Extracto
El cáncer se origina en las células que han adquirido mutaciones en genes críticos para el control de la proliferación celular, la supervivencia y la diferenciación. A menudo, los tumores siguen dependiendo de los llamados mutaciones del conductor, proporcionando la justificación de terapias contra el cáncer dirigidos. Hasta la fecha, los análisis de secuenciación a gran escala han revelado cientos de mutaciones en tumores humanos. Sin embargo, sin su validación funcional no queda claro que las mutaciones corresponden a conductor, o más bien espectador, las mutaciones y, por lo tanto, si el gen mutado representa una diana para la intervención terapéutica. En los tumores colorrectales humanos, el receptor TrkB neurotrófico ha encontrado mutado en dos sitios diferentes en su dominio quinasa (TRKB
T695I y TRKB
D751N). Otro sitio, en la parte extracelular de TRKB, se encuentra mutado en una línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano (TRKB
L138F). Por último, nuestro propio análisis ha identificado una mutación puntual proximal adicional TRKB al dominio quinasa (TRKB
P507L) en una línea celular de melanoma humano. Las consecuencias funcionales de todas estas mutaciones puntuales, sin embargo, han permanecido hasta ahora difícil de alcanzar. Anteriormente, hemos demostrado que TRKB es un potente supresor de la anoikis y que las células que expresan TrkB-forman tumores altamente invasivos y metastásicos en ratones desnudos. Para evaluar las consecuencias funcionales de estas cuatro mutaciones TrkB, se determinó su potencial para suprimir la anoikis y para formar tumores en ratones desnudos. Inesperadamente, ambos mutantes derivados del cáncer de colon, D751N TRKB
T695I y TRKB
, muestran una actividad reducida en comparación con la de tipo salvaje TRKB. En consonancia, la estimulación con el ligando TRKB BDNF, estos mutantes fueron perjudicados en la activación de TRKB y su efectores aguas abajo AKT y ERK. Los dos mutantes derivados de líneas de células tumorales humanas (TrkB
L138F y TRKB
P507L) eran funcionalmente indistinguible de la de tipo salvaje TRKB tanto en
in vitro
y
in vivo
ensayos. En conclusión, no somos capaces de detectar cualquier ganancia de la función de las cuatro mutaciones puntuales TRKB derivados del cáncer
Visto:. Geiger TR, Song JY, Rosado A, Peeper DS (2011) Caracterización funcional de Cáncer- Humano Las mutaciones TrkB derivados. PLoS ONE 6 (2): e16871. doi: 10.1371 /journal.pone.0016871
Editor: Cuelgue Nguyen, Universidad de Emory, Estados Unidos de Ameica
Recibido: 21 Septiembre, 2010; Aceptado 17 de enero de 2011; Publicado: 17 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Geiger et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Unión Europea para el 6PM TRG, AR y D.S.P. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una enfermedad genética, con numerosas mutaciones somáticas en los proto-oncogenes y genes supresores de tumor que contribuyen al fenotipo maligno [1]. Estos genes normalmente controlan los procesos vitales, incluyendo la proliferación celular, la supervivencia o la diferenciación [2]. Su mutación dota células tumorales con una ventaja selectiva, lo que resulta en la expansión clonal y la neoplasia. Aunque los tumores generalmente albergan múltiples aberraciones genéticas [1], la inhibición de sólo uno o unos pocos productos génicos pueden ser suficiente para suprimir en gran medida la proliferación de células tumorales o la viabilidad [3]. Esto se ha demostrado que causa la regresión del tumor en varios modelos de ratón de cáncer [4] - [6] y conducido a los conceptos de "adicción oncogén" y "tumor hipersensibilidad gen supresor" [3]. La dependencia de las células tumorales en ciertos oncogenes y vías de señalización expone un "talón de Aquiles" del cáncer, que puede ser dirigido para la terapia contra el cáncer [7]. Sobre la base de este concepto, varios agentes terapéuticos novedosos se han desarrollado y se utilizan en la clínica [8]. Ellos incluyen mesilato de imatinib (o "Glivec" /"Glivec") para la inhibición de BCR-ABL en leucemia mieloide crónica (LMC) [9] y para la inhibición de KIT en los tumores del estroma gastrointestinal (GIST) [10], respectivamente. Del mismo modo, en pacientes con cáncer de mama con ErbB2 (también llamado HER-2 /neu), el anticuerpo monoclonal trastuzumab [11] - [13] y el inhibidor de molécula pequeña lapatinib [14] son eficaces. Un papel crítico para las mutaciones oncogénicas se ilustra por el ejemplo de receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR /ERBB1) en células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC), donde sólo un subconjunto de los pacientes responden a la gefitinib inhibidor de EGFR. Los análisis de secuenciación reveló que los tumores que responden albergan mutaciones específicas en EGFR, el aumento de su activación por EGF [15].
