Extracto
Antecedentes y propósito
Para entender los mecanismos implicados en la fuerte efecto letal de irradiación de haz de iones de carbono en las células cancerosas con
TP53
tumorales deficiencias genes supresores .
Materiales y Métodos
respuestas al daño del ADN después de haz de iones de carbono o irradiación con rayos X en líneas celulares de cáncer colorrectal HCT116 isogénicas con y sin
TP53 gratis (p53
+ /+ y p53
- /-, respectivamente) fueron analizados de la siguiente manera: la supervivencia celular mediante el ensayo clonogénico, modos de muerte celular por observación morfológica de núcleos teñidos con DAPI, ADN doble filamento se rompe (DSBs) por inmunotinción de fosforilados H2AX (γH2AX), y el ciclo celular por citometría de flujo y la inmunotinción de la histona H3 fosforilada-Ser10
resultados
la p53
-. /- células fueron más resistentes que el p53
+ /+ células a irradiación con rayos X, mientras que la sensibilidad de la p53
+ /+ y p53
- /- las células a irradiación con haz de iones de carbono fueron comparables. De rayos X y irradiaciones de haz de iones de carbono predominantemente indujeron apoptosis de la p53
células + /+ pero no la p53
- /- células. En el p53
- /-. Células, la irradiación de iones de carbono haz, pero no de irradiación de rayos X, notablemente inducida por la catástrofe mitótica que estaba asociado con la entrada en mitosis prematura de albergar las DSB retenidas largo a las 24 h después de la irradiación
Conclusiones
inducción eficiente de la catástrofe mitótica en las células deficientes en p53 resistentes a la apoptosis implica un fuerte efecto de destrucción celular del cáncer de irradiación de haz de iones de carbono que es independiente del estado de p53, lo que sugiere su ventaja biológica sobre el tratamiento de rayos X
Visto:. Amornwichet N, T Oike, Shibata A, Ogiwara H, N Tsuchiya, Yamauchi M, et al. Células de Cáncer (2014) carbono-Ion Beam irradiación Muertes Rayos X-Resistente p53 nulo mediante la inducción de mitótico catástrofe. PLoS ONE 9 (12): e115121. doi: 10.1371 /journal.pone.0115121
Editor: Peiwen Fei, Universidad de Hawai Centro de Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Julio, 2014; Aceptado: 18 Noviembre 2014; Publicado: December 22, 2014
Derechos de Autor © 2014 Amornwichet et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas-en-Ayudas del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón para los programas de Las principales escuelas de Graduados, Desarrollo de líderes mundiales en el Heavy Ion Terapéutica e Ingeniería, y de Investigador joven estratégica Programa de visitas al extranjero para acelerar la circulación cerebral, y la investigación científica en áreas innovadoras (22131006). Este trabajo también fue apoyado por becas-en-Aid de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia para Jóvenes Científicos (B) KAKENHI [10643471]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
radioterapia carbono-ion ha estado provocando interés en el campo de la terapia del cáncer. haces de iones de carbono tienen propiedades ventajosas sobre de rayos X; una distribución de dosis superiores asociado a la penumbra agudo y el pico de Bragg, y un fuerte efecto de destrucción celular [1], [2]. El principal resultado clínico prometedor de la radioterapia de iones de carbono es el de superar la resistencia terapéutica de las células cancerosas a la radioterapia de rayos X. Por ejemplo, un estudio reciente en el que se utiliza la radioterapia de iones de carbono para tratar a los pacientes con cáncer de recto informó un control a los 5 años local y las tasas de supervivencia global de 97% y 51% para los casos recurrentes postoperatorias [3]. Esta tasa es superior a las tasas de los 5 años de supervivencia global (0-40%) que por lo general se consiguen mediante la radioterapia convencional de rayos X o la resección quirúrgica [3], [4]. Sin embargo, la base biológica para el fuerte efecto de destrucción celular de irradiación de haz de iones de carbono en los tumores de rayos-X resistente no se ha elucidado completamente.
