Extracto
Los carcinomas surgen en un microambiente complejo que consta de múltiples linajes distintos epiteliales rodeadas de una variedad de tipos de células del estroma. La comprensión de la etiología del cáncer requiere la evaluación de la relación entre los tipos de células durante el inicio de la enfermedad y por medio de progresión. ratón genéticamente modificado (GEM) modelos de facilitar el examen prospectivo de eventos oncogénicos tempranas, lo cual no es posible en los seres humanos. Como la mayoría de tumores sólidos albergan aberraciones en la red RB, hemos desarrollado un enfoque GEM inducible para el establecimiento y la evaluación de la iniciación carcinoma en una amplia gama de tejidos epiteliales y subtipos sobre la inactivación de la supresión tumoral mediada por RB (RB-TS). El sistema permite la evaluación independiente de los subtipos epiteliales que expresan ya sea citoqueratinas (K) 18 o 19. Por Cre expresión dependiente de una proteína que inactiva dominantemente RB y proteínas p107 funcionalmente redundantes y p130, neoplasia podrían originarse en cualquiera K18 o K19 células que expresan de numerosos tejidos. Por su diseño, ya que sólo una única vía de aberración fue diseñado, desarrollado carcinomas estocásticamente sólo después de larga latencia. Por lo tanto, este sistema, que permite la iniciación de un carcinoma de células de tipo específico dirigido, facilita aún más la definición de eventos que pueden progresar a neoplasias cánceres agresivos a través de ingeniería genética, la evolución inducidos por carcinógenos y /o espontánea
Visto:. Y la canción , Gilbert D, TN O'Sullivan, Yang C, W Pan, Fathalizadeh A, et al. (2013) Carcinoma de Iniciación a través de Rb inactivación del tumor supresor: Un enfoque versátil para el cáncer epitelial de Iniciación Subtipo-dependiente en diversos tejidos. PLoS ONE 8 (12): e80459. doi: 10.1371 /journal.pone.0080459
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Julio, 2013; Aceptado: 3 de octubre de 2013; Publicado: Diciembre 2, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. HHSN261200800001E, y en parte por subvenciones SR1-CA046283 del Instituto Nacional del cáncer y PC040619 del Departamento de Defensa, y la Fundación de cáncer de próstata de TVD. YS fue apoyado por el premio de la formación post-doctoral (PC050306) del Departamento de Defensa. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente los puntos de vista o las políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de marcas registradas, productos comerciales u organizaciones implica aprobación por parte del gobierno de Estados Unidos
Conflicto de intereses.: los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
cánceres malignos evolucionan a través de mecanismos de crecimiento selectivo, la supervivencia y propiedades invasivas en un microambiente diversa. Por lo tanto, los cánceres son heterogéneos con una circunscripción compleja de múltiples tipos de células. ratón genéticamente modificado (GEM) modelos proporcionan un enfoque poderoso para evaluar tanto la causa /efecto y relaciones tipo de célula susceptibilidad. Durante las últimas décadas, se ha avanzado en la identificación de aberraciones moleculares que pueden contribuir a la tumorigénesis, por tanto, al ofrecer información sobre los posibles mecanismos causales y dianas terapéuticas. Sin embargo, ya que muchos eventos han sido diseñados juntos y con frecuencia no inicie la enfermedad, relativamente pocos estudios han explorado la etiología de la evolución del tumor desde el inicio hasta la progresión de la enfermedad avanzada. Aquí, hemos tratado de desarrollar modelos de "cáncer-iniciador GEM" que podrían ser inducidas para iniciar la tumorigénesis en una amplia variedad de tejidos epiteliales y en compartimentos distintos subtipos para su posterior utilización en la definición de mecanismos de tejidos y de células específicas de la progresión de carcinoma.
subtipos de células de un epitelio se pueden caracterizar por los perfiles de expresión de citoqueratina emparejado específicamente (K) [1] - [3]. Las citoqueratinas son citoesqueleto filamentos de proteína intermedio ensamblados a partir de subunidades heterodiméricas de tipo ácido I (K9-K28) y proteínas básicas de tipo II (K1-K8 y K71-K80) [4]. K18, por lo general se combina con K8, es la primera queratina expresado en la fase de ocho células del desarrollo del ratón [5], [6], seguido de K19 y K7 [7]. Sin embargo, K19, el más pequeño de queratina ácida conocida, no tiene pareja conocida básicos Tipo II queratina. Aunque tanto K18 y K19 se expresan en epitelios simples, que se expresan diferencialmente en los subtipos de algunos epitelios (por ejemplo, K18 en las células paraguas y K19 en basal y las células intermedias de urotelio [2], [3], [8]). Por lo tanto, diferentes patrones de expresión de queratina se pueden utilizar como base para la orientación eventos de iniciación de tumor a los subtipos epiteliales específicas.
