Extracto
cáncer colorrectal metastásico (CCRm) se basa en la separación de las células malignas agresivas desde el tumor primario en el torrente sanguíneo y, concordantemente, la presencia de estas células tumorales circulantes (CTC) se asocia con un pobre pronóstico. En este trabajo, se acercó a la caracterización molecular de CTC de pacientes con CCRm, con el objetivo de entender su biología y la mejora de su utilidad clínica en el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal. Para esto, immunoisolation a base de EpCAM de CTC se combinó con la amplificación transcriptoma conjunto y la hibridación en microarrays de ADNc. los datos de expresión génica de pacientes con CCRm, una vez que el fondo de immunoisolation no específica de un grupo de control había sido sustraído, resultaron en 410 genes que caracterizan la población CTC. Bioinformática se utilizaron para la interpretación biológica de los datos, revelando que CTC se caracterizan por genes relacionados con el movimiento celular y la adhesión, la muerte celular y la proliferación, y la señalización celular y la interacción. RTqPCR en una serie independiente de los pacientes y los controles CCRm se utilizó para la validación de un número de genes relacionados con las principales funciones celulares que caracterizan la población CTC. La comparación entre los carcinomas primarios y de pulmón y metástasis hepáticas involucrado aún más los CTC-genes en la promoción de la metástasis. Además, la correlación de la expresión de CTC-gen con parámetros clínicos demostró la detección y pronóstico importancia. En conclusión, la caracterización molecular de CTC de pacientes con CCRm y la identificación de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico representan un enfoque innovador y prometedor en el tratamiento clínico de este tipo de pacientes
Visto:. Barbazán J, Alonso-L Alconada , Muinelo-Romay L, M Vieito, Abalo A, Alonso-Nocelo M, et al. (2012) Caracterización molecular de células tumorales circulantes en cáncer colorrectal metastásico humano. PLoS ONE 7 (7): e40476. doi: 10.1371 /journal.pone.0040476
Editor: Xin Wei Wang, del Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Enero, 2012; Aceptado: June 8, 2012; Publicado: 10 de julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Barbazán et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente financiado por el Ministerio de Sanidad español (CP08 /00142) y el Programa de la Comisión Europea Fondo Europeo de Desarrollo regional (FEDER). No se recibió financiación externa adicional para este estudio. J. Barbazán y L. Alonso-Alconada son los destinatarios de las becas del Ministerio español de Educación y Ciencia y el Gobierno Vasco (España), respectivamente. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en los hombres y la segunda en mujeres, con más de 1,2 millones de nuevos casos de cáncer se estima que se han producido en todo el mundo en el año 2008 [1]. Clínicamente, la diseminación tumoral distante y la metástasis son los factores más importantes en el pronóstico: mientras que la etapa no invasiva carcinomas I presentan un 90% de cada cinco años de supervivencia, en estadio IV carcinomas con metástasis a distancia se correlaciona con una caída dramática a una tasa de supervivencia del 10% [2 ]. En consecuencia, las nuevas estrategias terapéuticas que mejoran la eficacia contra la enfermedad metastásica y biomarcadores precisos para el seguimiento de pacientes con CRC son los principales desafíos, junto con la detección precoz y el cribado en poblaciones de alto riesgo.
