Extracto
El microambiente tumoral, incluyendo las células estromales, que rodea los vasos sanguíneos y los componentes de la matriz extracelular, se ha definido como un factor crucial que influye en la proliferación, la resistencia a las drogas, la invasión y la metástasis de las células epiteliales malignas. Entre otros factores, se ha informado de las comunicaciones y la interacción entre las células cancerosas y las células del estroma de jugar papeles clave en la promoción y progresión del cáncer. Para investigar estas relaciones, un modelo de co-cultivo en el chip fue desarrollado para estudiar la interacción celular entre células de carcinoma de pulmón A549 humano y las células epiteliales de pulmón de células MRC-5-humanos, tanto en condiciones normales de proliferación y de tratamiento. En resumen, un dispositivo de co-cultivo que consta de 2 cámaras fluídicos individuales en paralelo, que se separaron por una cerca de 100 micras se utilizó para el patrón celular. Microelectrodos arrays se instalaron dentro de cada cámara incluyendo electrodos a diferentes distancias de distancia de la línea de enfrentamiento para la evaluación de detección impedimétrico electroquímica de influencia de célula a célula. Después de la valla se eliminó y el contacto de célula a célula se produjo, mediante la evaluación de las respuestas de la señal de impedancia que representan la condición celular y el comportamiento, se investigaron las dos interacciones directas e indirectas de célula a célula a través de medios condicionados. El impacto de las distancias específicas que conducen a diferentes influencias de células de fibroblastos en las células cancerosas en el entorno de co-cultivo también se definió
Visto:. Tran TB, Baek C, Min J impedancia (2016) eléctrico de pila de sustrato Sensing (IEM) con microelectrodos matrices de Investigación de Cancer Cell - Interacción fibroblastos. PLoS ONE 11 (4): e0153813. doi: 10.1371 /journal.pone.0153813
Editor: Jonghoon Choi, Universidad Chunag-Ang, República de Corea
Recibido: 12 de febrero de 2016; Aceptado: 4 Abril de 2016; Publicado: 18 de abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Tran et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Centro de investigación de Salud BioNano-Guard, financiado por el Ministerio de Ciencia, ICT & amp; Planificación futura (MSIP) de Corea como Proyecto Frontier Global (H-GUARD_2015M3A6B2063548) y fue apoyado por el Programa de Desarrollo de Tecnología nanomaterial a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el gobierno de Corea (MSIP) (NRF-2014M3A7B4051907).
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cada vez hay más pruebas que demuestran que el microambiente tumoral, incluyendo las células del estroma, células inflamatorias, extracelular. matriz (ECM), las citoquinas, los vasos y factores de crecimiento, juega un papel importante en la iniciación, progresión y la invasión del cáncer [1-3]. Durante la tumorigénesis, las células cancerosas interactúan de forma dinámica y la zona de células estromales, tales como fibroblastos, células adiposas y células inmunes residentes. Entre estos, los fibroblastos forman el mayor grupo de células del estroma y parecen funcionar un lugar destacado en la progresión del cáncer [4-5].
En primer lugar se describe en el finales de los 19
siglo XX, los fibroblastos son alargados, no vascular , las células no epiteliales y no inflamatorias del tejido conectivo con procesos celulares largos que muestran un fusiforme o la forma de huso como en perfil. Los fibroblastos desempeñan muchas funciones importantes, incluyendo la deposición de ECM, la regulación de la diferenciación del epitelio, y la regulación de la inflamación; También están implicados en la cicatrización de heridas [5]. Durante la proliferación normal en los órganos sanos, fibroblastos sintetizan y secretan varios tipos de colágenos (es decir, los tipos I, III y V), así como la fibronectina y proteoglicanos, que son los constituyentes esenciales de la ECM [6]. Los fibroblastos también secretan el colágeno tipo IV y laminina, que ayudan en la formación de la membrana basal [7]. En los órganos heridos, fibroblastos desempeñan un papel importante en el proceso de curación por la invasión de las lesiones y la generación de ECM para servir como un andamio para otras células [8].