Retinoblastoma 1 (RB) es un regulador negativo de la proliferación en el ciclo celular eucariota, en particular durante la diferenciación celular [ ,,,0],9], y de la vía RB juega un papel crítico en la tumorigénesis. RB actividad de la vía aberrante, como resultado de defectos en la propia RB, CDKN2A, CCND1, o CDK4, se observa en los cánceres humanos más sólidos [10]. En los pocos tipos de cáncer en el que el tejido humano temprano es rutinariamente accesible, tales aberraciones están a menudo presentes, lo que sugiere un papel en la iniciación [11] - [15]. Sin embargo, en algunos casos, la primera asociación de aberración vía RB es evidente en cáncer más avanzado, argumentando un papel en la progresión [16]. De hecho, las relaciones de causa y efecto probable que dependen de múltiples variables, incluyendo la célula y tejido de origen y el orden estocástica de eventos causales, haciendo hincapié en la necesidad de sistemas de modelos para determinar los roles plausibles en la etiología de la enfermedad. Debido a la redundancia funcional entre RB y sus Miembros de la familia p107 y p130 en la mayoría de tipos de células murinas [17] - [20], se han utilizado una proteína inactivadora dominante, T
121, para inactivar la supresión de tumores RB (RB-TS) en el ratón [21] - [25]. T
121 se deriva de la N-terminal de 121 aminoácidos de virus de simio 40 (SV40) antígeno T grande, que evolucionaron para inactivar el freno del ciclo celular RB-mediada. Cuando dirigida por promotores específicos de tejido en ratones transgénicos, T
121 es suficiente para iniciar la tumorigénesis en la próstata [26], de mama [27], de ovario [28] y el plexo coroideo [29] las células epiteliales, así como en el centro nervioso astrocitos del sistema [30], [31]. El fenotipo de iniciación es dependiente de la T
121 RB /p107 /p130 sitio de unión como se ha demostrado por mutagénesis puntual [32]. En todos los casos examinados hasta ahora, la iniciación se asocia con proliferación aberrante acompañado de la apoptosis, y la progresión tumoral ha sido impulsado por la ingeniería y /o la aberración estocástica de las redes moleculares asociados al cáncer específicos [28], [31], [33].
a continuación, describimos líneas de ratones transgénicos en la que RB-TS inactivación puede ser inducida en cualquiera de K19 o K18 que expresan subtipos epiteliales de una manera recombinasa Cre dependiente. Se establecieron líneas transgénicas en las que la expresión de Cre-condicional de T
121 fue conducido bajo cytokeratin18 o 19 utilizando el control transcripcional de transgenes cromosoma artificial bacteriano (BAC) que retienen los patrones de expresión endógenos en diversos tejidos. Por lo tanto, una sola cepa de cada subtipo se puede utilizar para conducir la iniciación del cáncer de tejido específicamente a través de la expresión de Cre-órgano específico después de la línea germinal o somática introducción de un
Cre
transgén. Por la inactivación selectiva de RB-TS en K18- o K19-que expresan las células, se demuestra la amplia utilidad de estos "cáncer" iniciador ratones en estudios sobre los mecanismos de desarrollo del cáncer y mostramos papeles para RB-TS inactivación y la especificidad del subtipo del epitelio neoplásico en la iniciación en numerosos órganos epiteliales.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión (ACUC) de la UNC-Chapel Hill (Permiso Número: 04 a 232,0), y el Instituto Nacional del Cáncer (Número de Permiso: 11-030) (NCI) -Frederick. Todos los animales en este estudio fueron sacrificados por las "Directrices para la eutanasia de ratón y de rata Los fetos y recién nacidos" tal como se define por la ACUC de UNC-Chapel Hill y NCI-Frederick para minimizar el dolor y el sufrimiento.