aberraciones genéticos contribuyen a la resistencia de rayos X de las células cancerosas [ ,,,0],5], [6]. Inactivación de las mutaciones en el gen supresor de tumores
TP53
son representativos de la resistencia del tumor, y estas aberraciones se asocian con mal pronóstico después de la radioterapia de rayos X [7], [8]. La proteína p53 desempeña múltiples funciones en la respuesta al daño del ADN (DDR) para la irradiación de rayos X, incluyendo la regulación de las vías de la muerte celular y punto de control [9]. La inducción de apoptosis por p53 es un factor clave que afecta a la sensibilidad de las células cancerosas a la radiación de rayos X. Varios pre-clínicos y clínicos estudios han demostrado que
TP53
mutaciones se asocian con la resistencia de las células cancerosas a la terapia de irradiación con rayos X [7], [10], [11].
estudios anteriores mostraron que la irradiación de haz de iones de carbono efectivamente mata las células cancerosas p53 mutante de rayos X resistente [12--15]. Aunque los mecanismos implicados en este proceso fueron examinados en estos estudios, los resultados fueron inconsistentes. Las inconsistencias son probablemente atribuible al hecho de que cada estudio se centró en sólo unos pocos aspectos de la DDR (tales como la apoptosis o la respuesta del ciclo celular) [12] - [15], y cada uno se utilizan líneas celulares de cáncer con diferentes antecedentes genéticos; Por lo tanto, los efectos de las aberraciones en genes distintos de
TP53
puede haber ocultado los resultados [12], [13]. A continuación, para aclarar los mecanismos que subyacen a la fuerte efecto letal de irradiación de haz de iones de carbono sobre la irradiación resistente de rayos X las células cancerosas con
TP53
aberraciones, hemos realizado un estudio exhaustivo de los múltiples aspectos de la RDA utilizando un conjunto de las células cancerosas humanas isogénicas que diferían sólo en su estado de p53.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
células HCT116 de cáncer colorrectal humano que albergan p53 de tipo salvaje (p53
+ /+) y su derivado de p53 nula isogénica (p53
- /-) fueron proporcionados por el Dr. B. Vogelstein, de la Universidad Johns Hopkins. HCT116 p53
+ /+ células tienen puntos de control de daños de ADN intactas [16]. la expresión de p53, y los efectos de los rayos X y de iones de carbono irradiación de haz sobre la expresión de p53 en p53
+ /+ y p53
- /- las células, se examinó mediante inmunotransferencia con anticuerpos contra p53 (Santa Cruz) y β-actina (control de carga, Señalización celular Tecnología) (S1a Fig.). No hubo diferencia significativa en la duplicación de la población de tiempo entre las dos líneas celulares (Fig. S1b).
cáncer de colon humano (RKO, LS123, y WiDr) las células, el cáncer de pulmón humano de células (H1299), y humano (SAOS-2) células de osteosarcoma se adquirieron de ATCC. RKO células albergan p53 de tipo salvaje. células LS123 y WiDr albergan una mutación sin sentido en p53 en R175H y R273H, respectivamente. células H1299 y SAOS-2 son p53 nulo. H1299 células que expresan de forma estable una mutación de sentido erróneo p53 (R175H, R273H, R249S o R280K) se establecieron como se ha descrito anteriormente [17]. Todas las células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal 10%.
diploide humano normal hTERT-inmortalizado fibroblastos de prepucio (BJ-hTERT) que alberga p53 de tipo salvaje se adquirieron de Clontech. Las células que expresan hTERT BJ-shRNA contra EGFP (BJ-hTERT-WT; control). Se establecieron o p53 (BJ-hTERT-shp53) como se ha descrito anteriormente [18], y se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle
La irradiación
irradiación de rayos X se realizó usando un Faxitron RX-650 fuente de radiación (100 kVp, 1,14 Gy /min; Faxitron Biópticos). irradiación con haz de Carbon-ion se realizó en la Universidad de Gunma pesado Ion Medical Center usando las mismas especificaciones de haz que se utilizan en entornos clínicos (290 MeV /nucleon y una transferencia de energía lineal media (LET) en el centro de un 6 cm de expansión de salida Bragg máximo de aproximadamente 50 keV /m). haces de iones de carbono se entregaron en una dirección vertical, de manera que las células en placas de cultivo pueden recibir la dosis de manera uniforme.
