Extracto
Cuentas de la metástasis del cáncer para la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer debido a una mala respuesta a los tratamientos contra el cáncer. comprensión molecular de la resistencia a los medicamentos asociados a metástasis sigue siendo difícil de alcanzar debido a la escasez de tejido tumoral disponible. Aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de la sangre periférica de los pacientes se ha convertido en una fuente alternativa válida de tejido tumoral que puede ser sometido a la caracterización molecular. Sin embargo, los problemas con baja pureza y sensibilidad han impedido la adopción de la práctica clínica. Aquí se presenta un nuevo método para capturar y CTC Caracterizar molecularmente aislados de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) que reciben quimioterapia con taxanos. Hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos geométricamente mejorada inmunocaptura diferencial (GEDI) que combina un anticuerpo anti-antígeno prostático específico de membrana (PSMA) con una geometría 3D que captura CTC y reducir al mínimo la adhesión de leucocitos no específica. La enumeración de las CTC-capturado GEDI (definido como células intactas, PSMA nucleado + /CD45-) reveló una mediana de 54 células por ml identificados en pacientes CRPC frente a 3 en donantes sanos. La comparación directa con el CellSearch® disponible comercialmente reveló un 2-400 veces mayor sensibilidad conseguida con el dispositivo GEDI. La microscopía confocal de CTC GEDI-capturado derivados del paciente identificó la TMPRSS2: ERG proteína de fusión, mientras que la secuenciación identificó la mutación específica de andrógenos punto receptor (T868A) en muestras de sangre enriquecida con sólo 50 células PC C4-2. En el chip tratamiento de los pacientes derivados de las CTC con docetaxel y paclitaxel permitió el seguimiento de la participación de drogas objetivo por medio de la agrupación de microtúbulos. CTC aisladas de pacientes CRPC docetaxel resistentes no mostraron ninguna evidencia de actividad de la droga. Estas medidas constituyen los primeros ensayos funcionales de compromiso de drogas-objetivo en la vida las células tumorales circulantes y por lo tanto tienen el potencial de permitir un seguimiento longitudinal de respuesta de destino e informar el desarrollo de nuevos agentes contra el cáncer
Visto:. Kirby BJ, Jodari M, Loftus MS, Gakhar G, Pratt ED, Chanel-Vos C, et al. (2012) Caracterización funcional de las células tumorales circulantes con un dispositivo de microfluidos prostático específico del cáncer. PLoS ONE 7 (4): e35976. doi: 10.1371 /journal.pone.0035976
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: December 20, 2011; Aceptado: March 23, 2012; Publicado: 27 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Kirby et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud (R01 CA137020-01 y U54 CA143876) (PG) de Estados Unidos, el Centro de Ciencias físicas NIH Oncología en Cornell (BK, PG DN), Oficina de Nueva York de la Ciencia, Tecnología e Investigación ( BK), la clínica y traslacional Centro de Ciencia Weill Cornell (DN, PG BK) un Premio a la Creatividad de la Fundación de cáncer de próstata (PG y DN) y el apoyo del Fondo de Investigación Oncológica genitourinario (DN). CCV es un receptor de una beca postdoctoral NRSA. EP y SS fueron apoyados por la Fundación Nacional de Ciencia Graduate becas de investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. BK, PG, ST y DN dan a conocer los ingresos de consultoría de Sanofi Estados Unidos. Esto no altera nuestra adhesión a todas las políticas de la revista PLoS One sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El desarrollo de metástasis en pacientes con tumores sólidos malignos se cree que es el resultado de las células tumorales que entra en el sistema circulatorio y migrar a órganos distantes, donde se extravasan y se multiplican [1] - [3]. Aunque las células tumorales circulantes (CTC) son rara tan sólo una célula por 100 millones de células de la sangre [3], [4], los análisis moleculares y funcionales de las CTC puede proporcionar una mayor comprensión de la biología de la metástasis del cáncer, ayudar a identificar novela terapéutica objetivos, y permitir que las correlaciones clínicas para controlar a los pacientes sometidos a tratamiento [5]. Una variedad de tecnologías se ha desarrollado para mejorar la detección y la captura de CTC de la sangre periférica. Estos incluyen la centrifugación en gradiente de densidad, la separación de perlas inmunomagnéticas utilizando anticuerpos monoclonales de orientación antígenos de la superficie celular