La diseminación del cáncer se basa en la separación de las células malignas agresivas del tumor primario en el torrente sanguíneo como fuente principal de la metástasis más [3]. Es ampliamente aceptado que las células tumorales circulantes (CTC) propia o adquirir la capacidad para evadir el sistema inmune del huésped y llegar a un órgano distante, por lo general el hígado en el CCR, donde establecen un sitio de crecimiento del tumor secundario en un proceso altamente ineficiente, sino dramática [4]. Concordantemente, la presencia de CTC en la sangre periférica se ha asociado con un mal pronóstico en diferentes tipos de cáncer, incluyendo CRC [5], [6]. Como fundadores presuntivos en la generación de metástasis, CTC se están convirtiendo en un campo de interés y la comprensión de su biología puede abrir nuevas perspectivas en oncología. En cuanto a su caracterización molecular, en los últimos años una serie de grupos han presentado datos de expresión se centraron en genes específicos o vías de señalización relacionadas con el cáncer para la mejora de la sensibilidad y especificidad de la detección de [7], [8]. Smirnov et al. abordado el perfilado de CTC a través de una mama diverso, de próstata y colorrectal metastásico perspectiva [9]. Además, los datos se está convirtiendo en la posibilidad de estudiar la biología y la utilidad para evaluar terapias dirigidas basado en el perfil genómico de CTC [10], [11].
Dentro de este escenario, definido por una eficacia limitada de las quimioterapias actuales en el tratamiento del CCR metastásico (CCRm) y CTC como actores clave en la gestión de la enfermedad metastásica, se acercó el perfil molecular específico de la población CTC. La combinación de inmunoaislamiento a base de EpCAM CTC y la extracción precisa de ARN a partir del número muy pequeño de CTC más amplificación transcriptoma conjunto, hizo posible hibridan ADNc a partir de la población CTC en microarrays de expresión de genes. Mediante la aplicación de este procedimiento a un grupo de pacientes con CCRm en comparación con el fondo de las células hematopoyéticas aisladas inespecíficos, la población de inmunoaisladas CTC fue perfilado específicamente. Además de la caracterización molecular de CTC para la comprensión de la biología de una fuente principal de metástasis en el CCR, estos datos proporcionan potenciales dianas terapéuticas y biomarcadores de diagnóstico /pronóstico.
Resultados
CTC immunoisolation y Molecular Profiling
Los procedimientos para CTC immunoisolation, la extracción de RNA y la amplificación de la hybridisa; en microarrays de ADNc se representan en la Figura 1A. Brevemente, CTC se inmunoaisladas de 7,5 ml de sangre periférica de pacientes en estadio IV CCRm (n = 6; Tabla S1). Las perlas magnéticas se usaron, que fueron recubiertas con un anticuerpo monoclonal hacia la célula epitelial humana molécula de adhesión (EpCAM), una molécula de superficie altamente expresado en los tumores del epitelio originados como CRC. ARN a partir de aislado CTC se purificó usando un kit diseñado específicamente para muestras de baja abundancia. En paralelo, el mismo protocolo se aplicó a muestras de sangre de donantes sanos (n = 3) para establecer la línea de base del fondo de inespecífica immunoisolation no CTC. Antes del análisis de la expresión génica, la presencia de aislado CTC se confirmó por la visualización de inmunofluorescencia directa usando un cóctel de anticuerpos contra citoqueratinas 8, 18 y 19 (Figura S1), y por una combinación de dos biomarcadores validado para la cuantificación exacta de CTC en CCRm pacientes (GAPDH-CD45; [12]) (U de Mann-Whitney, p-valor & lt; 0,05) (Figura 1B). Además, la exactitud de la metodología evaluada como la tasa de recuperación durante immunoisolation resultó en una mediana de 91,56% (Métodos S1).
(A) Representación esquemática del procedimiento utilizado para la caracterización molecular CTC. CTC se aislaron a partir de 7,5 ml de sangre periférica mediante separación inmunomagnética usando perlas magnéticas recubiertas con anti-EpCAM. Las células aisladas se sometieron a una extracción de ARN seguido de un proceso de amplificación toda transcriptoma (WTA). Finalmente cDNA amplificado se hibrida en Agilent arrays de expresión génica. (B) los niveles de GAPDH-CD45 en los controles y los pacientes con CCRm medidos por PCR en tiempo real. Las barras horizontales representan el valor medio de cada grupo (* p & lt; 0,05). (C) Análisis de correlación de Spearman entre los niveles de GAPDH-CD45 obtenidos tanto de los datos post-array y qPCR previa a la amplificación de la WTA. El análisis gráfico de salida (D) SAM que muestra la expresión génica diferencias entre el grupo de pacientes y controles. Los puntos resaltados corresponden a los genes con el aumento de los niveles estadísticamente significativos de expresión en el grupo de pacientes en comparación con el fondo de control, siendo considerado para caracterizar la población de CTC CCRm.