supervivencia Clonigénicas ensayo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se expusieron (o no ) a los rayos X o irradiación con haz de iones de carbono. Después de la incubación durante otros 10 días, las células se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta. Se contaron las colonias de al menos 50 células. La fracción superviviente se normalizó a los controles correspondientes. La dosis que dio lugar a una fracción de supervivencia de 10% (D
10) se calculó utilizando el modelo lineal-cuadrática, como se describió anteriormente [19].
evaluaciones muerte celular
Las células se hicieron crecer en cubreobjetos de vidrio, expuestas (o no) a los rayos X o irradiación con haz de iones de carbono, y después se tiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI), como se describe anteriormente [20]. Las imágenes confocales se recogieron usando un microscopio BX51 (Olympus) equipado con una cámara CCD (VB-7000; Keyence). La apoptosis se determina en base a la morfología de los núcleos, incluyendo la presencia de cuerpos apoptóticos, condensación nuclear y la fragmentación [21]. Las células que contienen los núcleos con dos o más lóbulos distintos se puntuaron como positivas para la catástrofe mitótica [20], [22]. Las células que contienen los núcleos que muestran focos heterocromáticos senescencia asociado se puntuaron como positivas para la senescencia [23]. Los porcentajes de células en proceso de apoptosis, la catástrofe mitótica o senescencia se cuantificaron contando al menos 300 células para cada condición experimental.
análisis del ciclo celular
Las células expuestas (o no) a los rayos X o irradiación de haz de iones de carbono se recogieron en los puntos de tiempo indicados, se fijaron con etanol, se tiñeron con yoduro de propidio en presencia de RNasa, y después se analizó mediante citometría de flujo, tal como se describe anteriormente [19].
inmunotinción
células expuestas (o no) a los rayos X o de iones de carbono irradiación de haz se tiñeron con anticuerpos contra fosforilados-Ser139 histona H2AX (γH2AX; Millipore) o la histona H3 Ser10-fosforilada (pH 3; Millipore), como se describió previamente [24]. γH2AX focos por núcleo se anotó en imágenes 2D secuenciales capturados desde múltiples planos focales. Se evaluaron al menos 500 células para cada condición experimental.
El análisis estadístico
Los experimentos se realizaron por triplicado, al menos, a no ser que se indique lo contrario. Diferencias estadísticamente significativas se determinaron por
t-pruebas utilizando
StatMateIII de Student no pareada ver. 3.17 software (ATM).
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
vigas de carbono-ion tienen una actividad que mata células de cáncer más potente que los rayos X, independientemente del estado de p53
La sensibilidad de p53
+ /+ y p53
- /- células HCT116 a los rayos X y la radiación de haz de iones de carbono se evaluaron mediante ensayos de supervivencia clonigénicas (Fig. 1). Como era de esperar sobre la base de los resultados de estudios anteriores [14], [15], p53
- /- las células eran más resistentes a la irradiación de rayos X de p53
+ /+ células; los D
10 valores para estas dos líneas celulares fueron 6,8 Gy y 3,8 Gy, respectivamente. Por el contrario, las sensibilidades de p53
+ /+ y p53
- /- células a irradiación con haz de iones de carbono fueron comparables; los D
10 valores para estas líneas celulares eran 1,7 Gy y 1,9 Gy, respectivamente. Por lo tanto, la eficacia biológica relativa de irradiación de haz de iones de carbono a la irradiación de rayos X en D
10 era 2,2 en p53
+ /+ y las células 3.6 en p53
- /- células. Estos datos indican que la irradiación de haz de iones de carbono mata efectivamente X-ray resistente
p53-null
células cancerosas.
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos, se incubaron durante la noche, y luego expuestos a de rayos X o irradiación con haz de iones de carbono. Después de la incubación durante 10 días, se fijaron las células, se tiñeron y se contaron. La fracción superviviente se normalizó con el valor de los controles correspondientes. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. C-litio, carbono-litio.