epiteliales, clasificación de células usando citometría de flujo, filtración separación por tamaño basada en [6] y los dispositivos de microfluidos. Aunque se han hecho avances en la captura de CTC, la baja frecuencia de las CTC en pacientes con cáncer, su heterogeneidad, la falta de métodos de captura de órganos específicos, y la plasticidad de la población CTC ha limitado la capacidad de capturar y realizar un seguimiento de todas las CTC [2] , [6]. Actualmente, la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), representa el antígeno de elección para la mayoría de los dispositivos de microfluidos que han sido desarrollados para capturar las células tumorales [7] de circulación -. [10]
Sin embargo, la acumulación de pruebas sugiere que la expresión de EpCAM durante la progresión del cáncer y, en particular, durante la transición epitelio-mesenquimal no ha sido bien caracterizado, aumentando las preocupaciones acerca de la universalidad de este antígeno para los sistemas de inmunocaptura [11], [12]. EpCAM se ha informado que tienen potencial oncogénico [13] y se correlacionan con la proliferación en líneas de células [14]; sin embargo, se downregulated durante EMT [1], y los marcadores de EMT se ha demostrado que ser más importante que los marcadores epiteliales por ejemplo, citoqueratina en la predicción de la progresión del cáncer [15]. Por lo tanto, mientras que EpCAM es claramente útil en la identificación de las poblaciones de CTC en muchos tipos de cáncer, los sesgos asociados con el enriquecimiento EpCAM Actualmente se desconocen
.
Además de las incertidumbres con respecto a los antígenos de superficie, la especificidad de inmunocaptura de la sangre es confundida por las propiedades adhesivas no específicos de leucocitos en la mayoría de las superficies de anticuerpos. Debido a la presencia de numerosos leucocitos en la sangre en un aproximadamente 10
4-10
relación de 5:01 con respecto a la CTC, superficies inmunoespecíficos enriquecer CTC, pero no puede aislarlos de leucocitos contaminantes por completo. La identificación de las CTC requiere pasos adicionales y a menudo implica la tinción con DAPI para asegurar la presencia de un núcleo intacto y la inmunotinción para identificar la presencia de marcadores epiteliales (es decir, citoqueratina) y la falta de la CD45 marcador de leucocitos. Tal inmunotinción ha identificado una familia de criterios que se correlacionan número CTC con el pronóstico del paciente [16], pero requiere que la fijación y la tinción ser central en la identificación CTC, como en el sistema CellSearch® comercial [17], [18]. A pesar de que la enumeración de los CTC de pacientes con cáncer de próstata avanzado que reciben quimioterapia usando el sistema disponible en el mercado de captura de CTC por CellSearch® ha demostrado utilidad como indicador pronóstico de supervivencia de los pacientes [17], [18] y enumeración está actualmente en estudio en una serie de clínica ensayos, la presencia de leucocitos contaminantes impiden la utilidad de aguas abajo de los dispositivos de captura de CTC, en que los ensayos basados en ARN o la cuantificación de proteínas se ofuscado por la necesidad de la fijación y material de origen de leucocitos.
para facilitar la captura de alta eficiencia de CTC de la próstata, se ha desarrollado un prototipo de dispositivo de microfluidos que emplea un enfoque que llamamos geométricamente mejorada inmunocaptura diferencial (GEDI). Este dispositivo combina una geometría que reduce la captura de contaminación de los leucocitos mediante la generación de colisiones de la pared celular dependientes del tamaño. Combinamos este enfoque geométrico con una superficie de inmunocaptura específico de la próstata utilizando el anticuerpo monoclonal J591 que reconoce el dominio extracelular del antígeno prostático específico de membrana (PSMA) [10]. PSMA es una peptidasa superficie celular altamente expresado por las células epiteliales de próstata malignos. PSMA es un objetivo atractivo para el cáncer de próstata CTC captura, tal como se expresa en prácticamente todas las células de cáncer de próstata y expresión aumenta después de la castración. Presentamos aquí una demostración detallada de las utilidades múltiples del dispositivo GEDI, incluyendo una comparación de enumeración CTC con CellSearch®, la detección de una mutación AR específica de muestras de sangre enriquecida con sólo 50 células; la identificación de la fusión TMPRSS2-ERG por inmunotinción, y el
ex-vivo
evaluación de la sensibilidad de la CTC-taxano tratamiento utilizando la agrupación de microtúbulos como un marcador de la participación de drogas-objetivo.