Con el fin de caracterizar la población de CTC aislado de pacientes con CCRm, la metodología descrita por González-Roca et al. fue adaptado, por precisa perfiles de expresión génica de las poblaciones de células muy pequeñas [13]. Básicamente, el ARN purificado se trató, además, con ADNasa I, amplificó utilizando el método de amplificación transcriptoma WTA2 conjunto, y ADN complementario se marcó y se hibridó a Agilent arrays de expresión (Figura 1A) (Expresión génica Omnibus, GEO número de acceso:. GSE31023). Después de la pre-procesamiento inicial de los datos en bruto, un promedio de 21.070 puntos se filtraron de acuerdo con los criterios descritos en Materiales & amp; Métodos, lo que representó el 47,35% de los puntos en la micromatriz con un máximo de 32.443 y un mínimo de 13.247. Tras la filtración, el coeficiente% de variación (CV) para las sondas replicados varió de 5,98% a 12,13%. La normalización dentro de cada microarray se llevó a cabo utilizando el método de loess, que asume que la mayoría de los genes en microarrays no se expresan diferencialmente en comparación con el control, por lo que la normalización entre todos los datos de microarrays se realizó por el método Aquantile implementado en el paquete Limma de la R estadística software. Este método garantiza que los valores de A (intensidades promedio) tenían la misma distribución empírica a través de microarrays dejando valores M (diario de los coeficientes) sin cambios. El análisis de correlación de los niveles de GAPDH RTqPCR-CD45 antes y después de la amplificación indica una linealidad robusto durante el proceso de amplificación transcriptoma (coeficiente de Spearman: 0,8667; valor de p & lt; 0,005). (Figura 1C)
El siguiente paso involucrado la expresión de genes de perfiles de CTC aisladas de pacientes con CCRm en el contexto de la contaminación de las células durante el immunoisolation. Para esto, normalizada de expresión génica de las intensidades de los pacientes con CCRm y del grupo de los controles se procesaron utilizando software MeV (MultiExperiment Viewer) (ver Métodos S1). Las señales obtenidas de los controles sanos fueron considerados como el fondo de las células sanguíneas aisladas de forma no específica, que eran principalmente linfocitos. La señal obtenida de pacientes con CCRm representaba la suma de estos antecedentes no específicos más el patrón de expresión de genes específicos de la CTC. Restando estos antecedentes, la contaminación de la población no-CTC se eliminó, y se consideraron los genes resultantes muestran expresión estadísticamente significativa para caracterizar la población de CTC CCRm pacientes (Figura 1A). Concordantemente, todos los genes importantes presentan expresión positiva en pacientes con CCRm a la resta de los antecedentes de donantes sanos (Figura 1D), que era consistente con la presencia de CTC sólo en las muestras CCRm. Esta estrategia condujo a la identificación de un conjunto final de 410 genes que son específicos de la población CTC (Tabla S2), con el análisis de agrupación jerárquica clara discriminación entre pacientes y controles (Figura 2A) CCRm
.
(A) La agrupación jerárquica de los genes expresados diferencialmente entre pacientes (n = 6) y controles (n = 3) (genes específicos CTC). validación (B) RTqPCR de once genes seleccionados a partir de datos de la matriz. diferencias de cambio de pliegue CD45-normalizada entre los pacientes con CCRm (n = 20) y controles sanos (n = 10) (barra gris) en el CTC fracción enriquecida (barras negras; *** p & lt; 0,0001). Es de destacar que no se observaron diferencias entre los pacientes con CCRm (n = 5) y controles (n = 5) en la fracción que queda después de CTC immunoisolation (barras blancas).