Las aberraciones en p53 cambiar el modo de la muerte de las células cancerosas inducida por irradiación de la apoptosis mitótico catástrofe
Para explorar los mecanismos que subyacen a la p53 estado- actividad que mata las células independiente de irradiación de haz de iones de carbono, los modos de muerte celular inducida por rayos X o irradiación con haz de iones de carbono se evaluaron (. Figs 2, 3). p53
+ /+ y p53
- /- células fueron irradiados con dosis de haces de rayos X o de iones de carbono que eran similares a la D
10 para p53
+ células /+ (X ray, 4 Gy; haces de iones de carbono, 1,5 Gy). La apoptosis, la catástrofe mitótica y la senescencia se determinaron mediante el examen de las morfologías característicos de núcleos teñidos con DAPI (figura 2a-c.) [20] - [23]. En p53
células + /+, la apoptosis era el modo dominante de la muerte celular inducida por rayos X y del haz de irradiación de iones de carbono (Figs. 2d, f, 3a). Por el contrario, p53
- /- células fueron menos susceptibles a la apoptosis causada por ambos tipos de irradiación (Figs 2e, g, 3b.). Curiosamente, en p53
- /- (. Figs 2g, 3b) de las células, de iones de carbono irradiación con haz mitótico inducida catástrofe más evidentemente que la irradiación de rayos X. A dosis más alta de irradiación equivalente de rayos X a la D
10 (6,8 Gy) para p53
- /- células inducidas un nivel similar de la catástrofe mitótica a la inducida por irradiación de haz de iones de carbono a 1,5 Gy (S2 Higo.). La inducción de la senescencia no fue evidente en todas las condiciones experimentales (Fig. 2). Este resultado se confirmó mediante ensayos de tinción β-galactosidasa asociados con la senescencia, en los que la fracción de células de tinción positiva era menos de 2% para ambas líneas de células expuestas a los rayos X o irradiación con haz de iones de carbono (datos no mostrados). Estos datos indicaron que la apoptosis y catástrofe mitótica es el modo principal de muerte celular en p53
células + /+ y p53
- /- células, respectivamente, ambas después de la exposición a los rayos X y la radiación de haz de iones de carbono, y que la irradiación de haz de iones de carbono induce la catástrofe mitótica de manera más eficaz que la irradiación de rayos X en p53 apoptosis resistente
- /- las células
células sembradas en cubreobjetos de vidrio se incubaron durante la noche, expuesta (o no.; 0 h) a los rayos X (4 Gy) o un haz de iones de carbono (1,5 Gy) de irradiación, y luego teñidas con DAPI. La apoptosis, la catástrofe mitótica, y la senescencia se determinaron de acuerdo con las morfologías nucleares característicos (véase "Materiales y métodos" para las definiciones). (A-c) Imágenes representativas que muestran la morfología nuclear de células que experimentan apoptosis (a), la catástrofe mitótica (b), o la senescencia (c). Las imágenes de p53
- /- fueron tomadas las células 72 h después de la irradiación de haz de iones de carbono. (D, e) el modo de muerte celular en p53
+ /+ (d) y p53
- /- (e) células a 0, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 h después de X- irradiación con rayos. (F, g) el modo de muerte celular en p53
+ /+ (f) y p53
- /- células (g) a los 0, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas después de carbono irradiación de haz de iones. IR, la irradiación; C-ion, carbono-ion.
Las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio, incubaron durante la noche, expuestos a rayos de iones de carbono (1,5 Gy), y luego se tiñeron con DAPI 72 h más tarde. La apoptosis, la catástrofe mitótica, y la senescencia se determinaron de acuerdo con las morfologías nucleares característicos (véase "Materiales y métodos" para las definiciones). (A) p53
+ /+ células: 12,5%, 0% y 0% de las células mostraron apoptosis, la catástrofe mitótica, y la senescencia, respectivamente. (B) p53
- /- las células: 0%, 12,8% y 0% de las células mostraban apoptosis, la catástrofe mitótica, y la senescencia, respectivamente. Las flechas en (a) y (b) indican células que sufren apoptosis y catástrofe mitótica, respectivamente. Las barras de escala, 10 micras.