Generación de subtipo específicos de ratones dirigida-queratina BAC transgénicos
A floxed eGFP detener T
121 casete (casete del transgén, Figura 1 A) se deriva de la MFT
121 constructo [34]. T
121 se compone de los primeros 121 aminoácidos (aa) de la antígeno T grande de SV40, seguido por los aminoácidos 11 missense resultantes de una deleción de 31 pb. El transgén no puede expresar el antígeno t pequeño debido a una segunda deleción que elimina su sitio aceptor de empalme [35]. T
121 RB inactiva y miembros de la familia p107 y p130 y no contiene el p53 y p300 inactivación de dominio [36]. El banco de ADN genómico RPCI-22 de ratón se proyectó utilizando sondas específicas diseñadas para K18 (Krt1-18 en el cromosoma 15) y K19 (Krt1-19 en el cromosoma 11) a través del servicio de detección RPCI BAC (Roswell Park Cancer Institute, Nueva York). Los clones positivos se utilizan para la inserción recombinería dirigida [37], [38] de floxed eGFP-parada-T
121 casetes en el exón 1 codones de inicio de K18 y K19. ADN de BAC se purificó (MTR Scientific, Ijamsville, MD) y se inyecta en huevos fertilizados cosechadas de una B6D2F1 (Laboratorio JAX, Bar Harbor, Maine) transversal a una concentración de 4 ng /ul sin linealización como se describe [39]. Resultante y generaciones posteriores de ratones transgénicos fueron identificados por amplificación PCR de un fragmento de 215 pb usando los cebadores 5 'GAATCTTTGCAGCTAATGGACC 3' y 5 'GCATCCCAGAAGCTCCAAAG 3' y el ADN genómico o el oído digito- derivado como molde. El perfil de ciclos fue: 94 ° C, 2 minutos; seguido por 35 ciclos de 94 ° C, 20 segundos; 62 ° C, 45 segundos; 72 ° C, 45 segundos; y una incubación final de 72 ° C, 2 minutos. líneas de ratones se mantuvieron en el apareamiento con ratones B6D2F1 tipo salvaje y por lo tanto se designan como
B6; D2-Tg (K18GT
121) TVd gratis (
TgK18GT
121
) y
B6; D2-Tg (K19GT
121) TVd gratis (
TgK19GT
121
)
A.. casete del transgén: Un casete de parada eGFP estaba flanqueado por sitios loxP y el gen T
121 se colocó aguas abajo. B. queratina cromosoma artificial bacteriano (BAC) construcciones transgénicas: un casete de transgén (A) se insertó aguas arriba del codón de inicio ATG en el exón 1 de K18 (. Deriva de cromosoma de ratón (Chr) 15) y de K19 (derivadas del ratón Chr 11) en BAC utilizando recombinería. El sitio de inserción para el loxP-eGFP-stop-loxP-T
121 casete se indica mediante una de trazos "V". representante genes aguas abajo de los genes de queratina se indican en cajas. barras negras continuas indican los exones (E). C. transgen número de copias por genoma diploide se determinó por qPCR.
Estrategias de Reproducción transgénicos
TgK18GT
121
y
TgK19GT
121
ratones fueron cruzadas a
β-actina Cre
ratones (FVB o C57BL6 /fondo NCR), y
TgK19GT
121
a
K19CreER
ratones ( C57BL /6 antecedentes, proporcionado por el Dr. Guoqiang Gu en la Universidad de Vanderbilt) [40] para determinar la capacidad de iniciación tumoral al RB-TS inactivación en K19 y K18 subtipos.
transgen Copia Número Determinación
ADN de cola genómico fue extraído utilizando Qiagen DNeasy sangre y kit de tejidos, y PCR cuantitativa en tiempo real se utilizó para detectar el número de copias del transgén. Las amplificaciones por PCR se realizaron en placas de 96 pocillos en el detector de secuencias ABI 7500. 30 muestras incluyeron 10 ul ul (50 ng) muestra de ADN genómico y la mezcla de reacción de PCR de 20 ul. La amplificación se con 10 minutos a 94 ° C seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 94 ° C y 1 minuto a 60 ° C. Los cebadores y las secuencias de la sonda para T
121 genes fueron: hacia adelante: 5 'CTT TGC AGC TAA TGG CAC TTC 3', inversa: 5 'TGC CTT TCT CAT CAG AGG AAT 3', y la sonda: 5 'Fam TC CCC CAG GCA CTC CTT TCA AGA C Tamra 3 '. Los cebadores de control del gen beta-actina endógenos fueron: hacia adelante: 5 'CTG CCT GAC GGC CAG GTC 3', inversa: 5 'CAA GAA GGA AGG CTG GAA AAG A 3', y la sonda: 5 'Fam CA CTA TTG ACG ACG AGC GGT TCC G Tamra 3 '. las diferencias relativas de los números de copias del transgén se calcularon utilizando un método dCt estándar con una cantidad conocida de plásmido control.