El análisis bioinformático con Ingenuity Pathway Analysis ( IPA) y GENECODIS (para el software de ontología de genes) sirven para interpretar la lista resultante de los genes que caracterizan a la población CTC. Las principales funciones celulares definidos por estos genes CTC-específicos estaban relacionados con el movimiento celular, la adhesión celular, la muerte celular y la proliferación, la señalización célula-célula y la interacción, y la reorganización del citoesqueleto (Figura S2A y C). Curiosamente, el análisis de IPA de las vías canónicas, que era representativo de estos genes, también puso de relieve una serie de vías de señalización conocidos implicados en la migración celular /invasión y la adhesión celular, como la proteína quinasa A, RhoA, integrinas, CIC, o moléculas de señalización citoesqueleto de actina (Figura S2 B). Por otra parte, el análisis de las interacciones gen-gen rindió redes biológicas que caracterizan a la población de pacientes con CCRm CTC. Entre ellos, el cáncer y el movimiento celular y la morfología se encontró que eran los principales eventos asociados con un fenotipo CTC, mientras que esta interpretación podría estar sesgado por la importante contribución de cáncer a bases de datos (Figura S3). Todos estos análisis apuntan a un equilibrio entre los genes que subyacen a la supervivencia celular, la interacción con el medio ambiente y el movimiento celular en los procesos biológicos fundamentales que deben converger en la población de CTC para el buen desarrollo de la metástasis en el CCR.
real-Time PCR cuantitativa de validación e identificación de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico
el siguiente paso fue la validación RTqPCR de once genes que presentan altas relaciones de log2 en pacientes con CCRm y una relevancia funcional de los procesos biológicos que caracteriza a la población en un CTC series independientes de pacientes y controles CCRm. La expresión específica de estos genes se evaluó mediante la comparación de las poblaciones de CTC de entre el grupo de pacientes con CCRm (n = 20) con el fondo de los controles sanos (n = 10), una vez que se han normalizado para CD45 como marcador de la inespecificidad durante CTC aislamiento. Estos genes incluyen APP, CLU y TIMP1, que están asociados con la muerte celular y la actividad anti-apoptótica; VCL, ITGB5, BMP6 y TGFß1, que son genes implicados en la migración celular y la invasión y la morfología celular; y TLN1, ITGB5, LIMS1, RSU1 y CD9, que están asociadas con la adhesión celular. Como se observa en la Figura 2B (barras negras), todos los genes candidatos seleccionados fueron validados en esta nueva serie de muestras por RTqPCR con diferencias significativas entre el grupo de pacientes y el grupo de controles (p-valor & lt; 0,0001).
Es importante destacar que, para garantizar que la expresión de los genes seleccionados era característico de CTC y no un artefacto debido a la variación de la expresión génica en linfocitos en pacientes con cáncer, su expresión se comparó en la fracción restante no aislada sobre CTC enriquecimiento en un conjunto de pacientes con CCRm (n = 5) y controles (n = 5). Como se muestra en la Figura 2B (barras blancas), no se encontraron diferencias entre los dos grupos para los once genes candidatos, reforzando su especificidad de la expresión en la población CTC. Cuando cinco muestras en la fracción CTC aislados fueron seleccionados al azar, niveles significativamente más altos se encontraron consistentemente en muestras CCRm, demostrando que la falta de diferencias entre los pacientes y los controles en la fracción no aislado no fue debido a la muestra artefactos de tamaño (datos no mostrados) .