Para investigar más a fondo, se analizó el modo de muerte celular en varias líneas celulares humanas con la condición de p53 diferentes después de rayos X o irradiación de haz de iones de carbono (Fig. 4 ). RKO células que albergan p53 de tipo salvaje mostraron un fenotipo dominante apoptosis después de que cualquiera de rayos X o radiación de haz de iones de carbono, mientras que p53 nula H1299 y SAOS-2 células mostraron un fenotipo dominante catástrofe mitótica. En consecuencia, la supresión de la expresión de p53 en fibroblastos BJ-hTERT promovió la inducción de la catástrofe mitótica en rayos X o irradiación con haz de iones de carbono (S3 Fig.). Curiosamente, LS123 y células WiDr (que expresan p53 que alberga un missense en R175H y R273H, respectivamente), también mostraron un fenotipo mitótico catástrofe-dominante (Fig. 4). Estos sitios de mutación se encuentran dentro del dominio de unión a ADN de la proteína p53, que desempeña un papel clave en la activación transcripcional de varios genes diana, incluyendo los implicados en la inducción de la apoptosis [25]. Por lo tanto, el próximo examinó el modo de muerte celular inducida por irradiación utilizando una serie de células H1299 isogénicas que expresan de forma estable las proteínas p53 que albergan mutaciones de sentido erróneo en el dominio de unión a ADN que se observan a menudo en cánceres humanos (es decir, R175H, R273H, R249S y R280K ) [25]. Todas estas líneas celulares mostraron un fenotipo dominante catástrofe mitótica tras la irradiación (Fig. 5). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la disfunción del dominio de unión a ADN de p53 se conmuta el modo de muerte de células cancerosas inducida por irradiación de la apoptosis a mitótico catástrofe. Estos resultados también confirmaron que la irradiación de haz de iones de carbono era mejor que la irradiación de rayos X en la inducción de la catástrofe mitótica en las células cancerosas que alberguen p53 aberrante.
Las células fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio, se incubaron durante la noche, irradiados con rayos X ( D
10 dosis) o haces de iones de carbono (D
10 dosis), y después se tiñeron con DAPI 72 h más tarde. La apoptosis, la catástrofe mitótica, y la senescencia se determinaron de acuerdo con las morfologías nucleares característicos (véase "Materiales y métodos" para las definiciones). Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. Ap, la apoptosis; MC, catástrofe mitótica; SNS, la senescencia; IR, la irradiación; C-litio, carbono-ion
Las células fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio, se incubaron durante la noche, irradiados con rayos X (10,9 Gy, D
10 para los rayos X;. O 3,8 Gy, D
10 para los haces de iones de carbono) o haces de iones de carbono (3,8 Gy, D
10 para los haces de iones de carbono), y después se tiñeron con DAPI 72 h más tarde. La apoptosis, la catástrofe mitótica, y la senescencia se determinaron de acuerdo con las morfologías nucleares característicos (véase "Materiales y métodos" para las definiciones). Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. MC, catástrofe mitótica; C-litio, carbono-litio; IR, la irradiación. Tenga en cuenta que una parte del panel de H1299 p53 nulo es la misma que la mostrada en la Fig. 4 (pero el contexto es ahora diferente).
Las células se liberan de G2 /M detención 24 h después de rayos X o irradiación de haz de iones de carbono
catástrofe mitótica inducida por radiación se piensa que ocurre cuando las células proceder a través de la mitosis aberrante con daño en el ADN sin reparar [26]. Por lo tanto, para explorar el mecanismo subyacente a la inducción de la catástrofe mitótica en las células p53 nulo por irradiación de haz de iones de carbono, los efectos de los rayos X y de iones de carbono irradiación de haz en los estados del ciclo celular de p53
+ /+ y p53
- /- células HCT116 se determinaron por citometría de flujo (Fig. 6a, b). Como se analiza la muerte celular, las células se irradiaron con dosis de rayos X (4 Gy) o haces de iones de carbono (1,5 Gy). La inducción de la G2 /M detención que alcanzó un máximo de 12 horas después se observó la irradiación en ambas líneas celulares después de rayos X o de iones de carbono irradiación de haz, siendo más evidente en el p53
- /- las células que p53
+ /+ células. En particular, en ambas líneas de células expuestas a los rayos X o irradiación con haz de iones de carbono, la G2 /M detención fue liberado completamente 48 h después de la irradiación.