Materiales y métodos
fabricación de dispositivos
Todo fabricación de dispositivos se llevó a cabo en el Centro de Ciencia y Tecnología de Cornell nanoescala (Ithaca, Nueva York). técnicas de fotolitografía estándar se utilizan para definir geometrías de matriz en obleas de silicio. Las obleas fueron grabadas con un profundo grabador de iones reactivos plasma de oxígeno (Uniaxis SLR770) a una profundidad de 100 m, y limpiar con ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno antes de la funcionalización de la superficie del anticuerpo. El anticuerpo monoclonal J591 (fabricado por Lonza plc (Slough, Inglaterra) para BZL Biologics, Inc.) Se inmovilizó sobre las superficies de los dispositivos utilizando MPTMS-GMBS-NeutrAvidin-biotina química [10]. Polidimetilsiloxano (PDMS) hojas (05:01 agente base:curing), aproximadamente 3 mm de espesor, se polimerizaron durante 18 horas a 60 ° C y se recortan para formar cubiertas para el dispositivo GEDI. Una hoja de PDMS se fija a la parte superior del dispositivo con una plantilla personalizada para crear canales cerrados pobladas con matrices de correos. Los orificios de entrada y salida fueron creados con un punzón de biopsia, y tubos de metal de calibre 23 se insertaron en el PDMS para conectar entradas y salidas a un tubo externo. Los dispositivos se cebaron con una mezcla de agua /isopropanol 50/50, y luego lavar con agua DI y PBS antes de los experimentos.
Recogida de muestras y captura de microfluidos
Muestras de sangre periférica se recogieron en tubos que contienen sodio anticoagulante citrato (Becton-Dickinson) a partir de voluntarios sanos y pacientes con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración en virtud de un protocolo clínico titulado "Análisis de células tumorales circulantes en el cáncer de próstata. Predecir la respuesta a taxanos:. Un estudio piloto ", que fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de Weill Cornell Medical College de la Universidad de Cornell Se obtuvo sangre de pacientes o donantes sanos después del consentimiento informado por escrito, que también fue aprobado por el comité IRB del Weill Cornell Medical College de la Universidad de Cornell. Como se ha descrito anteriormente [10], se procesó 1 ml de sangre de cada muestra a través del chip GEDI dentro de las 24 horas de la extracción de sangre al empujar la sangre a través del dispositivo a una velocidad de flujo volumétrico de 1 ml /hr (bomba de jeringa Chemyx)
tinción celular y análisis
las líneas celulares utilizadas en estos experimentos como controles de tinción o en experimentos con púas son:. la línea celular de leucemia humana U937, y el .. líneas celulares de cáncer de próstata humano PC-3, LNCaP y C4-2 Todas las líneas celulares se adquirieron de ATCC posterior a la captura, se fijaron las células en el chip con fijador PHEMO a 37 ° C (tampón PHEMO: ácido TUBOS, ácido HEPES, sal disódica EGTA, Mg-Cl2-6H
20, 10% de DMSO), glutaraldehído y formaldehído al 3,7%. Las células fueron bloqueadas (10% suero normal de cabra - Jackson Immuno Research) y la inmunotinción con FITC-conjugado anticuerpo monoclonal humanizado J591 para detectar la expresión de PSMA. monoclonal de ratón anti-CD-45 (BD Biosciences), seguido de AlexaFluor568 etiqueta de cabra anti-ratón secundario (Invitrogen) y el ratón anti-EpCAM directamente conjugado con AlexaFluor647 (Biolegend). Para la detección de antígenos intracelulares, las células se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) en PBS y se tiñeron mediante el uso de la tubulina de rata anti-alfa (YL1 /2, Millipore) y anticuerpo de conejo monoclonal anti-ERG (clon EPR 3864; Epitomics, Burlingame, CA). El anticuerpo anti-ERG fue un generoso regalo del Dr. Mark Rubin (Weill Cornell Medical College, Nueva York, Nueva York). Todos los anticuerpos primarios se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente; anticuerpos secundarios fueron teñidas a temperatura ambiente durante 30 minutos. DAPI se utilizó para la contratinción ADN. GEDI dispositivos fueron montados en portaobjetos con Mowiol y se almacenaron a -20 ° C antes del análisis.