a fin de evaluar la implicación de los genes candidatos en el potencial metastásico de CTC en el CCR, su expresión se comparó en una serie de carcinomas primarios (n = 14) y pulmón (n = 7) y el hígado ( n = 7) metástasis. Como se muestra en la Figura 3A, todos los genes seleccionados fueron hasta reguladas en las metástasis en comparación con las lesiones primarias, con siete de los once genes que presentan significación estadística. Entre ellos, CLU y TIMP1 presentan una regulación específica en la metástasis de hígado, lo que sugiere un posible papel de estos genes en la capacidad específica de tejido de cáncer colorrectal metastásico CTC para colonizar el hígado (Figura 3B). Además, tres de los once genes seleccionados demostraron un aumento significativo de la expresión en la parte delantera invasiva de los tumores primarios en comparación con el área superficial no invasiva emparejado, lo que sugiere un vínculo a la adquisición de un fenotipo agresivo (Figura 3C). Todos estos resultados validan la estrategia para molecularmente el perfil de la CTC en pacientes con CCRm, confirmando la presencia de la población CTC y el inmunoaislamiento eficiente de CTC en pacientes con CCRm, así como la capacidad para caracterizar específicamente estas células a nivel molecular.
(a) las diferencias de expresión génica entre las metástasis de pulmón e hígado de pacientes con CRC (n = 14) y los tumores primarios (n = 14) para los once genes validados. (B) Las diferencias en la expresión génica de CLU y TIMP1 entre pulmón (n = 7) y el hígado (n = 7) metástasis (M) en comparación con el tumor primario. (C) específica sobre regulación de TGFß1, TIMP1 y CLU en el frente invasivo de tumores primarios de CRC (n = 14) en comparación con la zona no invasiva (* p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001).
Finalmente, el perfil molecular de CTC debe dar lugar a la identificación de biomarcadores potencialmente fiables para la detección de la población de pacientes CTC CCRm. Para evaluar este punto, se evaluó la precisión de los genes RTqPCR validados en la detección de la enfermedad metastásica en la serie de pacientes y controles CCRm. Como se muestra en la Tabla 1, todos los genes validados presentó excelentes valores discriminantes en términos de AUROC (valores que van desde 0,94 hasta 1; valor de p & lt; 0,0001). Por otra parte, y con la excepción de CD9 y TLN1, los biomarcadores seleccionados demostraron un excelente comportamiento como predictores de la progresión de la enfermedad. Estos datos garantizan más estudios en grandes cohortes de pacientes para el uso de estos biomarcadores en el entorno clínico.
Discusión
El perfil molecular se emplea ampliamente como una poderosa estrategia para caracterizar los tipos específicos de los tumores, los subtipos específicos de carcinomas o eventos específicos asociados con la carcinogénesis. Además de contribuir a la comprensión de los eventos moleculares asociados a la génesis y progresión del cáncer, de perfiles de expresión génica ha conducido a la identificación de dianas terapéuticas y biomarcadores en un esfuerzo para mejorar la gestión de los pacientes de cáncer en el entorno clínico. En este trabajo, que tuvo como objetivo hacer frente con una población muy específica y atractiva de las células tumorales que están en el origen de la metástasis, las células tumorales circulantes (CTC). Una combinación de CTC immunoisolation, la extracción de RNA precisa de muy bajo número de células, la amplificación de todo el genoma y masiva de genes de perfiles de expresión para la caracterización e interpretación de la biología de la CTC en el cáncer colorrectal metastásico se presenta aquí. Para validar técnicamente esta estrategia, la elaboración de perfiles de CTC de pacientes con CCRm se acercó al restar el fondo de aislamiento no específica de un grupo de controles sanos. El siguiente reto es comparar el perfil de expresión de genes de la población CTC con las lesiones CRC primarias y con las metástasis evidentes, a fin de comprender mejor los mecanismos de adaptación de las células tumorales durante el proceso de metástasis y la diafonía con el medio ambiente. La sustracción del fondo de un grupo de controles también se considera que es más relevante que el fondo de los mismos pacientes con CCRm ya que requeriría dos ciclos de aislamiento CTC dentro de las mismas muestras, lo que representa una fuente significativa de artefactos técnicos. Las diferencias en el fondo no pueden excluirse debido a la enfermedad metastásica sistémica, aunque el análisis de la fracción restante después del aislamiento CTC no rinde las diferencias dentro de los genes seleccionados.