Las células se sembraron en placas de cultivo de 35 mm (a, b) o en cubreobjetos de vidrio (c), se incubaron durante la noche, y expuestas (o no; 0 h) a de rayos X (4 Gy) o un haz de iones de carbono (1,5 Gy) de irradiación. (A, b) las células irradiadas con rayos X (a) o haces de iones de carbono (b) se incubaron durante 0, 12, 24, 48, 72, 96 o 120 h, se fijaron con etanol, se tiñeron con yoduro de propidio, y estado del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. (C) las células se irradiaron con rayos X o haces de iones de carbono, se incubaron durante 1 h, y después se sometieron a inmunotinción para pH 3, un marcador específico de células en fase M. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. *
P Hotel & lt; 0,05 y †
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con los controles correspondientes. IR, la irradiación; C-litio, carbono-ion
A continuación, los porcentajes de p53
+ /+ y p53
-. /- Las células en la fase M antes y después de rayos X (4 Gy) o de iones de carbono vigas (1,5 Gy) de irradiación se evaluaron mediante inmunotinción usando un anticuerpo frente a pH 3 (Fig. 6c) [24]. Aproximadamente el 2% de p53 no irradiado
+ /+ y p53
- /- las células estaban en la fase M. Una hora después de la irradiación de haz de iones de carbono, los porcentajes de estas células en la fase M se redujeron significativamente, aunque p53
- /- células fueron menos susceptibles que p53
células + /+ a la irradiación de rayos X. Notablemente, 24 h después de rayos X o irradiación con haz de iones de carbono, los porcentajes de p53
+ /+ y p53
- /- células en la fase M se recuperaron a la línea base, lo que sugiere que ambas líneas celulares renovadas mitosis 24 h después del tratamiento.
ADN de doble filamento se rompe generados por irradiación de haz de iones de carbono muestran más lentas cinética de reparación que los generados por la irradiación de rayos X
Finalmente, la cinética de reparación de ADN de doble beta diana se rompe (DSBs), el tipo más letal de daño en el ADN generado por la radiación ionizante, se examinaron en p53
+ /+ y p53
- HCT116 células [27] - /. Las células irradiadas se sometieron a inmunotinción usando un anticuerpo contra γH2AX, y el número de focos por célula γH2AX en 15 min y 24 h después de la irradiación se contaron (Fig. 7, S1 cuadro) [24], [28]. Las células se irradiaron con una dosis de 2 Gy de rayos X o una dosis de 1 Gy de haces de iones de carbono; a estas dosis, el número de γH2AX focos por célula en el punto de tiempo de control (15 min después de la irradiación) era de aproximadamente 20 a 30, que era apropiado para la evaluación [24], [28]. Veinticuatro horas después de la irradiación de rayos X, el número de γH2AX focos en p53
+ /+ y p53
- /- las células fueron 24 ± 4,3% y 23 ± 5,3% de los de los controles correspondientes (en el 15 min punto de tiempo), respectivamente (Fig. 7a, b), indicando que el gran número de DSBs generados por la irradiación de rayos X fueron reparados dentro de 24 h. Por el contrario, 24 h después de la irradiación de haz de iones de carbono, el número de γH2AX focos en p53
+ /+ y p53
- /- las células fueron 93 ± 11% y 85 ± 7,3% de los de los controles correspondientes , respectivamente (Fig. 7a, c), indicando que las DSBs generados por irradiación de haz de iones de carbono no fueron reparados de manera eficiente, probablemente debido a la complejidad estructural de OSD termina [29]. De hecho, p53
+ /+ y p53
- células que se tiñeron de doble positivo para γH2AX y pH 3 se identificaron 24 h después de la irradiación de haz de iones de carbono, lo que demuestra que las células que albergan DSBs habían entrado en la mitosis (Fig - /. 7d). El estado de p53 no afectó a la cinética de la pérdida de γH2AX focos después de rayos X o irradiación con haz de iones de carbono. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que las células p53 nulo que albergan DSBs no reparados entrar en mitosis 24 h después de la irradiación de haz de iones de carbono, conduciendo a catástrofe mitótica.
