Extracto
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) tiene un mal pronóstico y está asociado con altos niveles de angustia psicológica. Hemos demostrado que los receptores beta-adrenérgicos (β-ARS), que se activan por los neurotransmisores de estrés, regular las células PDAC a través de AMP cíclico (cAMP) de señalización dependiente de in vitro, que el estrés social promueve la progresión PDAC en xenoinjertos de ratón y que-γ aminobutírico ácido (GABA) inhibe estas respuestas in vitro e in vivo. La inhibición selectiva de las vías de regulación inducidos por el estrés puede abolir el impacto potencialmente negativo del estrés psicológico sobre los resultados clínicos. Nuestros datos actuales muestran que la exposición crónica de líneas celulares PDAC Panc-1 (activación de mutaciones puntuales en K-ras) y BxPC-3 (sin mutaciones en K-ras) in vitro a la epinefrina neurotransmisor estrés a la concentración (15 nM) previamente medido en el suero de ratones expuestos a aumentado significativamente el estrés social proliferación y la migración. Estas respuestas se inhibieron de una manera dependiente de la concentración por celecoxib. Los efectos de celecoxib solo y en combinación con ácido γ-aminobutírico (GABA) en la progresión de xenoinjertos subcutáneos de ratón de la línea celular (BxPC-3) más sensible a la epinefrina y luego se investigaron en presencia y ausencia de estrés social. factores estimulantes de cáncer (VEGF & amp; prostaglandina E
2 [PGE
2]) y los niveles de cAMP se midieron mediante inmunoensayos en sangre y el tejido de xenoinjerto. La fosforilación de las proteínas de señalización de ERK, CREB, Src, y Akt se evaluó mediante ensayos de ELISA y transferencia Western. La expresión de COX-2, 5-lipoxigenasa, y p-5-LOX se determinó por transferencia de Western semi-cuantitativa. Celecoxib solo progresión xenoinjerto significativamente inhibido y disminuyeron sistémica y tumores VEGF, PGE2, y el campamento, así como proteínas de señalización fosforilados en ratones expuestos al estrés y libre de estrés. Estas respuestas se han mejorado de manera significativa por co-tratamiento con GABA. La regulación a la baja celecoxib inducida de la proteína COX-2 y P-5-LOX también fue significativamente mayor de GABA, tanto en condiciones experimentales. Nuestros hallazgos identifican la inhibición selectiva de las vías inducidas por el estrés como un área prometedora para la intervención del cáncer más eficaces en el cáncer de páncreas
Visto:. Al-Wadei HAN, Al-Wadei MH, Ullah MF, Schuller HM (2012) celecoxib y GABA Cooperativamente prevenir la progresión del cáncer de páncreas in vitro y en modelos de xenoinjertos de sin estrés y el estrés ratones expuestos. PLoS ONE 7 (8): e43376. doi: 10.1371 /journal.pone.0043376
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Marzo, 2012; Aceptado: 23 de julio de 2012; Publicado: 16 Agosto 2012
Copyright: © Al-Wadei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto contó con el apoyo financiero de subvenciones RC1CA144640 y RO1CA042829 con el Instituto Nacional del cáncer. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es responsable de aproximadamente el 13% de las muertes en todo el mundo y sigue siendo la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, lo que representa casi una de cada cuatro muertes [1]. Estadísticamente, el cáncer de páncreas es la cuarta causa líder de muertes relacionadas con cáncer en los países desarrollados y tiene una tasa de supervivencia a 5 años por debajo del 5% [2], [3]. Es una de las enfermedades neoplásicas más mortales, como es típicamente asintomática hasta que se ha alcanzado una etapa avanzada cuando los tratamientos eficaces son infructuosos. En el momento del diagnóstico, la mayoría de los cánceres de páncreas son por lo tanto inoperable y han metástasis en órganos distantes. Además, esta malignidad es generalmente no responde a la radio-quimioterapia convencional y, lo que resulta en una tasa de mortalidad cercana al 100% dentro de los 6 meses del diagnóstico [3]. Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevas estrategias para la mejora de la intervención de cáncer de páncreas