Estos y otros ejemplos ilustran que la identificación de oncogenes requeridos crítica para la proliferación de células tumorales y la supervivencia puede conducir a eficaz contra el cáncer terapéutica. Por lo tanto, varios grupos de investigación han estado llevando a cabo la secuenciación sistemática a gran escala de análisis para la detección de los genes que están mutados en el cáncer. Esta estrategia ha llevado primero a la identificación de la quinasa BRAF como un oncogén crítico en una gran proporción de los melanomas y otros tipos de cáncer [16]. En 2003, el grupo de Vogelstein, Kinzler y Velculescu secuenciado de manera sistemática los dominios quinasa de tirosina quinasas todos en una colección de los cánceres colorrectales humanos. Encontraron 7 de 138 genes analizados a mutar en más de un tumor [17]. El mismo grupo analizó posteriormente más de 1000 genes diferentes en cáncer de mama y de colon [18], la identificación de hasta 189 novedoso y conocidos genes del cáncer candidato. Del mismo modo, Stratton, Futreal y compañeros de trabajo en el Instituto Sanger secuenciaron primera 518 quinasas de larga duración en los tumores de pulmón y líneas de células tumorales [19] y, posteriormente, el kinome completa en diez diferentes tipos de cáncer [20]. Estos y otros análisis han identificado cientos de nuevas mutaciones somáticas la mayoría de tumores malignos humanos [21]. Sin embargo, algunas excepciones a un lado, las consecuencias funcionales de esas mutaciones han permanecido en gran medida difícil de alcanzar. Para seleccionar los objetivos apropiados para las futuras terapias contra el cáncer, será necesario probar experimentalmente cuál de estas mutaciones oncogénicas son los genes mutados y sobre la cual dependen los tumores.
Hemos elegido para investigar el receptor TrkB neurotrófico (NTRK2), para los cuales tres mutaciones puntuales somáticas, no es sinónimo han sido reportados en los estudios mencionados anteriormente [17], [19], mientras que nuestro propio análisis ha revelado otra mutación puntual TRKB en una línea celular de melanoma humano. TRKB es uno de los tres miembros de la familia de receptores TRK, que también incluye TRKA y TRKC. TRKB preferentemente se une el factor neurotrófico derivado de cerebro neurotrofina (BDNF) y NT4 /5, mientras que TRKA y TRKC tienen altas afinidades con factor de crecimiento nervioso (NGF) y NT3, respectivamente [22]. El pan-TRK receptor p75 modula aún más la capacidad de respuesta de los receptores Trk de neurotrofinas [22]. TRKB se ha encontrado sobreexpresado en un número de tipos de cáncer humanos agresivos (para revisión ver [23]). Anteriormente, hemos demostrado que TRKB es un potente supresor de la anoikis (la apoptosis inducida por la adhesión celular inadecuada o ausente) en las células epiteliales de la rata, y que las células que sobreexpresan TrkB de formar tumores altamente invasivos y metastásicos en ratones desnudos [24]. Además, nuestro análisis de estructura-función se informó anteriormente demostró que todas estas funciones dependen de la actividad TRKB quinasa en este sistema experimental [25]. Más recientemente, hemos demostrado por las células epiteliales de la rata TrkB-transformado que el aumento de señales de actividad de MAPK a través de giro y el caracol para inducir la transición epitelio-mesenquimal (EMT) de transformación -como, Anoikis supresión y la metástasis [26]. Como dos de las mutaciones puntuales TrkB derivados del cáncer identificados map dentro del dominio quinasa, posiblemente afectando su actividad enzimática, es concebible que actúan oncogenically y corresponden a mutaciones del conductor. El objetivo de este estudio fue, por lo tanto, para evaluar las consecuencias funcionales de cuatro mutaciones puntuales independientes humanas de cáncer derivado de TrkB.