CTC enumeración
Blinded CTC enumeración siguiente etiquetado de anticuerpos se realizó mediante el uso de un punto de barrido Zeiss LSM-700 microscopio confocal, equipado con 405-, 488-, 555-, y las líneas de láser 632 nm. Se identificaron todas las células PSMA + /CD45- nucleadas como CTC. validación inicial de CTC enumeración se realizó por dos, probadores independientes ciego. Los controles positivos y negativos para el rendimiento del anticuerpo y la tinción se incluyeron en cada experimento: células U937 humano de leucemia (CD45 + /PSMA- /EpCAM-), y las líneas celulares de cáncer de próstata humano (C4-2 y LNCaP: PSMA + /CD45- /EpCAM + y PC-3 (PSMA- /CD45- /EpCAM dim). individual
z
-stacks fueron adquiridas utilizando 100X /NA NA 1.46 y 63x 1.3 objetivos /plan-Apo Zeiss controlados por el software Zen (Zeiss) y presentó como proyecciones de máxima intensidad.
ARN extracción
Después de la captura de células, el dispositivo GEDI se enjuagó haciendo fluir PBS durante 30 min a una velocidad de 1 ml /h. las células se lisaron con 700 l de tampón RLT lisis suplementado con 1% β-mercaptoetanol a una velocidad de flujo de 15 ml /hr. se recogió el lisado, y se extrajo el ARN usando el kit de QiagenRNEasy Micro Plus (Qiagen Inc, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.
los tratamientos farmacológicos ex-vivo y Análisis
En
ex vivo
experimentos de tratamiento de drogas, la muestra de sangre de cada paciente se dividió y 1 ml fue llevado a cada uno de los tres dispositivos GEDI simultaneamente. Después de CTC captura y posterior lavado con PBS, cada microdispositivo GEDI se colocó suavemente en una placa de cultivo con medio RPMI-1640 que contienen 2% de suero y se suplementó con el control de DMSO sea 0,1% o paclitaxel a concentraciones de 100 nM o 1 M y se incubó a 37 ° C durante 24 horas. Al final del tratamiento, las células GEDI-capturado se fijaron con PHEMO tampón y se procesaron para microscopía confocal multiplex siguiente inmunotinción con diferente superficie celular y los anticuerpos citoplasmáticos como se indica. Todos los CTC (PSMA + /CD45- /DAPI +) se evaluaron para la presencia de haces de microtúbulos como evidencia de la participación fármaco-diana eficaz. El porcentaje de CTC con evidencia de empaquetamiento de microtúbulos se calculó. En todas las muestras analizadas, la agrupación fue claramente evidente por la forma distinta, la anchura, la orientación y el aumento de intensidad de fluorescencia de haces de microtúbulos en comparación con los microtúbulos de las células no tratadas. Además, se utilizó DAPI de contraste para evaluar la presencia de mitosis o apoptosis núcleos después del tratamiento de drogas.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico para comparar los recuentos medios de CTC obtenidas de pacientes CRPC y saludable donantes. Se utilizó un no paramétrico (Wilcoxon) análisis, como recuentos de CTC no mostraron una distribución normal. La significación estadística se definió con α = 0,05.
Resultados
Para caracterizar el funcionamiento del dispositivo (Figura 1A), a fin de determinar las tasas de captura de células con células de cáncer de PSMA-positivos. Se determinó la captura de células como una función de concentraciones variables mAb J591 (1,5-20 mg /ml) usando cizallamiento magnitudes de tensión representativa de los experimentados por las superficies funcionalizadas del dispositivo (0,08 a 0,24 Pa). Estos experimentos revelaron un aumento dependiente de la dosis en la celda capturar hasta la concentración de mAb de 10 mg /ml, que se utilizó para todos los experimentos posteriores (Figura 1B).
Descripción general del dispositivo (A) GEDI. Las agujas del reloj desde arriba a la izquierda: esquema del flujo de sangre a través del dispositivo, la imagen del dispositivo de silicio con junta de silicona, el esquema de funcionalización de la superficie. (B) un rendimiento de captura de la célula como una función de la tensión de cizallamiento y la concentración de anticuerpo. Las curvas de valoración para el anti-PSMA anticuerpo J591 en una geometría estandarizada indican la concentración de anticuerpos óptima para la captura de células.