El estrés psicológico como un modulador potencial de progresión del cáncer ha surgido recientemente como una nueva e importante área de investigación del cáncer [4] -. [6]. Así, se ha demostrado que el crecimiento y la progresión de los cánceres humanos más comunes, incluyendo adenocarcinoma del estómago [7], colon [8], de próstata [9], la glándula mamaria [10], [11], ovario [12] , pulmón [13], [14] y el páncreas [15], [16], se estimulan de manera significativa por el receptor beta-adrenérgico (β-AR) de señalización iniciada por el estrés neurotransmisores noradrenalina y adrenalina. También se ha demostrado que el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se activa en células de cáncer pancreático por la transactivación beta-adrenérgico, PKA dependiente de la EGFR [17]. Además, ß-ARs regulan la producción de ácido araquidónico (AA) en las células de cáncer de páncreas [15], lo que resulta en la formación de metabolitos de AA de cáncer estimulante. Recientes investigaciones en xenoinjertos de cáncer de páncreas de líneas de células BxPC-3 y Panc-1 en ratones expuestos a estrés social han revelado también la estimulación del crecimiento inducida por el estrés significativo de los xenoinjertos asociados con la activación de múltiples proteínas de señalización, incluyendo ERK, CREB, Src, y AKT [18], la mayoría de los cuales se sobreexpresa en el cáncer de páncreas [19] - [21]. Estos hallazgos sugieren que el estrés psicológico puede disminuir la eficacia de las estrategias de intervención cáncer. Por lo tanto, la inhibición selectiva de las cascadas de señalización inducidas por el estrés puede aliviar el impacto negativo del estrés sobre los resultados clínicos y también reducir significativamente la incidencia de cáncer de páncreas desarrollo en los individuos en situación de riesgo a causa de la diabetes preexistente, pancreatitis o tabaquismo crónico [22].
la ciclooxigenasa selectivo 2 (COX-2) bloques de celecoxib inhibidor de la formación de la Cox-2 mediada por metabolitos de AA de cáncer estimulante y ha demostrado actividad anti-tumor preclínica y clínica prometedora en una variedad de tumores humanos, incluyendo páncreas cáncer [23] - [25]. Celecoxib inhibe selectivamente la actividad de COX-2, que a su vez regula múltiples vías en el cáncer de páncreas [26]. Una fuerte evidencia, además, sugiere que la COX-2 juega también un papel importante en el desarrollo y la progresión de muchos tumores no pancreáticas [27]. COX-2 es altamente expresado en un número de cánceres humanos y líneas celulares de cáncer, como el de colon [28], gástrico [29], carcinoma epidermoide de cabeza y cuello [30], cervical [31], no pequeñas de pulmón de células [ ,,,0],32], de mama [33], de próstata [34], y cáncer de páncreas [35]. Por otro lado, el ácido gamma-amino butírico (GABA) actúa como el inhibidor fisiológico de la cascada de β-adrenérgico, un efecto transducidas intracelularmente en células de cáncer pancreático por la Gα
i-receptor acoplado serpentina GABA-B que disminuye la formación de AMP cíclico (AMPc) mediante la inhibición de la activación de la adenilato ciclasa [18], [36].
en el presente estudio, hemos investigado los efectos de la exposición crónica a la epinefrina neurotransmisor estrés a una concentración (15 nM ) medido previamente por nosotros en el suero de ratones expuestos a estrés social [18] sobre la proliferación y migración de las líneas de células PDAC Panc-1 y BxPC-3 in vitro y exploraron posibles efectos inhibidores de celecoxib en estas respuestas. A continuación, utiliza un método establecido para la inducción experimental de estrés social crónico, la forma predominante de estrés psicológico en las personas [37], en ratones que portan xenoinjertos de la línea celular (BxPC-3) que era más sensible a la epinefrina in vitro, a investigar los posibles efectos inhibidores de celecoxib y GABA solo y en combinación sobre la progresión de xenoinjerto en sin estrés y animales de estrés-expuesta. Celecoxib solo demostró fuertes efectos de cáncer de inhibición bajo estas dos condiciones experimentales, mientras que el tratamiento de combinación con GABA mejoró significativamente todos los resultados de prevención investigados. Este estudio tiene implicaciones para la progresión del cáncer y la prevención en poblaciones menores de malestar psicológico crónico debido a los problemas socio-económicos y personales, que se agravará aún más cuando una persona se le diagnostica una enfermedad potencialmente mortal como el cáncer de páncreas
.
materiales y Métodos
Cultura de líneas celulares de cáncer
Los (Radil, Columbia, MO), líneas celulares de cáncer de páncreas humanos autenticados BxPC-3 (witout ras) y Panc-1 (expresa que activan mutaciones puntuales en K-ras) originalmente compradas en la American Type Culture Collection (Rockville, MD) se cultivaron en medio RPMI-1640 con suero bovino fetal al 10% sin antibióticos.
investigaciones in vitro
A) Determinación de la proliferación celular mediante el ensayo de MTT
.