En cuanto inmunoaislamiento, y aunque enriquecimiento CTC con EpCAM anticuerpos -junto ha demostrado ser superior a otros métodos de citometría y un método fiable para la detección de CTC en pacientes con CCRm [14], este procedimiento de captura de CTC ha planteado algunas debate debido a la dependencia de esta técnica en la expresión de EpCAM. Inicialmente descrito hace 30 años como un antígeno dominante en tejido de carcinoma de colon humano, se supone que una disminución de expresión de marcadores epiteliales se produce durante la transición epitelial a mesenquimal (EMT) asociados con la invasión del tumor [15]. Es importante destacar que EpCAM es aparentemente necesario para mantener atributos de células de cáncer distintos y, potencialmente, el fenotipo de células madre del cáncer [16]. CD133 + células, actualmente uno de los mejores marcadores para la caracterización de las células madre del cáncer de colon y un marcador pronóstico independiente que se correlaciona con la supervivencia bajo, son positivas para EpCAM [17]. Del mismo modo, los anticuerpos contra EpCAM pueden orientar eficazmente el tumor células iniciadoras de colon [18], que confiere un valor considerable para la población CTC-EpCAM aislado en términos de intervención terapéutica. Los datos presentados aquí demuestran de manera concluyente el aislamiento efectivo de CTC de pacientes con CCRm.
Un logro principal de este trabajo fue la traducción del método descrito por González-Roca et al. para el perfil de expresión precisa de poblaciones muy pequeñas de células [13], en una población de células clínicamente relevantes. amplificación transcriptoma Whole permitió la caracterización de la población CTC aislado de pacientes con CRC metastásicos en el nivel molecular. Hasta la fecha, la mayoría de estudios han descrito los niveles de expresión de un número limitado de genes en diferentes poblaciones de CTC, principalmente para fines de detección de [19], [20]. El enfoque utilizado aquí permite que el perfil molecular de CTC de CCRm, y su definición como una población de células con capacidades migratorias y adhesivas presuntos. Esto es consistente con una subpoblación de células tumorales que deben adquirir un fenotipo que permite la disociación agresiva e invasiva de la lesión primaria, lo que lleva a la invasión del estroma circundante y su intravasación y la supervivencia en el flujo de sangre. Además, estas células también pueden extravasación e implantar con éxito en el objetivo de tejido distante para generar una micrometástasis [19]. La lista de genes que caracterizan fenotípicamente la población de pacientes con CCRm CTC incluye candidatos relacionados con todas las funciones descritas anteriormente (Figura 4), lo que justifica más estudios para definir su implicación en el comportamiento metastásico de la población CTC en el CCR. Los genes tales como VCL, ITGB5, BMP6 o TGFß1 se han asociado con la adquisición de un fenotipo invasivo [8], [21], [22], en parte a través de la EMT. Del mismo modo, TLN1, APP, CD9, LIMS1 y RSU1 se han relacionado con la adhesión y la migración, con CD9 la modulación de la localización de TLN1, un regulador crítico de la activación de la integrina, a adhesiones focales [23], o LIMS1 estando asociado con la adhesión celular y la integrina de señalización, y, en particular, con RSU1 y de la vía Ras durante la migración celular [24]. Un paso clave en el proceso de difusión del cáncer es la capacidad de migrar y avanzar hacia intravasate y capilares sanguíneos cercanos. Una vez en la circulación, CTC debe superar el sistema inmune del huésped mediante la mejora de su resistencia a la apoptosis entre otros mecanismos. Los genes como TIMP1 y CLU son moléculas clave relacionadas con este proceso [25]. Curiosamente, TIMP1 se ha relacionado con el proceso de resistencia anoikis en diferentes modelos de cáncer, lo que permite la evasión de la muerte celular en ausencia de sustrato de anclaje [26]. Al llegar a un órgano diana, CTC debe ser capaz de extravasación y formar colonias, y CD9 ha sido descrito como crítico para el proceso de implantación y micrometástasis formación asociado con atributos de células madre, que se relaciona a estos eventos [27]. Curiosamente, una superposición significativa se encontró con una firma metástasis hepática específica en el CCR [28] (véase la Tabla S4), lo que sugiere una implicación activa en el potencial tropismo y micrometástasis de CTC a este órgano en el CCR. En particular, y de acuerdo con la correlación de la expresión de TIMP1 en CTC y la metástasis de hígado, se ha descrito como un regulador del microambiente hígado, el aumento de la susceptibilidad de este órgano a las células tumorales [29]. En general, la participación de los genes seleccionados en la capacidad de metástasis de CTC también ha sido reforzada por su regulación en metástasis de pulmón e hígado en comparación con los carcinomas colorrectales primarios.