Aunque el anticuerpo J591 es específico para células que expresan PSMA, la adhesión de leucocitos no específica ha sido problema importante para todas las técnicas de inmunocaptura basados en sangre. Para minimizar la adhesión de leucocitos, se realizó un estudio paramétrico para caracterizar tasa de colisiones (RCP; colisión por fila) como una función del tamaño de la celda y obstáculo offset. velocidades de colisión de un subconjunto de estas compensaciones exhiben un punto de corte afilado de acuerdo con el tamaño de celda, como se muestra en la Figura 2A; por lo tanto, hemos seleccionado un desplazamiento de obstáculos (7 micras) que genera un corte abrupto en el diámetro de la celda de 14 micras. La física que describen este punto de corte se ilustra mejor con los pathlines dependientes del tamaño de células (Figura 2A), que muestran cómo las células amplia experiencia repetida de colisión mientras que las células pequeñas independiente de los obstáculos y escapar de la captura. A continuación, prueba esta hipótesis mediante la medición de la captura de células de cáncer de próstata LNCaP (Figura 2B). En este experimento, se dispararon las células LNCaP fueron trasladados en dispositivos J591-funcionalizado que tenían un 7 micras offset (GEDI)
contra los que no se habían compensado (recta). Aunque estos dos dispositivos tienen la misma relación de área superficial a volumen, la geometría GEDI aumentado en gran medida la eficiencia de la captura de células, medida por células capturadas y enumerados normalizadas por el recuento de células de entrada
(A) Izquierda:. Top vista de reticulado de obstáculos de microfluidos con parámetros geométricos de la matriz. Δ = obstáculo compensado. Λ = separación obstáculo en la dirección del flujo a granel. Γ = separación obstáculo en la dirección ortogonal al flujo a granel. 2
r = diámetro
obstáculo. Líneas de corriente (gris) denotan el flujo de fluido. Pathlines (varios colores) denotan trayectorias de células de diferentes diámetros. También se definen los parámetros obstáculo matriz de separación y orientación. Derecha: La tasa de colisiones de la pared celular para las células que viajan a través de la matriz es una fuerte función del parámetro de desplazamiento de la matriz; la metodología de diseño GEDI implica el uso de un parámetro de desviación que conduce a tasas de colisión dependientes del tamaño. Los resultados predichos para el flujo a través de la geometría de la izquierda se muestra a la derecha por la línea continua; los cuatro tamaños específicos de células conducen a resultados indicados por los cuatro puntos de colores en este gráfico. Otras disposiciones geométricas conducen a diferentes resultados, que se muestran a la derecha en las líneas de puntos y trazos. (B) matrices rectas o matrices con desplazamientos pequeños (cajas de oro) conducen a una menor eficiencia de captura (izquierda) y la independencia de tamaño (a la derecha). compensaciones cuidadosamente elegidas (cajas magenta) conducen a altas tasas de captura (izquierda) y la dependencia de tamaño (a la derecha). Las tasas de captura de la izquierda se comparan GEDI (offset-7 micras) y recto (sin desplazamiento) el rendimiento geometría, medida por la eficiencia de captura de LNCaP en dispositivos J591-funcionalizado. Precios a la derecha describen tasas de colisión simulados en estas geometrías. Ambos resultados experimentales tienen la misma relación de área superficial a volumen. (C) Los dispositivos con la misma relación de superficie a volumen de dar resultados muy diferentes: arrays rectas conducen a colisiones que disminuyen a medida que la sangre se desplaza a través del dispositivo; arrays GEDI conducen a colisiones que aumentan con el viaje a través del dispositivo.
Debido a la dependencia de la trayectoria de células en el diámetro celular, las tasas de colisión son una función complicada de ambos parámetros diámetro de las células y de la matriz, tales como desplazamientos de fila . La tasa de colisión por fila (RCP) es una función fuerte de la fila offset, discontinuidades que exhiben, la dependencia de tamaño, y los efectos de inicio relacionados con el tamaño de la matriz finito (Figura 2C). La gran diferencia entre el rendimiento de los diferentes diseños es causada por la desviación de geometrías elegido mal partículas-en, la desviación hace que las células de desviar a las líneas de corriente que no entran en la proximidad de obstáculos posteriores, mientras que las geometrías en bien elegidas, las causas de desviación células para desviar sobre líneas de corriente que no entran en la proximidad de obstáculos posteriores. Así, la tasa de colisión aumenta a medida que las células proceden a través del dispositivo para el diseño GEDI, y disminuye para los diseños de mal elegidas como matrices rectas (Figura 2C). Este corte permite al usuario identificar un punto de corte entre hematocytes (& lt; 14 micras) y la población de células que experimentará máximos colisiones (& gt; 15 micras).