Histopatología e inmunodetección
tejidos transgénicos fueron disecados en las edades indicadas y se fijaron durante la noche en 10% neutral formalina tamponada, se transfirió a 70% de etanol, de forma rutinaria procesado, y embebidos en parafina. Los tejidos se seccionaron por 10 capas sucesivas a 5 micras intervalos excepto tejidos linfoides (4 micras) y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para el examen histopatológico. La inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF) se realizaron análisis de secciones incluidas en parafina fijadas con formalina como se describe anteriormente [26]. Los anticuerpos fueron: anti-K8 /18 (1:500, policlonal de cobaya, GP11, Progen Biotechnik, GmbH, Heidelberg, Alemania), anti-K19 (1:200, monoclonal de conejo, Epitomics, CA), anti-K14 (1 :1000, policlonal de conejo, pRB-155P, Covance), anti-GFP (1:500, b-2, monoclonal de ratón, Santa Cruz), anti-SV40 T antígeno (1:100, monoclonal de ratón, DP02-200UG, Calbiochem ), y anti-Ki-67 (1:500, policlonal de conejo, 06-570, BD Pharmingen, San Diego, CA). Para el doble si la tinción, el primer anticuerpo primario (anti-eGFP o antígeno T anti-SV40) se incubaron durante la noche seguido por el segundo anticuerpo primario (anti-K19, anti-K14, o anti-K18) de la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente . Mezclado Alexa Fluor 488 y 594 (1:200 dilución, Life Technologies) sirvió como anticuerpos secundarios. Las imágenes fueron capturadas utilizando microscopios de luz, de inmunofluorescencia, o confocal Zeiss. Se detectaron los niveles de apoptosis en las secciones utilizando el etiquetado final nick (TUNEL) ensayo de dUTP-biotina deoxynucleotidyltransferase mediada terminal (ApopTag peroxidasa
In Situ
Kit de Detección de Apoptosis, S7100 Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante [26]. Para cuantificar Ki-67 células positivas, al azar campos 5-10 Ki-67-positivas con la misma ampliación se adquirieron usando un microscopio Zeiss, y Ki-67 células positivas y negativas se contaron manualmente. Positividad se calculó como el porcentaje medio de células totales.
Análisis estadísticos
pruebas de suma de rangos de Mann-Whitney t de Student o se llevaron a cabo para evaluar la significación estadística entre los genotipos y los tejidos. P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
La expresión del transgen refleja con precisión epitelial Subtipo Especificidad
Regulación de queratina Para orientar RB-TS inactivación de los subtipos epiteliales, se empleó dentro de BAC. para conducir la expresión del transgén condicional. A Cre-condicional loxP-eGFP-stop-loxP (LSL) T
121 casete (Figura 1A) se introdujo en el primer exón de cualquiera de la K18 o el gen K19 dentro de los respectivos BAC para generar
TgK18GT
121
y
TgK19GT
121
ratones transgénicos (Figura 1B). Por lo tanto, EGFP se expresa bajo la regulación K18 o K19 hasta que la expresión /activación de la CRE, que mediada
eGFP
eliminación e indujo T
121 expresión. Dos líneas fundadoras de transmisión para cada construcción se generaron y se caracterizaron. Según la evaluación de la PCR cuantitativa en tiempo real, los ratones albergaban una copia de los transgenes en líneas
TgK19GT
121-34
y
-43, España y
TgK18GT
121-36
, y 3 copias del transgén en la línea
TgK18GT
121-34
(Figura 1C).
para detectar K19 K18 endógena y de expresión, y así las pautas de regulación precisa del transgen, tejidos epiteliales de tipo salvaje fueron examinados por IHC o IF. En consonancia con los resultados reportados [2], [3], [8], tanto K19 y K18 se expresa ampliamente en una variedad de tejidos epiteliales de ratón (Figura S1 y en la Tabla S1).