in vitro
cultivos primarios de CTC y
in vivo
modelos de CTC en el CCR definitivamente proporcionar a los investigadores con pruebas sólidas para validar el papel de estos genes en la capacidad de CTC para generar micrometástasis, y para definir estrategias dirigidas específicamente a esta población de CTC metastásico.
de los microarrays de datos resultante, algunos de los genes más relevantes se muestran en relación con ciertas características del proceso de la metástasis.
del mismo modo, en términos de biomarcadores para el manejo de pacientes con CCRm, el perfilado molecular de CTC en pacientes con CCRm rindió herramientas valiosas para la detección y cuantificación de la enfermedad metastásica, así como para la predicción de la progresión de la enfermedad. La alta especificidad y sensibilidad demostrada por los genes descritos anteriormente validados en la población de pacientes CTC CCRm justifican el estudio de estos biomarcadores en la evaluación de las respuestas terapéuticas o en la selección de pacientes para terapias dirigidas.
En conclusión, este estudio se describe, a nuestro entender, el primer perfil molecular específico de CTC aisladas de pacientes con CCRm. Este análisis de expresión génica se aplicó a la caracterización de esta población específica con presunta adhesivo, capacidades migratorias e invasivos, así como una respuesta modulada a la muerte celular para la finalización con éxito del proceso de metástasis. Por otra parte, la identificación de estrategias terapéuticas dirigidas específicamente a la población CTC debería mejorar la eficacia en la erradicación y prevención de la CRC metástasis, mientras que un arsenal de valiosos marcadores altamente específicos y sensibles debería influir en la gestión y el seguimiento de los pacientes con CCR metastásico.
Materiales y Métodos
los pacientes
Todos los participantes firmaron un consentimiento informado aprobado específicamente para este estudio por el Comité ético del Complexo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (código de aprobación: 2009/289). Los criterios de inclusión para los pacientes con CCRm fueron la presencia de cáncer colorrectal metastásico mensurable y un estado funcional del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) no superior a 2. Controles sanos con una ausencia de un episodio previo contra el cáncer y una edad coincidente con los pacientes fueron seleccionados. La información detallada acerca de los pacientes incluidos en el análisis está disponible en la Tabla S1.
CTC immunoisolation
CTC se aislaron utilizando el kit Cellection ™ epitelial Enrich (Invitrogen, Dynal) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 7,5 ml de sangre de pacientes con CCRm y controles sanos se incubaron durante 30 minutos a 4 ° C con 100 l de perlas magnéticas. Después del lavado, CTC acoplado a las perlas magnéticas se resuspendieron directamente en 100 l de solución de RNAlater® (Ambion) y almacenados a -80 ° C hasta su procesamiento para la extracción de RNA.