Resultados
Identificación de mutaciones puntuales TRKB cáncer derivadas de ser humano y generación de sistemas de células
Dos mutaciones puntuales no es sinónimo dentro del dominio quinasa de la
TRKB
gen se han descubierto en los tumores colorrectales: TRKB
T695I y TRKB
D751N [17] ( la numeración de todas las secuencias de aminoácidos se refiere a la proteína TRKB humano de longitud completa, número de acceso NP_006171.2). Otra mutación puntual TRKB, TRKB
L138F, fue identificado en la línea celular de adenocarcinoma de pulmón NCI-H2009 [19]. Esta mutación se encuentra dentro del dominio rico en leucina de la parte extracelular del receptor, que se ha demostrado que se requiere para la unión del factor de ligando TRKB neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y la activación del receptor TRKB [25], [27 ], [28]. Se confirmó la presencia de esta mutación por secuenciación del ADN genómico (ADNg) aislado a partir de células NCI-H2009 (Figura 1A, panel izquierdo). La presencia de un pico doble (timidina y citosina) indica que la mutación es heterocigoto, coherente con el informe original [19]. Es el resultado de la sustitución de leucina por fenilalanina. Para buscar más
mutaciones puntuales TRKB
asociados con el cáncer, la secuencia de los exones que componen el
TRKB
dominio quinasa a partir de ADN genómico de 28 líneas de células tumorales humanas, a partir de varios orígenes tisulares (datos no mostrados ). Este análisis reveló un
TRKB
punto de mutación adicional, en la línea celular de melanoma MDA-MB-435. (La línea celular MDA-MB-435 parece haber sido clasificados erróneamente en el pasado [29]. Considerando que se aisló originalmente de un paciente con cáncer de mama [30], [31], el análisis reciente indica que la línea celular disponible en la actualidad es de origen melanoma [32], [33]). El
TRKB
mutación identificada en las células MDA-MB-435 es C1520T, lo que resulta en un cambio de la prolina 507 por leucina (TRKB
P507L). En este caso, la secuencia de gDNA reveló un solo pico solamente (panel de la derecha la figura 1A), lo que sugiere que la mutación es homocigoto. El residuo P507 se encuentra proximal al dominio de quinasa en la parte intracelular del receptor. La Figura 1B muestra una visión esquemática de las posiciones de todas las mutaciones puntuales TrkB cancerosas humanas derivadas analizados en este estudio.
(A) El análisis de secuenciación del ADNg de las células NCI-H2009 que albergan el TRKB
L138F mutación ( panel izquierdo) y de la MDA-MB-435 células que albergan el TRKB
P507L mutación (panel derecho). Asteriscos (*) indican las respectivas bases mutadas. letras negras indican los residuos de tipo salvaje, letras rojas denotan residuos mutantes. (B) Esquema general sobre todas las mutaciones puntuales TrkB derivados del cáncer analizados en este estudio. LRM: leucina-ricos motivo, Ig: dominio de tipo inmunoglobulina, TM: dominio transmembrana. Los números indican las posiciones de residuos de aminoácidos. (C) Los niveles de expresión de mutantes o de tipo salvaje en células TRKB RIE-1, analizados en inmunotransferencia (IB). Tubulina sirve como control de carga. Los números representan la cuantificación de la señal TRKB, normalizado a la alfa-tubulina, y en relación con el control del vector. ensayo (D) la biotinilación de la superficie celular que muestra que al menos una fracción significativa de todos los mutantes TrkB se localiza en la membrana celular. Total de proteínas de superficie celular se biotinilaron con sulfo-NHS-LC-biotina, se lisaron y TRKB se inmunoprecipitó (IP) con anticuerpo TRK (C-14, C-13 para el control). Después de la electroforesis en gel, TRKB biotinilado se visualizó con estreptavidina-HRP y TRKB total con anticuerpo TRK (C-14). Todos los de tipo salvaje y las proteínas mutantes TrkB se hicieron con biotina (panel superior izquierdo). En el lado derecho de la especificidad del ensayo se demuestra: señal de biotina se detectó únicamente para TRKB de longitud completa (panel superior derecho, segundo carril), pero no para citosólica, truncada TPR-TRKB [25] (tercer carril, prevista a las ~ 50 kD), y no en el control de IP (carril 4) o en ausencia de sulfo-NHS-LC-biotina (carril 5). IP de larga duración total y TRKB truncada se muestra en los paneles inferiores. Las puntas de flecha indican larga duración TRKB, flecha indica truncada TPR-TRKB (justo por debajo de las cadenas pesadas de Ig).