El 3- (4, 5-diméthyle tiazol-2-il) -2, 5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT) ensayo colorimétrico (Sigma) se utilizó como se describe anteriormente [38] para evaluar el crecimiento efectos de la exposición crónica epinefrina y potenciales efectos inhibidores de celecoxib en esta respuesta en las células Panc-1 y BxPC-3 in vitro estimulante. Brevemente, las células Panc-1 y BxPC-3 se sembraron en placas de 6 pocillos (50.000 células por pocillo). Las células fueron pretratadas con 15 epinefrina nM durante 7 días (medio que contiene epinefrina fue reemplazado cada 24 horas) o se cultivaron durante 7 días sin epinefrina. A continuación se añadió Celecoxib (1 nM a 100 mM) a las células de ambos grupos de tratamiento. Tras un período de incubación de 72 horas, se recogieron todas las células.
B) Valoración de la migración celular mediante un ensayo colorimétrico.
ensayos de migración celular se realizaron como se describe anteriormente [36], el uso de 6 pocillos placas con los cartuchos de filtro proporcionados por el kit de ensayo de migración celular colorimétrico (célula Biolabs, San Diego, CA, EE.UU.). células Panc-1 y BxPC-3 fueron pretratados con 15 epinefrina nM durante 7 días (medio que contiene epinefrina fue reemplazado cada 24 horas) en matraces de cultivo de tejidos o de cultivo sin epinefrina durante 7 días. Las células de ambos grupos de tratamiento fueron luego sembradas en los insertos y se trataron con celecoxib (1 nM a 100 mM) durante 24 horas. A continuación, la capacidad migratoria de las células se evaluó siguiendo las instrucciones del proveedor.
C) La evaluación estadística de los datos in vitro.
Los datos (n =. 5) en la columna gráficos (figura 1) de la la proliferación de células y ensayos de migración celular en presencia y ausencia de tratamiento epinefrina crónica fueron evaluados por análisis unidireccional de la varianza seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunn. De datos (n = 5) a partir de los experimentos de dosis-respuesta (Fig. 2) con celecoxib se ajustaron a las curvas de dosis-respuesta sigmoidal y CE
50 valores de celecoxib se calcularon por análisis de regresión no lineal utilizando el software Prism GraphPad.
Los ensayos de MTT (a) en Panc-1 (con la activación de mutaciones puntuales en K-ras) y células BxPC-3 (sin mutaciones ras) in vitro. La exposición durante 7 días a la epinefrina (15 nM) significativamente (
p
& lt; 0,001) aumentó el número de células viables en ambas líneas celulares. El celecoxib inhibidor de la COX-2 (1 M) bloqueó completamente esta respuesta a la epinefrina (
p
& lt; 0,001), mientras que, además, la reducción de (
p
& lt; 0,001) el número de células viables en células no pre-tratados con epinefrina. Los efectos de los tratamientos idénticos en la migración de células se muestran en la Fig. B. En tanto la migración líneas de células fue significativamente más estimulada por epinefrina crónica de la proliferación celular. Celecoxib significativamente (
p Hotel & lt; 0,001) redujo la migración inducida por epinefrina, pero no bloqueó completamente esta respuesta. CMPC-3 células fueron ligeramente más sensible a la epinefrina en ambos ensayos, pero las diferencias entre las dos líneas celulares no fueron significativas. Las columnas son los valores medios y desviaciones estándar de 5 muestras por grupo de tratamiento.
Respuesta a la dosis-curvas de celecoxib en Panc-1 y BxPC 3-células in vitro en presencia y ausencia de tratamiento previo durante 7 días con epinefrina (15 nM). Figuras A y B muestran las respuestas de proliferación celular en ensayos de MTT mientras que las figuras C y D muestran respuestas migración celular. Si bien ambas respuestas celulares fueron similares entre las dos líneas celulares, EC valores
50 para celecoxib en las Figs. B, C y D fueron significativamente (
p
& lt; 0,001) menor en las células tratadas previamente durante 7 días con epinefrina. Los puntos de datos son valores medios y las desviaciones estándar (n = 5). CE
50 valores y ajuste de la curva se estableció mediante análisis de regresión no lineal de dosis-respuesta sigmoidal.