Las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio, se incubaron durante la noche, expuestos a X- rayos (2 Gy) o haces de iones de carbono (1 Gy), se incubaron durante 15 min o 24 h adicionales, y después se sometieron a inmunotinción para γH2AX y pH 3. Las células fueron teñidas con DAPI. (A) El número de focos por γH2AX celular en 15 min o 24 h después de la irradiación. Los resultados para cada línea celular se normalizaron al número de γH2AX focos en el punto de tiempo de 15 min. Al menos 500 células se contaron por condición experimental. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a las muestras correspondientes a los 15 min. (B, c) muestran imágenes microscópicas representativas núcleos expuestos a (b) o un haz de iones de carbono (c) irradiación con rayos X, y se inmunotiñeron para γH2AX. En cada panel, el contorno del núcleo detectado por tinción DAPI se indica mediante una línea discontinua. (D) imágenes microscópicas representativos de núcleos expuestos a irradiación con haz de iones de carbono y inmunoteñidas para γH2AX y pH 3 a 24 h después de la irradiación. Las flechas indican los núcleos de doble positivas. C-litio, carbono-litio.
Discusión
A continuación, se demuestra que la irradiación de haz de iones de carbono induce modos distintos de la muerte celular de acuerdo con el estado de la mutación de
TP53
. Después de que ambos rayos X y la radiación de haz de iones de carbono, la apoptosis es el modo dominante de la muerte celular de p53
+ células /+ pero no de p53
- /- las células. En particular, la tasa de entrada mitótica y la cinética de la reparación de DSB después de la irradiación, que pueden ser factores clave que inducen la catástrofe mitótica, fueron similares en p53
+ /+ y p53
- /- las células, independientemente del tipo de irradiación utilizada. Estos datos indican que la apoptosis juega un papel primordial en la muerte de células de cáncer causado por la irradiación en presencia de p53. En ausencia de p53, las células de cáncer mostraron resistencia a la inducción de apoptosis y se observó la catástrofe mitótica después de que tanto X-ray y de iones de carbono irradiación de haz. Este hallazgo se explica probablemente por la limitación de la G2 /M puesto de control después de la irradiación. La activación de este punto de control permite la reparación del ADN dañado antes de que se transmite a las células hijas y actúa como una barrera para impedir la entrada prematura en mitosis [30]. Sin embargo, estudios previos han sugerido que la limitación de la G2 /M puesto de control después de IR; G2 /M puesto de control es liberado cuando el número de DSBs se hace menor que ~10-20, seguido de la entrada en mitosis [24], [31]. Después del lanzamiento G2 /M puesto de control, células que albergan 10-20 DSB son capaces de completar el evento mitótico y entrar en la fase G1 [32], [33]. la reparación de DSB está regulado por disminución en la fase M; Por lo tanto, este daño puede ser reparado en el próximo ciclo celular, aunque el proceso de reparación en las células hijas que queda por esclarecer [34]. Otra posible razón para la inducción eficiente de la catástrofe mitótica en p53
- /- células es la mayor propensión de estas células para estancar en el directorio /M fase G2 después de la irradiación de p53
+ células /+. Esta acumulación de fase G2 /M es el resultado de un defecto en la vía de señalización de p53-p21 que atenúa arresto G1 después de la irradiación [16]. Esta propiedad de las células cancerosas deficientes en p53 podría aumentar las posibilidades de las células irradiadas que albergan las DSB sin reparar entren en mitosis, que conduce a la mejora de la catástrofe mitótica.