En la etapa temprana de la tumorigénesis, las células cancerosas forman una lesión neoplásica dentro de los límites de la membrana basal, pero separados del tejido circundante [9]. La membrana basal, fibroblastos, células inmunes, capilares y ECM que rodean a las células cancerosas forman una zona que se llama el microambiente tumoral. Como la principal fuente de componentes de ECM, los fibroblastos se definen como un componente celular clave de tumores. En asociación con las células cancerosas, los fibroblastos normales pueden adquirir un fenotipo perpetuamente activado por comunicación directa célula-célula o por diversos estímulos que surgen cuando se produce la lesión del tejido [10]. fibroblastos activados exhiben la UP-regulaciones de metaloproteinasas-2 ECM-degradantes de matriz, 3 y 9 (MMP-2, MMP-3 y MMP-9), así como muchos factores de crecimiento, que inducen las señales de proliferación de las células epiteliales adyacentes [11] . A partir de esta estrecha asociación, surge una pregunta acerca de las interacciones celulares heterotípicos entre las células tumorales y fibroblastos en el microambiente tumoral. En la última década, una serie de estudios de investigación han aclarado el efecto de los fibroblastos sobre diversos aspectos del comportamiento de las células del cáncer que incluyen la proliferación, angiogénesis, invasión, metástasis y la resistencia a los medicamentos; Sin embargo, el comportamiento de las células de cáncer aún no se ha explicado por completo. Prominente, Stoker et al. (1966), Wadlow et al. (2009) y Flaberg et al. (2011, 2012) han mostrado que los fibroblastos normales pueden inhibir el crecimiento de células de cáncer de
in vitro Opiniones y que denominaron este efecto como la supresión vecino [12-15]. Flaberg et al. (2012) diseñaron un ensayo de co-cultivo con células tumorales marcadas con H2A-mRFP en una mono-capa de fibroblastos [15]. En el transcurso de 62,5 h, las células tumorales proliferación y motilidad se inhibieron significativamente por los fibroblastos a través de la interacción directa de célula a célula. Para entender totalmente estos efectos, que conjeturamos si existe una interacción indirecta entre vecino fibroblastos y células cancerosas, que hemos denominado como un efecto de la distancia. La hipótesis propuesta es que el efecto inhibidor de los fibroblastos en las células cancerosas es una función de la distancia entre estos 2 tipos de células en un microambiente estromal común.
En este estudio, se propuso un modelo simple de co-cultivo con embebido matrices de alto rendimiento de microelectrodos (MEA) con una impedancia de detección de células-sustrato eléctrica (IEM) de ensayo (figura 1) para supervisar las condiciones de células tumorales de forma continua cuando se enfrentan a los cultivos de fibroblastos. Este método de detección eléctrica se utilizó en este estudio debido a las ventajas importantes; este método no es invasivo, simple de instalar, fácil de realizar, extraordinariamente sensible a las condiciones celulares y capaz de monitoreo en tiempo real [16,17]. El MEA eran iguales en ambos lados de las zonas de cultivo de células a varias distancias de la línea de separación. Durante las interacciones de las células, cada electrodo registra continuamente una señal de impedancia a través de un sistema de adquisición de datos de alto rendimiento. Este tipo de datos impedimétrico ha sido reconocido para reflejar la adhesión celular, la difusión, la proliferación y la viabilidad en condiciones de tratamiento con toxinas ambientales, fármacos y productos químicos, así como otras sustancias
(A) matrices de microelectrodos (1.: electrodo, 2 de trabajo: contraelectrodo común) se fabricaron en portaobjetos de vidrio experimentales (76mm x 52mm) por procesos de fotolitografía comunes. SU-8 fotorresistente se utilizó como capa de pasivación para cubrir las trazas conductoras. (B) La plataforma de detección fue dividido en 2 zonas, una para las células cancerosas y una para agentes microambiente. Varios electrodos de trabajo-Mirco tamaño se instalaron en cada área a diferentes distancias: 100, 250, 650, 1450 y 3050μm lejos de la línea de enfrentamiento. (C) un solo electrodo era 100μm de diámetro. (D) Una imagen de un chip real después de la co-cultivo de 2 tipos diferentes de células en 2 lados. (E) El proceso de modelado de co-cultivo usando un molde de doble cámara. (E
1) Después de tratar la superficie para el cultivo celular, el chip de células se puso en el accesorio diseñado, y el molde de doble cámara se fijó en la ubicación adecuada por medio de tornillos. Las 2 cámaras estaban separados entre sí por una pared de espesor 100μm para el patrón celular. (E
2) Después de que las células, tanto en cámara habían unido a la superficie del chip, el molde de doble cámara fue reemplazado por un depósito bien de tipo abierto. Una cama de PDMS se instaló también para evitar que la solución se filtre. El chip celular se conecta al sistema de medición y se mantuvo en la incubadora durante las mediciones.