En Vivo Investigaciones
Un Experimento con animales).
Seis semanas de edad ratones desnudos atímicos macho se adquirieron de Harlan Sprague Dawley. El protocolo de investigación animal fue aprobado por la Universidad de Tennessee Institucional Cuidado de Animales y el empleo. Los ratones fueron aclimatadas durante 1 semana y mantenido en nuestra instalación de animales de laboratorio de acuerdo con las directrices de la American Association of Laboratory Animal Care en condiciones normales de laboratorio en el que se controlan la temperatura, la humedad y la luz, y tuvieron libre acceso al autoclave Purina Rodent Chow los alimentos y el agua tratada en autoclave. Después de la 1-semana de aclimatación, los oídos de los ratones fueron etiquetados para facilitar el seguimiento de cada animal, que luego fue asignado aleatoriamente a seis grupos de tratamiento (
n
= 20), con 5 ratones por jaula. Antes de la inoculación de células tumorales, los ratones en los tres grupos de estrés psicológicos fueron expuestos a estrés social para 4 semanas de acuerdo con el procedimiento publicado [37] al cambiar la composición del grupo de cada jaula dos veces a la semana. BxPC-3 células que habían alcanzado 75% de confluencia en cultivo se inocularon por vía subcutánea en la región de flanco (3 × 10
6 en 0,2 ml de PBS, la viabilidad & gt; 95%) de los animales de cada uno de estos grupos. El estrés social se continuó en estos tres grupos por otros 30 días. Otros tres grupos de ratones que no fueron expuestos al estrés social también se inocularon con números idénticos de cáncer de páncreas BxPC-3 células. Un grupo cada uno del estrés social y las poblaciones de estrés no sociales se trata con inyecciones intraperitoneales de celecoxib (Celebrex, de Pfizer; 25 mg /Kg de peso corporal, 5 días /semana durante 30 días). Además, un grupo cada una de las estrés social y no sociales poblaciones de estrés se trató simultáneamente por inyección intraperitoneal iniciales de celecoxib (25 mg /Kg de peso corporal, 5 días /semana durante 30 días) y luego GABA (Sigma; 10 mg /Kg de peso corporal , 5 días /semana durante 30 días) inmediatamente después, en el lado opuesto del ratón. Se observaron todos los animales durante 30 días después de la inoculación con células cancerosas. tamaños de los tumores se evaluaron semanalmente por el calibrador digital, y dos diámetros perpendiculares (longitud y anchura) de cada xenoinjerto se midieron utilizando la siguiente fórmula: volumen del tumor = (longitud /2) x (anchura
2). El peso de los animales fue seguida durante todo el experimento para controlar su estado de salud general y para GABA y tratamiento celecoxib efectos. Al final del período de observación de 30 días, los animales fueron sacrificados por CO
2 inhalación. Se recogieron muestras de sangre para la determinación de los neurotransmisores, factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), y la prostaglandina E
2 (PGE
2) en el suero y de cAMP en la fracción celular de la sangre. Los tumores fueron extirpados, broche de congelados en nitrógeno líquido, y se almacena a -80 ° C para análisis posteriores.
B) Los inmunoensayos para el análisis cuantitativo de la segunda mensajero AMPc, VEGF, PGE2, y proteínas de señalización fosforilados .