Se evaluó si estas cuatro mutaciones puntuales TRKB derivados del cáncer se corresponden con ganancia de función de las mutaciones asociadas con el aumento de potencial oncogénico. Se realizó este análisis en la rata células epiteliales primero, ya que son muy sensibles a la transformación oncogénica TRKB mediada, como marcado por una transformación morfológica EMT-como, anoikis resistencia y la formación de tumor metastásico en ratones desnudos [24] - [26]. Con este fin, hemos clonado de tipo salvaje y mutante TRKB en el vector de expresión retroviral pBabe-puro y transducidas epitelial intestinal de rata (RIE-1) de las células así como las células E1A-inmortalizada epiteliales de riñón de rata (RK3E). Ambas líneas celulares se inmortalizan, sin embargo, no oncogénico en ratones atímicos. Como control negativo, expresamos un mutante quinasa-inactiva de TRKB, TRKB
K588M [34], que anteriormente hemos demostrado que es incapaz de transformar células oncogenically RIE-1 [25], [26]. Se confirmó por Western blot que todos los mutantes TrkB se expresaron a niveles similares a los de tipo salvaje TRKB (Figura 1C para las células RIE-1, Figura S1 A para las células RK3E). En consonancia con nuestras observaciones anteriores [25], que hemos detectado TRKB como múltiples especies en un gel de poliacrilamida-SDS, más probable es que reflejan las especies diferencialmente glicosiladas [35]. Además, mediante la realización de un ensayo de la biotinilación de la superficie celular nos aseguramos de que al menos una fracción detectable de todos los mutantes TrkB correctamente localizado en la membrana celular [36] (Figura 1D). por tanto, hemos generado un sistema celular que nos permite comparar las actividades y funciones de los diferentes mutantes de lado a lado TrkB.
Cómo transformar el potencial de mutantes puntuales TrkB derivados del cáncer humano in vitro
Al igual que la mayoría de las quinasas , TRKB necesita un nivel mínimo de activación para transformar las células epiteliales. La hipótesis de que si las mutaciones TrkB derivados del cáncer confieren una ganancia de función, que pueden transformar las células epiteliales, incluso en ausencia (o con niveles reducidos) de BDNF. Sin embargo, cuando probamos los diversos mutantes TrkB en ausencia de ligando co-expresado, ninguna de ellas indujo una morfología celular en forma de huso (Figura 2A para RIE-1 células, Figura S1B para RK3E células) o anoikis suprimidas (Figura 2B, Figura S1C) en ausencia de BDNF. Esto fue en contraste con lo observado para el mutante TPR-TRKB constitutivamente activa e independiente del ligando, lo que hizo transformar células RK3E RIE-1 y y anoikis suprimido en ausencia de exógeno BDNF, en consonancia con nuestro informe anterior [25].
(a) Morfología de las células que expresan RIE-1 de tipo salvaje o mutante TRKB, fotografiada a 50 aumentos. (B) Ensayo de Anoikis, en el que las células descritas en (A) se sembraron en placas ULC y escanea en 1x ampliación 9 días más tarde (7 días para TPR-TRKB).
A continuación, se activó el de tipo salvaje y mutantes de los receptores de forma estable co-expresión de BDNF humano, tanto en RIE-1 (Figura 3A) y células RK3E (Figura S1D). En consonancia con nuestras observaciones anteriores [24] - [26], las células que expresan de tipo salvaje TRKB + BDNF esto resultó en la transformación morfológica de EMT similar (Figura 3B, Figura S1E), la regulación por disminución de la E-cadherina (Figura 3C y Figura S1F) y la supresión anoikis (Figura 3D, Figura S1G). Lo mismo se observó para las células que expresan TRKB
+ L138F BDNF y TRKB
+ P507L BDNF. Por el contrario, TRKB
T695I- y TRKB
D751N células que expresan fueron perjudicados en su respuesta a BDNF (Figura 3B, C, D, Figura S1E, F, G). Estos resultados muestran que, de forma inesperada, TRKB
T695I y TRKB
D751N se vean afectados en su capacidad para transformar las células epiteliales de la rata
in vitro
. Por otra parte, TRKB
L138F y TRKB
P507L son indistinguibles de los de tipo salvaje TRKB en este entorno.