captura de células, formación de imágenes, y el recuento de CTC desde metastásico pacientes con cáncer de próstata
a continuación, se utiliza el dispositivo GEDI para capturar y caracterizar las células tumorales circulantes (CTC) de la sangre de pacientes con CRPC metastático. fue trasladado Un ml de sangre periférica a través del dispositivo, las células capturadas se fijaron y se inmunotiñeron para PSMA, CD45, EpCAM y DAPI, y las células capturadas se analizaron por microscopía confocal. CTC se definieron como células CD45- /intacto, nucleada, PSMA +. Los ejemplos representativos de CTC y los leucocitos se muestran en la Figura 3A. Curiosamente, las células PSMA + tenían tinción EpCAM variable, desde muy positivo a negativo a débil en términos de intensidad de fluorescencia EpCAM. En un subgrupo de pacientes, su cuantificación el porcentaje de CTC capturados-PSMA que eran EpCAM positivo. Se observó que 40 a 70% de CTC capturados-GEDI fueron positivos para ambos marcadores, con una mediana de 60% (datos no mostrados). Los controles para el rendimiento del anticuerpo se incluyeron en cada experimento usando dos líneas celulares de cáncer de próstata que expresan diferentes niveles de PSMA y EpCAM (C4-2: PSMA + /EpCAM + /CD45 y PC3: PSMA- /EpCAM- /CD45) y células CD45 + de la leucemia línea U937 (Figura S1A)
.
(A) imágenes representativas de las células tumorales capturados con el dispositivo GEDI de 1 ml de sangre de pacientes con cáncer de próstata en circulación. CTC se proyecta sobre el dispositivo y se identifican siguiendo inmunotinción con DAPI, PSMA, CD45, y EpCAM. Las células intactas, nucleadas que son PSMA + /CD45- son identificados como los CTC. Los leucocitos son identificados como DAPI + CD45 + /PSMA- /(fila de abajo, flecha). Tenga en cuenta la heterogeneidad de la expresión de EpCAM en el PSMA + población celular (filas superior e inferior, EpCAM-; fila del medio, EpCAM +). Barra de escala: 10 micras. (B) específica de la enfermedad de captura GEDI de los CTC. CTC enumeración (CTC /ml) se realizó a través de la sangre de donantes sanos (mediana = 3) y pacientes CRPC (mediana = 54). (P & lt; 0,001; Wilcoxon) (C) Comparación de la CTC enumeración entre GEDI o basadas en la captura y basada en CellSearch®. Esta comparación se realizó utilizando el mismo día de las extracciones de sangre de 25 pacientes CRPC individuales. * Indica que la enumeración basada en CellSearch se realizó 1 semana antes del enumeración basada en GEDI; ∉ indica un mismo paciente, cuya sangre fue dibujada en dos puntos de tiempo separados tres meses de separación (extracción de sangre no se produjeron 14 3 meses después de la extracción de sangre no 19);#Indica un mismo paciente, cuya sangre fue dibujada en dos puntos de tiempo independientes 1 año de diferencia (extracción de sangre no 22 1 Se ha producido un año antes de la sangre no consumirá 23).