Los resultados del presente estudio sugieren que tanto la falta de p53 y de sentido erróneo mutaciones en p53 contribuyen al cambio de la apoptosis de la catástrofe mitótica. En general, 75% de las mutaciones de p53 identificados en los cánceres humanos son las mutaciones de sentido erróneo individuales. La mayoría de las mutaciones de sentido erróneo, incluyendo las examinadas en el presente estudio, se encuentran dentro del dominio de unión a ADN de p53, que desempeña un papel clave en la activación de la transcripción de muchos genes diana, incluyendo los que inducen la apoptosis [25]. La mayoría de las proteínas p53 mutantes tienen un efecto dominante negativo, que conduce a la disfunción de las restantes proteínas p53 normales. Por lo tanto, es razonable que, junto con la falta de p53, las mutaciones de sentido erróneo en el dominio de unión al ADN de p53 también contribuyen al fenotipo de apoptosis resistente mediante la interrupción de la capacidad de las proteínas p53 normales para activar transcripcionalmente genes relacionados con la apoptosis; esto puede hacer que las células irradiadas que albergan las DSB sin reparar más susceptibles a la catástrofe mitótica. Sin embargo, vale la pena señalar una limitación del estudio en este punto: no fuimos capaces de establecer células H1299 que expresan p53 de tipo salvaje (ya sea transitoria o estable); por lo tanto, una comparación entre los de tipo salvaje de p53 y p53 mutante era imposible. Los estudios futuros deben comparar el modo de muerte celular inducida por irradiación en las líneas celulares isogénicas que albergan de tipo salvaje, mutante, y null-p53
Es de destacar., los resultados presentados aquí demuestran la inducción eficiente de la catástrofe mitótica de carbono irradiación de haz de iones en las células p53 nulo y p53 mutante. De hecho, en probaron todas las líneas de células con p53 y p53 nula mutante, la dosis que se requieren para inducir cierto nivel de catástrofe mitótica era evidentemente inferior en haces de iones de carbono que en las radiografías. Este resultado puede explicarse por las dificultades asociadas con la reparación de DSBs generados por irradiación de haz de iones de carbono, que retienen las estructuras más complejas de ADN dañado termina que los generados por la irradiación de rayos X [35]. reparación de daños en el ADN ineficiente causada por la complejidad de los extremos del OSD puede ser la base del efecto de destrucción celular eficiente de irradiación de haz de iones de carbono en las células cancerosas que alberguen aberraciones p53.
Los resultados descritos aquí son parcialmente contradictorios a los de los anteriores estudios que examinaron la RDA después de la irradiación de haz de iones de carbono de las células cancerosas p53 mutante. Aunque algunos estudios observaron apoptosis eficiente (S2 cuadro) [12] - [15], hay que hacer notar que este modo de muerte celular sólo se indujo a eficientemente a LET valores superiores a 70 keV /m. Por el contrario, el valor LET promedio en el centro del pico de Bragg propagación de salida utilizado clínicamente, tal como se utiliza aquí, es de aproximadamente 50 keV /m. Además, en contraste con los resultados descritos aquí, la inducción de la senescencia y prolongada (más de 3 días) G2 /M detención también se observó en los estudios anteriores usando irradiación de haz de iones de carbono con valores LET alta [12], [36] . Estos datos sugieren que la DDR varía en función del valor LET de la irradiación de haz de iones de carbono utilizado. Adicional
e in vitro
in vivo se requieren
estudios de una variedad de líneas celulares para validar los efectos terapéuticos de la irradiación de haz de iones de carbono en el LET usado en entornos clínicos.
en resumen, este análisis exhaustivo de la RDA en líneas celulares isogénicas irradiados demuestra que las células cancerosas p53 nula irradiación con rayos X resistentes son susceptibles a la irradiación de haz de iones de carbono, lo que induce eficazmente la catástrofe mitótica (Fig. 8). La inducción de la catástrofe mitótica en los tumores resistentes a la apoptosis puede ser un importante ventaja biológica de la radioterapia de iones de carbono durante la radioterapia de rayos X. Se requieren estudios adicionales utilizando modelos animales o muestras clínicas para dilucidar esta cuestión.
C-litio, carbono-litio.
Apoyo a la Información
S1 Fig.
Propiedades de la p53
+ /+ y p53
- /- células
doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s001 gratis (PDF)
S2 Fig.
Los modos de la muerte celular inducida por irradiación de rayos X para el D
10 en HCT116 p53
- /- las células
doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s002
( PDF)
S3 Fig.
Los modos de la muerte celular inducida por rayos X o irradiación de haz de iones de carbono en BJ hTERT-WT o -shp53 células
doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s003 gratis (PDF)
S1 tabla. . Francia El número de focos γH2AX por célula después de la irradiación
doi: 10.1371 /journal.pone.0115121.s004 gratis (PDF) sobre Table S2.
pisos-dependencia de la eficacia de la inducción de apoptosis por irradiación de haz de iones de carbono en las células cancerosas p53 mutante
doi:. 10.1371 /journal.pone.0115121.s005
(PDF)
Reconocimientos
agradecemos al Dr. Tetsushi Sadakata, el Dr. Kohta Torikai, y el Dr. Mayumi Komachi (Universidad de Gunma) para la asistencia técnica. Agradecemos al Dr. Volgelstein (Universidad Johns Hopkins) para proporcionar líneas celulares.