(A) RIE-1 células que expresan TRKB mutante o de tipo salvaje fueron transducidas con el BDNF y analizados en inmunotransferencia (IB). Punta de flecha indica la posición del BDNF. Tubulina sirve como control de carga. (B) morfológica transformación de células RIE-1 co-expresión de TRKB mutante o de tipo salvaje y el BDNF, fotografiada a 50 aumentos. (C) El marcador de la E-cadherina epitelial está regulado por disminución en las células inducida por TrkB, morfológicamente transformado, tal como se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia (IB). β-actina sirve como control de carga. (D) Anoikis supresión por mutante o de tipo salvaje TRKB + BDNF en las células descritas en (A). Las células fueron escaneados con un aumento de 1x 9 días después de la siembra en placas ULC.
Capacidad de respuesta del cáncer derivados de mutantes TrkB humanos a BDNF
Hemos demostrado previamente que TRKB mediada por la transformación oncogénica de células RIE-1 depende fundamentalmente de la actividad TRKB quinasa [25], [26]. En busca de una explicación bioquímica de los resultados anticipados descritos anteriormente, a fin de determinar si los mutantes TrkB derivados del cáncer difieren de tipo salvaje TRKB en su capacidad de respuesta a BDNF. Para medir la activación TRKB, usamos células RIE-1 que expresan de tipo salvaje o mutante TRKB pero no ligando, y se estimularon las células con un intervalo fisiológicamente relevante de BDNF recombinante. De acuerdo con nuestros estudios anteriores [25], [26], este autofosforilación inducida de tipo salvaje TRKB (Figura 4A y 4B), y dio lugar a la activación de dos importantes vías de señalización corriente abajo [22]: la vía PI3K (que resulta en fosforilación de AKT /PKB; Figura 4C) y la vía MAPK (que resulta en la fosforilación de MAPK /ERK; Figura 4D). La exposición a 1 ng /ml BDNF era suficiente para provocar de tipo salvaje autofosforilación TRKB y activar la vía MAPK, mientras que se requieren concentraciones más altas de BDNF para activar AKT (Figura 4B, C, D y datos no presentados). TRKB
L138F y TRKB
P507L respondieron a BDNF de forma similar a TRKB de tipo salvaje. En consonancia con su incapacidad para reprimir anoikis, TRKB
T695I se activó sólo parcialmente por el BDNF, mientras TRKB
D751N fue totalmente insensible a BDNF, idéntica a la quinasa inactiva TRKB
K588M (Figura 4). Estos resultados muestran que TRKB
T695I y TRKB
pantalla D751N reducida capacidad de respuesta a la estimulación del BDNF en las células epiteliales de la rata, mientras que TRKB
L138F y TRKB
P507L se comportan de forma indistinguible de la de tipo salvaje TRKB.
células (a) RIE-1 que expresan de tipo salvaje o TRKB mutante se estimularon con 10 ng /ml BDNF recombinante y se analizó para fosfo-tirosina (pY) y el contenido total TRK por inmunoprecipitación (IP) y análisis de inmunoblot posterior (IB) . las células (B) RIE-1 que expresan de tipo salvaje o mutante TRKB se estimularon con 1 ng /ml BDNF recombinante y se analizaron para fosfo (P) y TRK total. (C) RIE-1 células que expresan de tipo salvaje o mutante TRKB fueron estimuladas con 10 ng /ml BDNF recombinante y se analizaron para fosfo- (p) AKT y AKT total. inhibidor de PI3K LY294002 se aplicó para confirmar la identidad de la señal de pAKT indicado por la punta de flecha. El asterisco (*) indica una banda no específica. Las muestras cargadas en los carriles de dos y tres sirven como controles y se obtuvieron a partir de un experimento replicado realizado en condiciones idénticas. las células (D) RIE-1 que expresan de tipo salvaje o mutante TRKB se estimularon con 1 ng /ml BDNF recombinante y se analizaron para fosfo- (p) ERK y ERK total. Para todos los paneles, los números indican debajo de la cuantificación de las señales de fosfo-específicos, normalizado a las señales totales y en relación con los de tipo salvaje TRKB.