VEGF y PGE
2 en muestras de suero y de tejido tumoral y cAMP en la fracción celular de muestras de sangre y los tejidos tumorales se analizaron mediante inmunoensayos como se recomienda por el fabricante (Enzo Life Sciences International). En resumen, el kit para la medición de cAMP utiliza un anticuerpo policlonal para unirse de forma competitiva el cAMP en los estándares y muestras. El kit para la medición de VEGF utiliza el anticuerpo monoclonal para VEGF humano inmovilizado en una placa de microtitulación de obligar a la VEGF en los estándares o muestras. El kit de PGE
2 utiliza un anticuerpo monoclonal para PGE
2 para unirse de forma competitiva los PGE
2 en las muestras y estándares. Las absorbancias se leyeron con un lector de ELISA a 405 nm para cAMP, 450 nm para la PGE
2, y a 450 nm para el VEGF (
n
= 5 por grupo de tratamiento). Detección y cuantificación de los niveles de p-ERK-1/2 en la treonina 202 y la tirosina 204, p-CREB en serina en 133, y p-Akt en el residuo serina 473 (Invitrogen); y la actividad quinasa del dominio catalítico recombinante de p-Src (MBL International) se llevaron a cabo a partir de muestras de tejido tumoral (
n
= 5 por grupo de tratamiento) se homogeneizaron en tampón RIPA y los inhibidores de proteasa como se recomienda por los fabricantes. Se leyó la absorbancia con un lector ELISA a 450 nm. Suero y tumorales niveles de la tensión neurotransmisores noradrenalina y adrenalina, así como GABA se determinaron mediante ensayos de ELISA como se describe anteriormente [14], [18] para vigilar la inducción exitosa de estrés psicológico (datos no mostrados).
C) análisis semicuantitativo de la COX-2, 5-lipooxigenasa (5-LOX) y p-5-LOX, y la visualización no cuantitativa de proteínas de señalización por el Western Blot.
se realizaron tres transferencias de Western independientes para cada anticuerpo para la evaluación semi-cuantitativa de la expresión de la proteína mediante densitometría para las enzimas metabolizadoras de AA COX-2 y P-5-LOX, utilizando NIH Image software J. Además, la expresión de proteínas de las moléculas de señalización se cuantificó mediante ELISA por encima de los ensayos se visualizó mediante transferencias de Western no cuantitativos. En resumen, los tejidos tumorales se homogeneizaron brevemente en tampón de lisis RIPA (Thermo Scientific), PMSF, Na
3Vo
4, y 1 mg /ml de aprotinina, leupeptina, y pepstatina. Después de desnaturalización por calor a 100 ° C durante 5 min, cantidades iguales de proteína se sometieron a electroforesis utilizando geles de 12% Novex SDS-poliacrilamida (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa; Western blots fueron entonces a cabo utilizando la incubación durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: ERK1 /2, p-ERK1 /2, p-CREB total AKT p-AKT, Src, p-Src, COX-2, 5- LOX, y p-5-LOX (Señalización celular). CREB total y la actina se adquirieron de Millipore. Los anticuerpos secundarios se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas se visualizaron por ECL (Pierce, Thermo Scientific).
D) Análisis estadístico de los datos in vivo.
El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad INSTAT (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.). Para probar si la variación entre las medianas de columna de volúmenes de los tumores en los seis grupos de tratamiento (
n
= 20) fue significativamente mayor de lo esperado por casualidad, no paramétrico de Kruskal-Wallis ANOVA se realizó para los datos de cada una de las 4 semanas después de la inyección de las células tumorales. Las diferencias entre los pares seleccionados de los grupos de tratamiento se evaluaron, además, por la prueba de Mann-Whitney no paramétrico. La significación estadística de las diferencias entre los grupos para los niveles de cAMP (
n = página 5), PGE
2 (
n = página 5), y VEGF (
n =
5) en la sangre y los tejidos de xenoinjerto y para p-ERK, p-CREB, p-Src, y p-AKT en el tejido tumoral (
n
= 5 por grupo de tratamiento) se evaluó mediante la prueba de Mann no paramétrico -Whitney prueba. La significación estadística de las diferencias entre cuatro lecturas densitométricas por banda de proteína a partir de tres transferencias de Western independientes para la evaluación semi-cuantitativa de la COX-2 y P-5-LOX preparado a partir de tres xenoinjertos de seleccionados al azar por grupo de tratamiento (
n =
12) se evaluó mediante la prueba de Mann-Whitney no paramétrico.