TgK18GT
121
y
TgK19GT 121
eGFP expresión
transgén se visualizó en tejidos enteros usando un microscopio de fluorescencia estéreo (Discovery.V20 estéreo, Carl Zeiss Meditec, Inc). fluorescencia verde fuerte se observó en algunos tejidos de ambas líneas de
TgK19GT ratones
121 gratis (por ejemplo, intestino, estómago, vejiga urinaria, y la vesícula biliar), pero débil o ninguna fluorescencia verde en otros (por ejemplo, la glándula mamaria, ovario y páncreas, la figura S2). Muchos tejidos mostraron una fuerte fluorescencia verde en ambas líneas de
TgK18GT ratones
121 gratis (por ejemplo, intestino, estómago, timo, glándula mamaria, ovario, glándula salival, vejiga urinaria y los vasos deferentes, epidídimo y la vesícula biliar), pero no en el páncreas, el pulmón y el hígado (Figura S3). En
TgK19GT
121
ratones, inmunotinción de secciones de tejido mostraron consistentemente expresión fuerte y generalizada eGFP en el intestino, estómago, vejiga urinaria, la vesícula biliar, y la pelvis renal epitelio. Fácilmente tinción detectable se limita a un porcentaje menor de células en el pulmón, glándula mamaria, y la próstata (Figura S4 y en la Tabla S1). Otros tejidos tenían muy débil o ninguna expresión eGFP detectable (Tabla S1). En
TgK18GT 121
ratones, la expresión de EGFP fue generalizada en la mayoría de los tejidos epiteliales K18-positivos (Figura S5 y Tabla S1). Es importante destacar que, en base a doble SI, EGFP fue co-expresada con respectivos queratinas endógenos en
TgK19GT
121 gratis (figura S4) y
TgK18GT
121
ratones (Figura S5), pero excluidos de K14 células (Figura S6). Sin embargo, no todas las células K19 o K18 positivos expresan eGFP. Ambas líneas de
TgK19GT
121
ratones mostraron eGFP expresión similar. Los tejidos de los
TgK18GT
121-34
ratones mostraron tinción más intensa eGFP en comparación con los de
TgK18GT
121-36
ratones (datos no mostrados), posiblemente debido a la mayor número de copias del transgén en la línea 34 (Figura 1C).
RB-TS la inactivación se induce en específico epitelial subtipos
Para determinar si T
121 expresión puede ser inducida en una amplia gama de tejidos epiteliales con especificidad subtipo y para evaluar el efecto de la inactivación de RB-TS, se cruzaron ratones transgénicos hemizygous de todas las líneas de transgénicos
β-actina Cre
ratones homocigotos. Probablemente debido a la amplia inactivación de RB-TS en K19 que expresan las células embrionarias (véase más adelante), se observó algo de letalidad embrionaria en
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones. los ratones transgénicos bi-nacido vivo fueron en relación con los controles de la misma camada (34% vs 66% suficientemente representada por
TgK19GT
121-34
, 45% frente a 55% para
TgK19GT
121-43
, respectivamente; Tabla S2), lo que sugiere que la función RB en las células K19 puede ser crítico para el desarrollo. En los ratones supervivientes, en consonancia con la amplitud de la expresión K19 endógeno (Figura S1), T
expresión 121 se observó fácilmente en una variedad de tejidos evaluados primero a los 2 meses de edad (Figura 2), a pesar de que la expresión de eGFP habían sido baja o por debajo del nivel de detección de IHC en algunos de estos tejidos (por ejemplo, ovario, glándula mamaria y el páncreas, las figuras S2 y S4, y en la Tabla S1). Es importante destacar que, como eGFP se expresó fielmente en las células K19, T
121 fue también expresado en células K19-positivos (no mostrados), pero excluidos de las células K14 (Figura S6). T
121 niveles de expresión fueron comparables entre los
TgK19GT
121-34; β-actina Cre
y
TgK19GT
121-43; β-actina Cre
ratones (no se muestran).
tinción marrón fuerte indica positivo T
121 expresión.