potencial oncogénico de mutantes TrkB cáncer derivadas de ser humano expresado en las células epiteliales de la rata
a continuación, probamos el potencial oncogénico de la TRKB mutantes
in vivo
, en experimentos de xenoinjertos de ratón. Nos inoculadas subcutáneamente ratones Balb /c ratones desnudos con el tipo salvaje o células que expresan TrkB-mutantes. En ausencia de BDNF, solamente de tipo salvaje TRKB-, TRKB
L138F- y TRKB
P507L células que expresan RIE-1 (Figura 5A, B, Figura S2A, B) y células RK3E (Figura S2E, F ) formado tumores grandes con latencias cortas, pero ninguno de los TRKB
T695I- o TRKB
D751N células que expresan lo hicieron. Similar a esto, también en la presencia de co-expresó BDNF, TRKB
L138F y TRKB
P507L tumores causados de manera similar a de tipo salvaje TRKB en RIE-1 y células RK3E (Figura 5C, D, Figura S2C, D y la Figura S2G, H). En esta configuración, RIE-1 TRKB
T695I + BDNF células que expresan también formados tumores, pero con un retraso estadísticamente significativo, en comparación con RIE-1 TRKB
wt + células (Figura 5C, S2C) BDNF-expresión. Es de destacar que, cuando 1 * 10
se inocularon 5 células, las células también RIE-1 TRKB
D751N + BDNF que expresan formaron tumores, pero con una significativa más tiempo de latencia que los inducidos por RIE-1 TRKB
wt + células que expresan BDNF (datos no mostrados). En las células RK3E, la expresión de TRKB
D751N no condujo a la formación de tumores, incluso con número de células y en presencia de BDNF, mientras que RK3E TRKB
células tumores formados con una latencia más significativo T695I + BDNF-expresión de comparación a RK3E TRKB
wt + células (Figura S2G) BDNF-expresión. A pesar de algunas diferencias entre las dos líneas celulares, en general, estos hallazgos indican que TRKB
T695I y TRKB
D751N se vean afectados en la transformación de las células epiteliales de la rata también
in vivo
. Además, ni TRKB
L138F ni TRKB
P507L muestra una mayor actividad oncogénica en comparación con el de tipo salvaje TRKB.
(A) 1 * 10
6 células RIE-1 que expresan TRKB (silvestre tipo o mutante) se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de ratones desnudos. n = 5 para el peso y P507L, n = 4 para T695I y D751N. (B) 1 * 10
6 células RIE-1 que expresan TRKB (de tipo salvaje o mutante) se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de ratones desnudos. n = 4 para ambas líneas celulares. (C) 1 * 10
4 RIE-1 en las células co-expresión de BDNF y TRKB (de tipo salvaje o mutante) se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. n = 6 para WT y P507L, n = 3 para T695I y D751N. (D) 1 * 10
5 RIE-1 en las células co-expresión de BDNF y TRKB (de tipo salvaje o mutante) se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. n = 4 para ambas líneas celulares. En todos los experimentos, los ratones fueron sacrificados cuando la carga tumoral alcanzó 2 cm
2 se muestra y la curva de supervivencia de Kaplan-Meier. La significación estadística se determinó con una prueba de log-rank.
BDNF capacidad de respuesta de TRKB derivados del cáncer de colon humano
T695I y TRKB
D751N expresa en las células de cáncer de colon
una posible explicación de la actividad alterada de TRKB
T695I y TRKB
D751N en los ensayos descritos anteriormente es que ellos realizan en un contexto celular aphysiological. De hecho, el cableado de las redes de señalización intracelular y el patrón de expresión de factores de regulación TrkB pueden no ser idénticos a través de tipos de células. Idealmente, uno debe evaluar la función de los mutantes de trkB en su contexto original, es decir, en las células tumorales en los que se identificaron originalmente. Sin embargo, no existen líneas celulares que expresan disponibles TRKB
T695I o TRKB
D751N forma endógena. Por otra parte, a nuestro conocimiento no hay una línea de células epiteliales de colon humano primario disponible. Con el objetivo de utilizar un sistema de células fisiológicamente relevante, transduced COLO 205 y Caco-2 células de carcinoma de colon humano con TRKB
T695I o TRKB
D751N y poblaciones policlonales obtenidos de forma estable que expresan receptor. Hemos estimulado estas células con BDNF recombinante y posteriormente se midió la autofosforilación TRKB y la activación de los efectores. De manera similar a lo que se observó en las células RIE-1, tanto en las células COLO 205 y Caco-2, TRKB
T695I y TRKB
D751N fueron menos abundantes fosforilada que el tipo silvestre TRKB a la estimulación con BDNF (Figura 6). ERK se fosforiló a la estimulación TRKB sólo en las células Caco-2, pero no en células COLO 205 (Figura 6C, D). Esto es probablemente porque las células COLO 205 albergan una BRAF
mutación V600E (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic), que es constitutivamente activa y estimula la señalización MAPK [16]. Tras la estimulación de las células Caco-2 con BDNF, ni TRKB
T695I ni TRKB
D751N inducida por la fosforilación de ERK (Figura 6D). En conjunto, estos resultados muestran que la TRKB
T695I y TRKB
mutantes D751N son menos activos no sólo en las células epiteliales de la rata, pero también en dos líneas celulares de carcinoma de colon humano.