resultados
la exposición crónica al Aumenta la adrenalina y la proliferación de células Celecoxib inhibe la migración y
la exposición crónica de Panc células -1 y BxPC-3 a la epinefrina significativamente (
p
& lt; 0,0001) aumento de la proliferación celular y la migración, con BxPC-3 células de ser más sensible a la epinefrina en ambos ensayos (Fig. 1). El tratamiento de las células con celecoxib (1 M) abolió completamente estas respuestas en las dos líneas celulares (
p
& lt; 0,001) (Fig. 1). Celecoxib (1 M) también significativamente (
p
& lt; 0,001) inhibió la proliferación celular y la migración en las células unpretraeted de ambas líneas celulares (Fig. 1). Como se muestra en las curvas de dosis-respuesta (Fig. 2), celecoxib inhibió la proliferación celular y la migración en ambas líneas celulares en presencia y ausencia de pre0treatment epinefrina crónica de una manera dependiente de la concentración. El número de células viables y migrados en células pretratadas de epinefrina de las dos líneas celulares fueron significativamente (
p
& lt; 0,001) mayor que en las células unpretreated en todas las concentraciones de celecoxib probados, que ilustran el fuerte PDAC efectos de la epinefrina estimulante (Fig . 2). Al mismo tiempo, la CE
50 valores para celecoxib fueron significativamente (
p
& lt; 0,001) inferiores en células pretratadas de epinefrina de ambas líneas celulares que en las células unpretreated (Fig. 2), lo que sugiere una fuerte dependencia de la migración inducida por epinefrina en metabolitos del ácido araquidónico mediada por la COX-2.
La modulación de xenoinjertos volúmenes de celecoxib y GABA en ratones con el estrés expuestos y no acentuadas
el análisis estadístico de los datos de los seis grupos de tratamiento por no paramétrico ANOVA produjeron variaciones entre las medias de las columnas de manera significativa (
p Hotel & lt; 0,0001) mayor de lo esperado por azar en cada uno de los observados 4 semanas. Como se informó anteriormente [18], la progresión del crecimiento de xenoinjertos de la línea celular de cáncer de páncreas BxPC-3 fue significativamente (semana 1:
p Hotel & lt; 0,006; 2-4 semanas:
p
& lt; 0,0001 mediante la prueba de Mann-Whitney) promovido por el estrés psicológico durante todo el período de observación de 4 semanas (Fig 3).. El tratamiento de animales no estresados con celecoxib solo significativamente (
p Hotel & lt; 0,0001) redujo los tamaños de xenoinjertos en todos los intervalos de tiempo medidos. Además, el celecoxib sola redujo tamaños de xenoinjertos en ratones expuestos al estrés por debajo de los niveles de los animales no tratados, sin estrés (
p Hotel & lt; 0,001 en cada una de las 4 semanas que se ha observado). El tratamiento de ratones sin estrés con celecoxib en combinación con el GABA mejora aún más el crecimiento de inhibición de los efectos de celecoxib (semana 1:
p Hotel & lt; 0,0376; 2-4 semanas:
p Hotel & lt; 0,0001) . Del mismo modo, el tratamiento conjunto con el GABA también aumentó los efectos del cáncer de inhibición de celecoxib en el grupo expuesto al estrés (
p Hotel & lt; 0,0001 en las semanas 1-4).
Los animales fueron expuestos a estrés social (SS) o no expuestos a estrés (NS) en presencia y ausencia de celecoxib (C) o celecoxib y tratamiento GABA (C + G). El volumen de xenoinjertos se incrementó significativamente (
p Hotel & lt; 0,0001) por el estrés social. Esta respuesta se inhibió significativamente por el tratamiento con celecoxib solo (
p Hotel & lt; 0,001), o por el celecoxib y el GABA (
p Hotel & lt; 0,0001). En general, las diferencias en los volúmenes de los tumores eran estadísticamente significativa (
p
& lt; 0,001) entre los grupos tratados y no tratados. Las fotografías muestran ejemplos representativos de xenoinjertos para cada grupo de tratamiento.