A diferencia de
TgK19GT
121 ; β-actina Cre
ratones, ambas líneas de
TgK18GT
121; β-actina Cre
ratones desarrollados con frecuencias mendelianas normales (no mostrado). T
121 se expresa ampliamente en K18 expresar epitelio de algunos tejidos de 2 meses de edad
TgK18GT
121; β-actina Cre
ratones (por ejemplo, el timo, glándula mamaria, y ovario), pero mostró inducción limitada en otros, aunque en las células apropiadas (por ejemplo, intestino, próstata y páncreas; Figura 3), a pesar de que la expresión de eGFP había sido más extendida en algunos casos (figuras S3 y S5, y en la Tabla S1). Es importante destacar que, T
121 se expresó en células positivas K18 (Figura 3B), pero excluidos de las células K14 (Figura S6). La intensidad de T
121 expresión fue comparable entre los
TgK18GT
121-34; β-actina Cre
y
TgK18GT
121-36; β-actina Cre
líneas (no se muestra), aunque la expresión de EGFP fue mayor en
TgK18GT
121-34
que
TgK18GT
121-36
ratones (no se muestra) . Esta observación puede reflejar la reducción del número de copias somáticas mediada por Cre a partir de una serie de genes de tándem.
A. T
121 expresión por IHC. Las flechas negras indican T
121 células positivas. Barra de escala = 50 micras. B. doble tinción de inmunofluorescencia de T
121 como K18 verde y rojo endógeno como en los tejidos mostrados como imágenes confocales fusionadas. Las flechas blancas indican las células epiteliales intestinales positivos tanto para K18 endógena y T
121. . Barra de escala = 25 M
RB-TS inactivación Causas Neoplasia
En comparación con los ratones de tipo salvaje (Figura S7a), todos
TgK19GT
121-43; β-actina Cre
ratones desarrollaron lesiones hiperplásicas multifocales en la mayoría de los tejidos epiteliales K19 positivos [por ejemplo, páncreas (epitelio pancreático ductal), glándula mamaria, (células epiteliales superficie del ovario, OSECs) de ovario, bronquiolo de pulmón, ductule bilis del hígado, la vesícula biliar, riñón (pelvis renal células epiteliales), vejiga urinaria, próstata, intestino delgado, colon, estómago foveolar glandular Células; Figura 4 y Tabla 1]. Este fenotipo era concurrente con altas tasas de proliferación en las células afectadas (Figuras 5 y 6) en comparación con los tejidos de tipo salvaje (Figuras 6 y S8). Al igual que en informes anteriores de los tejidos limitados [26], [27], [30], el aumento de la proliferación en los tejidos de
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones fue acompañado por una elevación significativa de la apoptosis (Figura S9) en comparación con la de los ratones de tipo salvaje (Figura S10). Estos resultados indican que RB es importante para la supresión de la hiperplasia de las células K19 positivos. Algunos
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones desarrollaron hidronefrosis bilateral o unilateral en peligro la vida de comenzar tan temprano como 2 meses de edad (Figura S11a). La hidronefrosis se interpretó a ser secundaria a la hiperplasia marcada de las células del epitelio de transición en el cruce de la pelvis renal y el uréter que resulta en la obstrucción del flujo de orina desde el riñón (Figura S11a). Otros ratones de la línea 34 tuvieron que ser sacrificados debido al agrandamiento de timos, que llevaron a la presión torácica potencialmente mortales, a los 7 meses de edad (Figura S11B)
Hiperplasia se observó en la mayoría de los tejidos (pulmón y colon.: indicado por las flechas negras). Se observó hiperplasia ductal multifocal en el páncreas, así como neoplasia intraepitelial de próstata de ratón (MPIN) en la próstata, y la hidronefrosis como se indica por las flechas blancas en el riñón. Todas las muestras fueron teñidas con H & amp;. E
La proliferación se evaluó por Ki-67 IHC (marrón) en los tejidos de ratones de 2 meses de edad. Las flechas indican las células epiteliales de la superficie del ovario (OSECs) positivas para Ki-67. Barra de escala = 50 micras.