205 células (A) COLO y células Caco-2 (B) que expresan de tipo salvaje o mutante TRKB se estimularon con 10 ng /ml BDNF recombinante y se analizaron para fosfo-tirosina (pY) contenido por inmunoprecipitación (IP) y análisis de inmunoblot posterior (IB). lisados (C) celulares de células COLO 205 de (A) y, (D) de lisados de células Caco-2 a partir de (B) se analizaron para fosfo (P) y TRK total y (p) ERK. El inhibidor de MEK U0126 se aplicó para confirmar la identidad de las señales de beneficio. β-actina sirve como control de carga.
Desmontables de TRKB endógena
L138F y TRKB
P507L en tumores humanos líneas celulares
El hecho de que TRKB
L138F y TRKB
P507L se expresan de forma endógena en líneas celulares tumorales nos dio la posibilidad de investigar si se le pide por su fenotipo oncogénico. Estamos agotados TRKB
L138F y TRKB
P507L del NCI-H2009 y MDA-MB-435 células, respectivamente, por la interferencia de ARN con dos no superposición de horquilla corta (sh), construcciones independientes de ARN. Hemos logrado ~ 75% de la regulación a la baja TRKB en células NCI-H2009 (Figura 7A). Sin embargo, esto afectó ni la morfología de las células (panel superior Figura 7B), ni la resistencia a la anoikis (panel inferior Figura 7B). Del mismo modo, ~ 80% regulación a la baja de TRKB en MDA-MB-435 células (Figura 7C) no tuvo ningún efecto sobre la morfología celular (panel superior Figura 7D) y la resistencia a la anoikis (panel inferior Figura 7D). En consonancia con estas observaciones, los niveles de E-cadherina no se cambiaron al derribo TRKB en cualquiera de las líneas de células (Figura 7E). Además, no se observó ningún efecto sobre la proliferación celular (datos no mostrados). A pesar de que TRKB no se agotó completamente en cualquiera de las líneas de células, estos resultados sugieren que (mutante) TRKB en NCI-H2009 y las células MDA-MB-435 no es un importante motor de su fenotipo transformado.