Expresión Génica Análisis
el ARN total de CTC se extrajo con el ARN viral mini kit QIAmp (Qiagen), diseñado específicamente para muestras muy baja celularidad. ARN purificado fue sometido al lado de una reacción de amplificación transcriptoma conjunto (WTA2, Sigma Aldrich), Cy3 etiquetados y hibridizada en Agilent 4 × 44 k arrays de expresión génica. El procesamiento de señales y la filtración, así como el análisis de datos de expresión génica se describen en detalle en el material suplementario. La expresión génica de datos es accesible en el NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) de bases de datos (número de acceso: GSE31023).
Real-Time PCR cuantitativa Validación
validación
RTqPCR se realizó en un conjunto independiente de 10 y 20 controles sanos metastásico en estadio IV pacientes con cáncer colorrectal (ver Tabla S1). CTC se aislaron como se describe, y el ARN se purificó con un vehículo RNA para mejorar el rendimiento y la estabilidad. Se sintetizó ADNc mediante el uso de la química SuperScriptIII (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para optimizar aún más la sensibilidad de la detección, se realizó un paso de preamplificación utilizando el kit TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) con 14 ciclos de reacción. preamplificadas productos se sometieron a amplificación por PCR TaqMan en tiempo real durante once genes candidatos (véase el cuadro S3 para los detalles del ensayo).
Además, se evaluó por RTqPCR los niveles de expresión de los genes candidatos en la fracción celular restante CTC sobre immunoisolation, en 5 pacientes con CCRm y 5 controles sanos. Brevemente, se realizó una lisis de glóbulos rojos en la fracción restante después de la incubación EpCAM inmune-talón y aislamiento CTC, y el ARN se purificó a partir de los restantes células sanguíneas nucleadas con el kit RNeasy mini (Qiagen). cantidad y pureza del ARN se evaluaron mediante la medición NanoDrop, cDNA se sintetizó usando transcriptasa inversa MuLV sistema (Applied Biosystems) y TaqMan® qPCR se realizó para los once genes candidatos.
valores de expresión para cada gen se normalizaron a CD45 como un marcador de aislamiento no específica. Doblar las diferencias de cambio entre los pacientes y los controles fueron analizados estadísticamente con el software GraphPad Prism, aplicando el t-test no paramétrico de Mann-Whitney y teniendo en cuenta un valor de p & lt; 0,05 como significativo Análisis FODA
Expresión génica en tumores primarios. y metástasis
carcinomas colorrectales primarios (n = 14) y metástasis (metástasis hepática, n = 7; metástasis pulmonares, n = 7) fueron procesadas por el Departamento del Complexo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela Patología. La zona no invasiva superficial y el área invasivo profundo de los tumores primarios fueron disecados macroscópicamente, asegurando porcentajes de tumores similares. Se purificó ARN (reactivo TRIZOL, Invitrogen; kit RNeasy, Qiagen), se sintetizó ADNc (MuLV transcriptasa inversa, Applied Biosystems), y la expresión de genes se evaluó (TaqMan RTqPCR, Applied Biosystems). Los datos se representan como factor de cambio en relación con la expresión en el área superficial no invasiva. GAPDH se utilizó como control de carga. Se utilizó no paramétrica t-test de Mann-Whitney para considerar la significación estadística de p-valor. & lt; 0,05
El área bajo la curva ROC (curva ROC) y el análisis de Kaplan-Meier
La precisión de los genes de once candidatos como biomarcadores para el diagnóstico se evaluó mediante curvas ROC, mientras que las curvas de Kaplan-Meier se construyeron para su evaluación como marcadores de pronóstico. Los valores de corte se establecieron como los valores de ajuste óptimo para cada marcador. Los pacientes tiempos de supervivencia libre de progresión se establecieron como el tiempo transcurrido entre el inicio de la quimioterapia y la línea de progresión de la enfermedad evaluada por imágenes, o paciente muerto por cualquier causa.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Imágenes representativas de las células epiteliales aisladas de la sangre del paciente CCRm.