tasas de proliferación de páncreas, glándula mamaria, ovario, próstata (lóbulo dorsolateral), y la vejiga se cuantificaron en secciones de tejidos teñidos con Ki-67. * Significativamente diferente del control WT (p & lt; 0,001); #significantly diferentes entre los
TgK19GT
121; β-actina y Cre TgK18GT
121; β-actina Cre
(p = 0,007); @ Significativamente diferentes entre los
TgK18GT
121; β-actina Cre
y WT (p = 0,043)
Al igual que
TgK19GT
121.; β-actina Cre
ratones, la inactivación de RB-TS en las células K18-positivos predominantemente conducido a la hiperplasia (Figura 7 y Tabla 1), que se correlacionó con T
121 expresión en estos tejidos (Figura 3). Con amplia inducción por el
β-actina Cre
alelo, tanto
TgK18GT
121-34
y
TgK18GT
121-36
ratones desarrollado epiteliales del timo severa hiperplasia y la hiperplasia linfoide posterior (Tabla 1 y Figura 7). La inmunotinción se indica alta T
121 expresión en el epitelio tímico K18 cortical (Figura S12B) asociada con una alta proliferación (basado en Ki-67 IHC) y las tasas de apoptosis (TUNEL) (Figura S12C). Debido a que estos ratones fueron comprometidas debido a la presión torácica en peligro la vida de los timos agrandadas (Figura S12A) y requiere la eutanasia a los 6 meses de edad,
TgK18GT
121; β-actina Cre
fenotipos en otros tejidos no podían ser examinados más allá de esta edad. En 1-6 meses de edad, se observó hiperplasia focal leve en la glándula mamaria, el epitelio superficial del ovario, intestino, y de próstata (Figura 7 y Tabla 1), que se correlaciona con las tasas de proliferación elevadas y aumento de la apoptosis (figuras 6, 8 y S13 ). En su mayor parte, en comparación con
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones, el grado de hiperplasia fue menos generalizada en
TgK18GT
121; β-actina Cre
ratones, que se correlacionaban con el grado limitado de T
121 expresión en estos tejidos. Las altas tasas de proliferación se observaron tanto en K19 y K18 positivo epitelio mamario y epitelio de la superficie del ovario (38,6% vs. 49,2% en mamaria, y 51,2% frente a 34,2% en el ovario, respectivamente, Figura 6), lo que podría ser explicado por co- expresión de K19 y K18 en estos tejidos (Figura S1). Sin embargo, este no es el caso para otros sitios de co-expresión (por ejemplo, la próstata, la Figura 6), sugiriendo que la especificidad tisular pueden desempeñar un papel en la eficiencia de recombinación Cre
.
Hiperplasia se observó en algunos tejidos (ovario y la próstata: indicado por las flechas). Todos los ratones se sacrificaron a los 1-7 meses de edad, debido a la presión torácica en peligro la vida causada por el agrandamiento de los timos. Todas las muestras fueron teñidas con H & amp;. E
La proliferación se evaluó como en la figura 5 en ratones de 2 meses. Se observaron niveles de proliferación similares en el intestino delgado, colon, estómago y folículo ovárico como la de los ratones de tipo salvaje que se muestran en la Figura S8. Las flechas negras indican Ki-67 células positivas. Barra de escala = 50 micras.
La inactivación de RB-TS en adultos restringidas-K19 + células es suficiente para la iniciación del tumor
Para evitar los defectos de desarrollo observados en
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones y para demostrar la utilidad de estos modelos para estudiar el desarrollo del cáncer en órganos adultos, cruzamos
TgK19GT
121-34
al tamoxifeno inducible por
K19CreER
ratones [40]. En contraste con
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones,
TgK19GT
121; K19CreER
ratones nacieron con frecuencias mendelianas esperados (no se muestra), más el apoyo a la función crítica de la RB-TS en las células K19 positivos durante el desarrollo del ratón . Los ratones se indujeron con tamoxifeno a las 6-8 semanas de edad, y T
121 expresión se evaluó por IHC. T
121 fue primero fácilmente detectable en la vesícula biliar a las 2 semanas después de la inducción (no mostrado) y se había extendido en varios tejidos por 4-6 semanas después de la inducción (Figura S14a). Por otra parte, T
121 fue co-expresada con K19 (Figura S14B). En consonancia con la expresión de eGFP antes de Cre expresión, y, típico de la expresión del transgen, T
121 se expresó en un subconjunto de células K19 positivos dentro de un tejido dado.