(A) QRT-PCR demostrando caída de los niveles de mRNA TRKB con dos horquillas cortas que no se solapan (SH). Los valores promedio de tres mediciones independientes se muestran, las barras de error representan las desviaciones estándar. (B) Derribo de TRKB ni afecta a la morfología de las células NCI-H2009, fotografiado en 50 aumentos (panel superior), ni anoikis resistencia de las células NCI-H2009 en suspensión (panel inferior) de crecimiento adherente. ULC placas fueron escaneados con un aumento de 1x 6 días después de la siembra. (C) QRT-PCR demostrando caída de los niveles de mRNA TRKB con dos horquillas cortas que no se solapan. Los valores promedio de tres mediciones independientes se muestran, las barras de error representan las desviaciones estándar. (D) Derribo de TRKB ni afecta a la morfología de crecimiento adherente células MDA-MB-435, fotografiada a 50 aumentos, ni anoikis resistencia de las células MDA-MB-435 en suspensión (panel inferior). ULC placas fueron escaneados con un aumento de 1x 6 días después de la siembra. (E) Derribo de TRKB en NCI-H2009 y las células MDA-MB-435 no afecta a los niveles de proteína E-cadherina, tal como se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia (IB). Se muestran exposiciones largas y cortas de la misma transferencia. β-actina sirve como control de carga
Discusión
Tres somática, se han notificado mutaciones puntuales no es sinónimo de TRKB en los estudios de secuenciación a gran escala tempranos en los cánceres humanos:. dos en los tumores colorrectales, TRKB
T695I y TRKB
D751N [17], y uno en una línea celular de adenocarcinoma de pulmón, TRKB
L138F [19]. Se identificaron una mutación puntual TRKB adicional, TRKB
P507L, en la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435. Aunque algunos de estos mutantes se han propuesto como el cáncer de conducción genes candidatos [17], de forma inesperada, nuestro análisis en las células epiteliales de la rata y en líneas celulares de tumores humanos no proporcionó apoyo para un efecto de ganancia de función para cualquiera de los cuatro TRKB mutaciones puntuales. De hecho, las dos mutaciones puntuales TrkB derivadas de tumores colorrectales se asociaron con la actividad de quinasa incluso reducida y potencial oncogénico, en comparación con el de tipo salvaje TRKB. Como nota de precaución, hay que tener en cuenta que no hemos probado los mutantes TrkB derivadas de tumores colorrectales en su contexto original, es decir, los tumores que expresan endógenamente TRKB
T695I o TRKB
D751N, mientras que las líneas celulares derivadas los mismos no están disponibles. Sin embargo, la exposición a BDNF de rata tanto epiteliales y las células de cáncer de colon humanas que expresan estos mutantes por resultado una disminución de la activación del receptor TRKB
T695I y casi ninguna activación de TRKB
D751N. Esto sugiere fuertemente que estos mutantes tienen problemas de la actividad enzimática en el contexto de la estimulación BDNF. Incluso se plantea la posibilidad de que TRKB
T695I y TRKB
D751N pueden actuar de una manera negativa dominante, y que tipo de TRKB silvestres también pueden tener tumores de actividad supresora (o una doble función) en el cáncer de colon, pero más estudios ser requerida para abordar estas cuestiones importantes. No podemos excluir la posibilidad de que la capacidad de respuesta de TRKB
T695I y TRKB
D751N a otros ligandos TrkB puede ser diferente de aquel al BDNF. Asimismo, no podemos excluir formalmente la posibilidad de que TRKB
T695I y TRKB
D751N podría haber sido seleccionado en los tumores originales, lo que contribuye a la formación de tumores con funciones que son diferentes de los que probamos
in vitro
. Estas cuestiones no obstante, creemos que es justo decir que estas mutaciones no cumplen los criterios convencionales para la activación mutacional de quinasas receptoras.
En teoría, todas las mutaciones que residen en la parte citoplasmática del receptor podrían influir en la unión de proteínas adaptadoras o sustratos de TRKB, independiente del efecto sobre la actividad quinasa. La presencia y la función de estas parejas de unión se dependen del contexto celular y pueden ser diferentes en diferentes líneas celulares. Aunque el mecanismo prototipo para la función oncogénica de tirosina quinasas es la actividad quinasa constitutiva o mejorado con la señalización aguas abajo alterado [37], los receptores tirosina quinasas pueden tener también funciona quinasa-independientes que contribuyen al cáncer. Esto se ha demostrado para EGFR de tipo salvaje, que, independientemente de su actividad quinasa, interactúa con y por lo tanto estabiliza sodio /cotransportador de glucosa 1 (SLGT1) [38]. Regulación a la baja, pero no la inhibición enzimática, de EGFR conduce a niveles SLGT1 reducidos, la reducción de la captación de glucosa y la autofagia de las células tumorales [38]. Ya sea una función similar también se asocia con TRKB no se conoce. Un estudio reciente sugiere que la variante de empalme TRKB-T1-quinasa deficiente, a la sobreexpresión artificial, puede estimular la metástasis de células de adenocarcinoma de páncreas [39]. Se requieren más investigaciones para dilucidar las funciones quinasa independiente de TRKB y su contribución a la enfermedad maligna, en particular, para hacer frente a cualquier función de la proteína endógena en las células cancerosas.
Hemos identificado y caracterizado también una novela mutación puntual TRKB , TRKB
P507L, que hemos aislado de la línea celular tumoral MDA-MB-435.