanol (3D + EtOHvs2D + EtOH) reveló que 1469 genes sensibles a andrógenos fueron expresados diferencialmente (Figura 6B). Esto sugiere fuertemente que la disminución de doble cambio de genes regulados de andrógenos en respuesta a R1881 en el cultivo 3D con relación a 2D + R1881 fue causado por un fuerte cambio en el nivel de expresión de línea de base de los genes regulados de andrógenos (Fig. 6B).