En este estudio, se demostró el efecto inhibidor de MRC-5 fibroblastos de pulmón humano sobre la proliferación normal de A549 células de cáncer de pulmón humano. Se determinaron las diferencias señal de impedancia para demostrar indirectamente el efecto de la distancia entre las células A549 MRC-5 y en un entorno de co-cultivo. En particular, en las condiciones de tratamiento de drogas, también se observó una supresión intensiva en la interacción directa de fibroblastos-cáncer, que fue mayor que la ejercida por interacción indirecta. Además, el efecto inhibidor de los fibroblastos se confirmó usando la fluorescencia de células activadas por la clasificación método (FACS) en un modelo de cultivo mixto. Nuestro estudio fue dirigido a simular un
Materiales y Métodos
sobre la progresión tumoral con un novedoso de detección y la técnica de análisis en el dominio de tiempo real. > MEA fabricación
El patrón de MEA se fabrica sobre portaobjetos de vidrio (52 mm x 76 mm) por procesos de fotolitografía comunes usando AZ-5214E (MicroChemicals GmbH, Alemania) como un fotoprotector negativo para un procedimiento de despegado. El patrón fue seguido por la deposición de una /500 Å 250 Å Ti /Au bi-capa mediante el uso de un sistema de evaporación de haz de electrones, y las porciones que no sean necesarios fueron selectivos eliminado en acetona. Después se formaron los electrodos, se realizó un segundo paso de fotolitografía para aplicar una gruesa capa de 2 micras de SU-8 2002 (MicroChem, EE.UU.) como una capa de aislamiento para las trazas de oro, dejando sólo las matrices de electrodos y almohadillas de contacto expodes.
cultivo de células
MRC-5 fibroblastos de pulmón humano y células de cáncer de pulmón humano A549 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco ) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS, Gibco) y 1% de antibióticos /antimicóticos (Gibco). Estas células se mantuvieron en condiciones de 37 ° C y de 5% de CO
2 y sub-cultivadas en el tratamiento de la solución de tripsina-EDTA (Gibco). El número de células se contó con el Cellometer (Cellometer Auto T4, EE.UU.).
patrón de la célula en el chip MEA
En este estudio, la célula fue modelado utilizando un método de barrera física común para crear regiones libres de células para la migración celular colectiva [18]. Una barrera física se aplicó antes de la siembra de células a bloque de mezcla de células, y la eliminación de la barrera física inicia el proceso de migración celular y la confrontación. accesorios de acrílico para el chip celular y el molde de doble cámara fueron diseñados utilizando AutoCAD y fueron fabricados utilizando una fresadora CNC (Figura 1E). Antes de ser utilizado para el cultivo celular, todos los dispositivos se esterilizaron en un baño de alcohol y se secaron en un horno con luz UV. Después de que el molde de doble cámara se fijó a la viruta de células en la posición adecuada mediante tornillos, cada cámara se trató con una solución de colágeno (10%) durante 15 min a temperatura ambiente para promover la adhesión celular. A continuación, las cámaras se lavaron con 1X PBS, y se inyectaron los 2 tipos de suspensión de células (5 × 10
5 células /cámara) en las 2 cámaras separadas. Después de 12 h, cuando ambos tipos de células se habían unido bien y se habían formado una monocapa sobre la superficie del chip, las cámaras fueron desmontados y fueron reemplazados por el depósito de tipo pocillo. El chip celular se conecta al sistema de ECIS y se mantienen en la incubadora durante las mediciones.