La modulación de los niveles de cAMP y PGE2 en suero y tejido tumoral con Celecoxib y GABA en ratones con el estrés expuestos y no acentuadas
Beta- agonistas adrenérgicos activan la producción de AA en las células de cáncer de páncreas, lo que lleva a la formación mediada por la COX-2 de PGE2 [15]. los receptores beta-adrenérgicos [39], así como los receptores de PGE2 [40] están acoplados al estimulador de la proteína G Gαs que aumenta los niveles de AMPc a través de la activación de la adenilato ciclasa. Por lo tanto, medimos cAMP en la fracción celular de la sangre y tumor de tejidos y PGE2 en los tejidos tumorales de suero y por ensayos ELISA. Nuestros datos muestran que los niveles sistémicos de cAMP en las muestras de sangre y tejidos tumorales fueron significativamente (
p
& lt; 0,001) mayor (2,8 veces en la sangre y de 2,5 veces en los tejidos tumorales) en los ratones expuestos a estrés . Esta respuesta de estrés en las células de la sangre y los tumores fue significativamente (
p Hotel & lt; 0,001) redujo mediante el tratamiento con celecoxib solo, un efecto aún mayor (
p Hotel & lt; 0,001) por la combinación con el GABA (Fig. 4A). Los niveles observados de PGE2 en los tejidos tumorales séricos y siguieron un patrón similar, con un peso significativo (
p Hotel & lt; 0,0001) aumenta en los animales expuestos a estrés, respuestas significativamente (
p Hotel & lt; 0,001 ) reducida por celecoxib solo y disminuye aún más por la combinación de celecoxib /GABA (Fig. 4B). El tratamiento combinado de celecoxib /GABA, además, significativamente (
p Hotel & lt; 0,001). Reducido los niveles sistémicos y tumorales de cAMP y PGE2 en ratones sin tensión (Fig. 4A, 4B)
cAMP se evaluó en el fracción celular de la sangre y en los tejidos de xenoinjerto (a) y los niveles de PGE
2 en el suero y tejidos de xenoinjerto (B). El estrés social aumentó los niveles de ambos factores significativamente (
p Hotel & lt; 0,001), las respuestas significativamente (
p Hotel & lt; 0,001) reducida por celecoxib. En combinación con celecoxib /GABA significativamente (
p Hotel & lt; 0,001) mejora los efectos inhibidores de celecoxib (
p Hotel & lt; 0,001) en los niveles sistémicos y tumorales de cAMP y PGE2 en el estrés libre de estrés y social -exposed ratones. Las columnas son los valores medios y desviación estándar de 5 muestras seleccionadas al azar por cada grupo de tratamiento.
regulación a la baja de fosforilados proteínas de señalización en los tejidos tumorales de celecoxib y GABA en ratones con el estrés expuestos y no acentuadas
se ha demostrado previamente que la señalización de β-adrenérgico fosforila múltiples proteínas de señalización en células de cáncer de páncreas humano in vitro, incluyendo CREB, ERK, Akt, y Src [17], [38] y que están también indujo las formas fosforiladas de estas proteínas en xenoinjertos de cáncer de páncreas de ratones con el estrés expuesta [18]. Por lo tanto, visualizamos la expresión de las formas fosforiladas y no fosforiladas de estas proteínas en los tejidos tumorales por transferencia de Western y se determinó cambios cuantitativos en los niveles de fosforilación por ensayos ELISA. La tensión inducida (
p
& lt; 0,0001) la fosforilación de cada una de estas proteínas de señalización investigados fue significativamente (
p
& lt; 0,0001) redujo mediante el tratamiento con celcoxib solo, un efecto significativamente (
p
& lt; 0,0001) incrementado en el tratamiento adicional con GABA (Fig 5 A-D).. Además, el tratamiento con celecoxib y GABA significativamente combinado (
p
& lt; 0,0001). Disminución de la expresión de las formas fosforiladas de todas las proteínas de señalización investigados en ratones no expuestos a estrés (Fig. 5 A-D)
transferencias de Western (a y B) de inducción que ilustra de p-ERK, p-CREB, p-AKT y p-Src por el estrés social y la inhibición de estas respuestas por celcoxib solo o celecoxib + GABA. La evaluación cuantitativa de estos cambios en el nivel de proteína se determinó en los ensayos de ELISA se muestran en la Figura C y D. La inducción de todas las proteínas fosforiladas investigados por el estrés social (SS) fue significativa (
p Hotel & lt; 0,001). La inhibición de estas respuestas por celcoxib solo o la combinación de celecoxib + GABA fueron significativas (
p
& lt; 0,001) para todas las proteínas fosforiladas. Las columnas de los gráficos (C y D) son valores medios y desviación estándar de inmunoensayos ELISA cuantitativos a partir de cinco xenoinjertos seleccionados al azar por grupo de tratamiento.