Para determinar si RB-TS inactivación predispuesto , inducida por tamoxifeno adultos K19-que expresan las células epiteliales a la tumorigénesis
TgK19GT
121; K19CreER
los ratones eran de edad avanzada. Consistente con el fenotipo hiperplásico general observada en
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones, se observó una alta frecuencia de hiperplasia atípica en los tejidos más epiteliales (por ejemplo, estómago epitelio glandular 85,7% en varones y 90% en las mujeres, y el epitelio bronquiolar de pulmón 92,9% en varones y 90% en las mujeres; Tabla 2), en consonancia con un aumento de las tasas de proliferación (no se muestra). Mientras que una baja frecuencia de neoplasia maligna se produjo en algunos tejidos (por ejemplo, adenocarcinoma de estómago 13,3% en varones y 14,3% en las mujeres; Tabla 3 y la Figura 9), lesiones de bajo grado presente en la mayoría de los órganos indicado que RB-TS inactivación era suficiente para iniciar pero no para el progreso de la enfermedad. Esto es consistente con nuestros resultados anteriores en mamaria [27], de próstata [26], el plexo coroideo [29] y el epitelio de ovario [28], y astrocitos del cerebro [30], [31]. Similar a
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones, hidronefrosis renal también se observó en el 75% de los varones y el 40% de las mujeres de inducido
TgK19GT
121; K19CreER
ratones a los 9-16 meses después de la inducción (Tabla 2 ). Sin embargo, a diferencia de
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones, la causa de la muerte fue la obstrucción de la vejiga debido a la alta expresión de K19 en las células intermedias y basales del epitelio de la vejiga (Figura S7B) y una alta frecuencia de desarrollo de adenoma en la vejiga (Tabla 3 y Figura 9 ). Curiosamente, se observó anteriormente inicio de adenoma vejiga urinaria en los hombres que en mujeres (9 meses frente a 14 meses después de la inducción; Tabla 3). El mecanismo subyacente es desconocido.
adenoma Vejiga urinaria, adenoma de pulmón, adenocarcinoma de estómago, carcinoma renal, y el intestino neoplasia intraepitelial (GIN), y lesiones en la próstata MPIN se muestran con aumentos bajos y altos. se observó leve hiperplasia del conducto pancreático en el páncreas como se indica por las flechas. Todas las muestras fueron teñidas con H & amp;. E
Discusión
Los estudios que utilizan génica específica de tejido de orientación en modelos de ratones genéticamente manipulados han contribuido en gran medida a nuestra comprensión de complejidad cáncer y la base molecular y celular de la tumorigénesis. Aquí se describe la generación de modelos de ratones transgénicos (
TgK18GT
121
y
TgK19GT
121
) utilizando genes reguladores de la transcripción de la queratina para conducir la inactivación-subtipo específico epitelial condicional de RB TS. Alta fidelidad de respectivos patrones de expresión de queratina específica se logró mediante transgenes BAC, que también fueron diseñados para evaluar los tejidos de interés a través de la expresión de GFP reportero. Se demuestra que estos modelos se pueden utilizar en combinación con controladores específicos Cre para iniciar la tumorigénesis en una amplia gama de tejidos epiteliales, ya sea en K19 o K18 subtipos que expresan. Además, demuestran que la inactivación de RB-TS de hecho puede provocar celular lesiones pre-cancerosas de manera autónoma en todos los tejidos epiteliales probados, incluyendo la inducción estrictamente de órganos adultos, y que la neoplasia temprana se asocia de manera uniforme con la proliferación y la apoptosis aberrante.
el uso de orientación en el subtipo específico, una amplia gama de K18 o K19 subtipos positivos dentro de los tejidos epiteliales fueron susceptibles a la inducción neoplásica por RB-TS inactivación. Ni
TgK18GT
121; β-actina Cre
ratones (hasta 6 meses) ni
TgK19GT
121; β-actina Cre
ratones (hasta 8 meses) desarrollaron adenomas o carcinomas. Estos resultados confirman que la RB-TS inactivación en el epitelio afectado sólo sirve para provocar un fenotipo neoplásico. Sobre la base de estudios previos de progresión del tumor en T
121 células-iniciados, esperamos que serán requeridos lesiones adicionales en genes específicos de cáncer para conducir este fenotipo neoplásico temprano en los respectivos tipos de cáncer.