tinción CellTracker para la migración de comprobar
fibroblastos MRC-5 se tiñeron con CellTracker antes de co-cultivo para evaluar su la migración en el área de las células tumorales A549. En resumen, células MRC-5 se cultivaron en una placa de cultivo celular (SPL), y se recogieron usando tripsina-EDTA (Gibco). Las células se centrifugaron, el sobrenadante se eliminó, y las células se resuspendieron en 1 ml de medio de cultivo (RPMI-1640 con 10% de FBS, 1% de PS, HEPES 25 mM, Gibco). La solución de células recibió 20 M de CellTracker
TM (Life Technologies, CellTracker
TM verde CMFDA) y las células se incubaron a continuación durante 30 min. A continuación, las células se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante; a continuación, las células se resuspendieron en 1 ml de medio de cultivo fresco. Las células teñidas fueron entonces lista para ser inyectada en la cámara de co-cultivo como se describe en la sección de patrón celular. La tinción celular se confirmó mediante microscopía de fluorescencia (Eclipse 80i, Nikon).
análisis de citometría de flujo
A549 y células MRC-5 (5 x 10
5 células /ml) fueron cultivadas en placas de 6 pocillos, tanto para el mono-cultivo de células A549 y el co-cultivo de A549 y células MRC-5). Cada tipo de célula se trató con 30 mM de la curcumina (Sigma-Aldrich) durante 3 días. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS frío (Sigma-Aldrich) y tampón de unión en suspensión (mM HEPES 10, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM
2, pH 7,4, Sigma-Aldrich). Cada muestra recibió 5 M anexina V conjugada Alexa Fluor® 594 (Life Technologies, excitación /emisión: 590/617 nm) y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. Se analizaron las células por medio de un flujo de Accuri C6 citómetro (BD Bioscience) y los datos se analizaron con el software FlowJo (TreeStar).
MTS ensayo
curcumina (Sigma-Aldrich) se preparó en DMSO y se diluyó a concentraciones deseadas en medios de cultivo celular. Para el experimento, las células se cultivaron a 1 × 10
4 células /100 l de la cantidad inicial de la siembra en una placa de cultivo celular de 96 pocillos durante 24 h. Las células A549 y MCR-5 fibroblastos fueron tratados con varias concentraciones de la curcumina (1, 10, 30, 50, 70, 100 y 500 mM) durante 3 días. La solución Kit-8 de conteo celular (Dojindo Inc.) se diluyó a 1:10 con medio y se añadieron a cada pocillo de la placa, y luego se incubaron las células durante 4 h. La proliferación celular se midió a 450 nm usando un lector de microplacas Wallac 1420 VICTOR3 V.
Sistema de medición
una impedancia de precisión del medidor Agilent 4284A (Agilent CA, EE.UU.) y un circuito de relé de conmutación diseñados fueron operados para medir simultáneamente la impedancia de las matrices de electrodos. Las condiciones de medición fueron de 10 mV y 10 kHz a intervalos de 5 min. LabVIEW (National Instrument, TX, EE.UU.) se utilizó el software para controlar el medidor y registrar datos numéricos a un PC, y luego los datos se representaron de forma automática en un gráfico en tiempo real.
El análisis estadístico
Todos los datos se expresaron como el medio (± SD) de 3 repeticiones. El análisis estadístico se realizó mediante una sola vía ANOVA, seguido de la diferencia honestamente significativa de Tukey (HSD) prueba de la diferencia. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a los valores de p inferior a 0,05.