La modulación de la COX-2 y la 5-LOX en el tejido tumoral por Celecoxib y GABA en el estrés expuestos y no acentuadas ratones
la enzima COX-2 cataliza la formación de prostaglandinas tales como PGE2 de AA, mientras que 5-LOX media la conversión metabólica de AA para los leucotrienos [41]. Ambas enzimas son frecuentemente sobreexpresados en el cáncer de páncreas [42], y la fosforilación de 5-LOX en Ser-271 es promovida por AA, un proceso catalizado por varias quinasas, incluyendo PKA [43]. Por ello, investigó los niveles de expresión de COX-2, 5-LOX, y p-5-LOX por análisis de Western semicuantitativa en los seis grupos de tratamiento de nuestro experimento. Nuestros datos muestran que el estrés significativamente (
p
& lt; 0,0001) inducida por la expresión de COX-2 y P-5-LOX (2,7 veces y 2,9 veces, respectivamente; la Fig. 6A, 6B). Celecoxib solo significativamente (
p
& lt; 0,001) la reducción de la regulación positiva inducida por el estrés de la COX-2, un efecto significativamente (
p
& lt; 0,001) mejorado por el tratamiento adicional con el GABA (Fig . 6A, 6B). Además, el tratamiento combinado con celecoxib y GABA significativamente (
p
& lt; 0,0001) downregulated la expresión de COX-2 (0,4 veces) y p-5-LOX (0,5 veces) en los ratones no expuestos al estrés .
transferencia Western (A) es representativa de tres transferencias independientes preparados a partir de tres xenoinjertos de seleccionados al azar por grupo de tratamiento. densitometría semi-cuantitativo de las bandas de tres transferencias de Western independientes mostró significativa (
p Hotel & lt; 0,0001) aumentos en la expresión de proteínas por estrés social. Estas respuestas a su vez, se redujo significativamente por el tratamiento con celecoxib solo (
p
& lt; 0,001) o por celecoxib y GABA (
p
& lt; 0,0001). Las columnas en el gráfico (B) son valores medios y desviación estándar de cuatro lecturas densitométricas por banda ajustados para la actina en las transferencias independientes preparados a partir de tres xenoinjertos seleccionados al azar por grupo de tratamiento.
modulación de los niveles de VEGF en suero y el tumor de tejido por Celecoxib y GABA en ratones con el estrés expuesta y no acentuadas
VEGF es el factor de crecimiento angiogénico más potente y específico [44]. El estrés social significativamente (
p
y lt; 0,001) aumentó los niveles de VEGF tanto en el suero (1,8 veces) y xenoinjertos (1,7 veces) de ratones portadores de xenoinjertos de la línea celular BxPC-3. Celecoxib solo significativamente (
p
& lt; 0,001) redujo tanto las respuestas mientras que el tratamiento de combinación con celecoxib /GABA bloqueó completamente la inducción inducida por el estrés de VEGF en suero y tejido tumoral (Fig. 7). Además, celecoxib, más GABA significativamente (
p
& lt; 0,001) la reducción de VEGF debajo de los niveles de base (
p
& lt; 0,001). En ratones sin tensión (Fig. 7)
estrés Social significativamente (
p
& lt; 0,001) aumento de los niveles de VEGF en suero y xenoinjertos, una respuesta reducida de manera significativa por celecoxib (C,
p
& lt; 0,001), mientras que celecoxib y GABA ( G tratamiento C +) bloqueó completamente la inducción inducida por el estrés de VEGF en el tejido suero y tumor. Además, celecoxib, más GABA redujeron significativamente por debajo de los niveles basales de VEGF en ratones no expuestos a estrés (
p Hotel & lt; 0,001). Las columnas son los valores medios y desviación estándar de cinco muestras seleccionadas al azar por cada grupo de tratamiento.
Discusión
Nuestros datos generados in vitro y en modelos de xenoinjerto de ratón sugieren, por primera vez, que la exposición crónica a la epinefrina por el estrés psicológico estimular significativamente la progresión de la PDAC a través de mecanismos accionados principalmente por metabolitos del ácido araquidónico de la COX-2 dependientes. Además, nuestra in vitro identificar, tanto la proliferación celular y la migración como mecanismos implicados en la progresión del PDAC inducida por el estrés. En conjunto, nuestros resultados sugieren que los selectivos de la COX-2 celecoxib puede tener fuertes efectos inhibitorios sobre la progresión inducida por el estrés de PDAC y que el tratamiento de combinación de este agente con el neurotransmisor GABA inhibidor pueden mejorar significativamente los resultados clínicos en ausencia y presencia de factores psicológicos estrés.