Hemos procesado de sangre obtenidas de 10 donantes sanos (controles ) y 30 pacientes con carcinoma metastásico CRPC usando el dispositivo GEDI. La mediana del número de CTC /ml detectados fue de 3 (intervalo de 0 a 22) y 54 (rango de 0 a 1200), respectivamente (p & lt; 0,001; Figura 3B). A continuación, se realizó una comparación directa de la captura y el recuento de CTC mediante la comparación del microdispositivo GEDI con el CellSearch® prueba CTC basado en EpCAM aprobado por la FDA en la sangre el mismo día empates en 25 pacientes CRPC (Figura 3C). Hemos detectado un aumento de 2 a 400 veces en el número de CTC /ml reportados con el GEDI microdispositivo con relación a la prueba CellSearch CTC ® (Figura 3C;
p
& lt; 0,0001, calculado con la prueba de Wilcoxon), y una correlación débil (
r
= 0,44; valores atípicos eliminado con la restricción de la distancia de Cook) entre los recuentos de CTC y GEDI CellSearch® (Figura S2)
caracterización molecular de células capturadas: la detección de una sola. punto de mutación en el receptor de andrógenos y la expresión de la fusión TMPRSS2-ERG en las células de punta y CTC
Para evaluar si se podría caracterizar molecularmente los CTC-GEDI capturado, se realizó la prueba de principio de experimentos en los que el cáncer de próstata las células se enriquecieron en 1 ml de sangre de un donante sano, capturada por el dispositivo y se analizaron para la presencia de receptor de andrógenos (AR) mutaciones puntuales o expresión de TMPRSS2: proteína de fusión gen ERG. Para detectar la T868A (ACT-GCT) único punto de mutación en el dominio de unión a ligando-AR [19], se añadieron 50 C4-2 células en 1 ml de sangre de donantes sanos volado a través del dispositivo Gedi, y el ARN fue extraído por lisis directa en el dispositivo seguida de la secuenciación de ADNc (Figura 4A). En paralelo, la secuenciación se realizó en ARN extraído de 1 ml del mismo donante de sangre procesada de manera similar (control negativo) y en el ARN extraído de 50 C4-2 células (control positivo). Como era de esperar, la mutación T868A se detectó claramente en las células C4-2 (Figura 4A, panel superior y medio) pero ausente en el control negativo. La mutación puntual también se detectó en la muestra de sangre de punta, con el pico mutante (A) representa el 70% del nucleótido presente en esta posición y la de tipo salvaje (T) para 30%. Este resultado es consistente con la captura de células tasa de pureza ya se ha informado de 68% obtenido con células de cáncer de próstata marcados fluorescentemente se disparó en 1 ml de sangre periférica de un donante sano y volado a través del microdispositivo GEDI [10].
(A ) las células capturadas muestran una alta pureza, lo que permite la identificación de mutaciones puntuales. La T868A (ACT-GCT; Thr-Ala) Ar-único punto de mutación se detecta a partir de ARN extraído de 50 C4-2 células enriquecida en 1 ml de sangre de donantes sanos y capturado por el dispositivo GEDI (tercera fila, flecha). resultados de la secuenciación de 1 ml de sangre del mismo donante sano (fila superior) o de 50 C4-2 células en cultivo (fila central) también se representan. (B) El TMPRSS2: ERG proteína de fusión se detecta en las CTC GEDI-capturada de un paciente CRPC. CTC capturados-PSMA se tiñeron en el dispositivo con un anticuerpo anti-ERG. Ejemplos representativos de tres PSMA + /CD45- CTC se muestran, dos de los cuales son positivos para el ERG. Las barras de escala: 10 micras
Además, la presencia de la TMPRSS2:. ERG proteína de fusión puede ser detectado por inmunotinción con el anticuerpo monoclonal de conejo anti-ERG de anticuerpos [20] en el cáncer de próstata VCAP fusión-positivo células capturadas por el dispositivo y analizados por multiplex microscopía confocal (Figura S3). Un análisis similar en CTC GEDI-capturado de un paciente CRPC reveló la presencia de tanto las células negativas ERG positivo y ERG, mientras que CD45 + leucocitos fueron negativos para la proteína ERG (Figura S3, panel C), lo que indica la especificidad de la tinción de ERG para el cáncer de próstata derivadas de células
los ensayos funcionales: la agrupación. tubulina tras la exposición a los taxanos
Dada la alta pureza y la viabilidad de los CTC-GEDI capturado, próximo a prueba la hipótesis de que CTC quimiosensibilidad a taxanos siguiente
ex vivo
tratamiento en el microdispositivo GEDI podía predecir la respuesta clínica de un paciente a la terapia. Los taxanos (paclitaxel, docetaxel y cabazitaxel), que se utilizan comúnmente para tratar a los pacientes CRPC [21] - [23] acto mediante la estabilización de polímeros de microtúbulos y la inducción de la formación de haces de microtúbulos. la agrupación de microtúbulos es fácilmente detectable por tinción de inmunofluorescencia, debido a su mayor intensidad de fluorescencia, forma distinta y organización citoplásmica cuando se ve en la proyección máxima de la señal [24]. la agrupación de microtúbulos es el primer evento inducida por el tratamiento de taxano, dando como resultado la detención mitótica de aguas abajo y la muerte celular por apoptosis, y por lo tanto es un marcador adecuado de compromiso taxano fármaco-diana eficiente.
Para determinar primero la concentración óptima y la duración de
ex vivo
en el chip tratamiento de los pacientes derivados de CTC, que de pinchos 200 C4-2 células de 1 ml de sangre de un donante sano, procesa la muestra en el dispositivo Gedi, y luego se incubaron las células capturadas en el dispositivo durante 24 horas en medio que contenía 100 nM o 1 M de docetaxel (DTX) a 37 ° C. tratamiento con docetaxel con 100 nM resultó en haces de microtúbulos en células distintas C4-2 capturados (Figura 5A, panel medio de flechas), en contraste con la multa y red de microtúbulos intrincado de las células GEDI-capturado no tratados (Figura 5A, panel superior). El tratamiento con 1 mM DTX resultó en robusto agrupación de microtúbulos y la inducción de eventos apoptóticos (Figura 5A, inferiores puntas de flecha del panel). eventos apoptóticos fueron determinados por la presencia de núcleos brillantes y fragmentados acompañados por la pérdida de tinción de tubulina. Resultados similares se obtuvieron con 48 h, en el chip,
ex vivo
tratamiento (datos no mostrados). Estos resultados, junto con el hecho de que el AUC de la concentración sérica de docetaxel administrado a los pacientes 55 a 100 mg /m
2 de docetaxel es aproximadamente igual a 1.5-5 hrs mg /l [25], nos llevó a seleccionar un 24 h de tratamiento con 100 nM de un taxano (1,92 horas mg /l) con el fin de evaluar la
ex vivo
respuesta del CTC derivados del paciente.
tubulina respuesta al tratamiento con taxanos puede evaluarse en células GEDI-capturado. las células cancerosas (A) C4-2 próstata se enriquecieron a 200 células /ml en el conjunto de donantes sanos de sangre. a continuación, se hizo fluir un ml de sangre de punta en cada uno de tres dispositivos GEDI. Las células capturadas se incubaron en cada dispositivo a 37 ° C durante 24 horas, ya sea con control de DMSO (panel superior) o DTX 100 nM (panel central) o 1 M (panel inferior). Después del tratamiento de drogas, las células se fijaron y se procesaron para la tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra la tubulina y CD45. DAPI se utilizó como contratinción de ADN para evaluar la integridad nuclear. Tenga en cuenta la red de microtúbulos fino e intrincado en el control de DMSO (panel superior) y los haces de microtúbulos distintos en el DTX dispositivos (flechas, medio y paneles inferiores) tratada. No se observaron núcleos apoptóticos en concentraciones más altas DTX (punta de flecha, panel inferior). (B) CTC-GEDI capturado desde la sangre de un paciente CRPC se trataron
ex vivo
en el dispositivo GEDI con 100 nM DTX (panel superior) o la adición de 100 nM PTX (panel inferior) a 37 ° C durante 24 horas. Después del tratamiento de drogas se fijaron las células capturadas-PSMA y se procesaron para la tinción de inmunofluorescencia como en (A) con la adición de citoqueratina-18 como un marcador epitelial alternativa. En este paciente, la presencia de una red de microtúbulos imperturbable después del tratamiento DTX (panel superior) indica la falta de compromiso de drogas objetivo eficiente. Por el contrario, la adición de PTX dio lugar a la agrupación de microtúbulos (panel inferior).
Una serie de ensayos se han realizado para mostrar el potencial de ensayo funcional en el dispositivo descrito. En estos casos se trataron células capturadas en el dispositivo
ex vivo con DTX y /o PTX durante 24 horas (figuras 5B y S3). Estos ponen de manifiesto la capacidad de realizar ensayos funcionales sobre la participación de chip y ensayo de fármaco-diana en pacientes en el contexto de su respuesta clínica. La falta de respuesta, como se indica por la falta de evidencia de empaquetamiento de microtúbulos o núcleos apoptóticos siguiente
ex vivo
tratamiento DTX, se pudo observar en algunos pacientes. Figura S4C muestra un paciente que era no responde por el ensayo de microtúbulos, consistente con la falta de una respuesta clínica usando los criterios RECIST y PSAWG2 establecidos de este paciente. Esta respuesta era a menudo heterogénea dentro de la población de células capturado; Higo.