Resultados
MEA caracterización a través de los monocultivos de células tumorales y fibroblastos
En la primera etapa experimental, el MEA chips de celulares fueron validados a través de los monocultivos de células tumorales A549 y fibroblastos MRC-5 en condiciones normales de proliferación. Antes de hacer funcionar el sistema de medición de células, los arreglos fueron ajustados (por LabVIEW) para normalizar las diferencias sistemáticas, tales como cableado, soldadura y pistas conductoras. La resistencia libre de células normalizado de cada electrodo se fijó en 2,6 kW. La figura 2A muestra las respuestas de resistencia cuando los electrodos individuales fueron desafiados por varias concentraciones de células A549. Los datos obtenidos a lo largo de 16 h se ajustaron mediante un algoritmo de la colina por un modelo de crecimiento /sigmoidal (OriginPro 9). Por debajo de 1,25 × 10
5 células /pocillo, las curvas de resistencia se corresponden bien con las curvas de ajuste. En densidades celulares superiores, una fase de latencia apareció de 4 h a 8 h, cuando las células fueron reorganizando a sí mismos en la unión al sitio antes de formar una monocapa en los electrodos. Para estimar fácilmente la viabilidad a lo largo de este estudio, un parámetro adimensional denominado el Índice de Células (CI) se definió como el cambio relativo en la resistencia eléctrica medida y se puede calcular usando la ecuación belowwhere R
i es la resistencia de los electrodos cubierto por células y R
de células libre es la resistencia de los electrodos en blanco (2,6 kW). Después de 16 h, una curva de calibración se trazó, lo que representa la correlación entre el valor de CI y la densidad de la siembra de células (Fig 2B).
(A) respuestas de resistencia de MEA a varias concentraciones de células tumorales A549 en monocultivo para 16 h (a 10 mV, 10 kHz). (B) Esta curva de calibración representa la correlación entre la densidad de células A549 y valor del índice celular. Resultados (C) de MTS de los monocultivos de células A549 y fibroblastos MRC-5 a las 72 h de exposición a la curcumina. Los valores de IC50 para las células A549 y células MRC-5 fueron de 50 mM y 30 mM, respectivamente. Los datos se muestran como la media (± SD) de 3 repeticiones.
Además, las células tumorales A549 y fibroblastos MRC-5 se trataron por separado con varias dosis de la curcumina para definir una condición de tratamiento apropiado para el estudio de co-cultivo. La curcumina ha demostrado ser eficaz en la inducción de apoptosis, así como la inhibición de la proliferación de células de adenocarcinoma de pulmón A549-line [19]. En este estudio, la curcumina fue elegida para crear el ambiente de tratamiento para el modelo de co-cultivo propuesto. Un ensayo de MTS se llevó a cabo, y una curva de viabilidad de las células se representó después de 72 h (Fig 2C). Los resultados mostraron que la curcumina tiene un efecto tóxico significativo sobre las células tumorales y fibroblastos en 10 mM. Los valores de IC50 para las células A549 y células MRC-5 fueron de 50 mM y 30 mM, respectivamente. La dosis de tratamiento a 30 mM fue elegido para el experimento de co-cultivo posterior, donde las células tumorales se expusieron simultáneamente a ambas el efecto tóxico de la curcumina y el efecto inhibidor de los fibroblastos adyacentes.
efecto inhibidor de los fibroblastos en las células tumorales en cultivo mixto
proliferación celular tumoral en este tipo de modelo de co-cultivo se determina por las propiedades tanto de las células cancerosas y los fibroblastos, lo que podría ejercer efectos proliferativos opuestos
in vitro
. Por ejemplo, los fibroblastos AG09877 estimulan la proliferación de células de carcinoma T47D, mientras que los fibroblastos AG04351 exhiben un efecto de crecimiento de inhibición en la misma línea de células de cáncer [13]. Para determinar los efectos recíprocos entre A549 y MRC-5, un ensayo de FACS se realizó con un modelo de cultivo mixto utilizando estas 2 líneas celulares. El esquema de detección se basa en las diferencias en fosfatidilserina ubicación (PS) entre las células sanas y células apoptóticas. En células viables normales, PS se encuentra en la superficie citoplasmática de la membrana celular. Cuando las células empiezan a experimentar apoptosis, PS se transloca desde el interior hacia el exterior de la membrana celular y se expone al entorno celular externo. El uso de una proteína específica de unión a fosfolípidos (anexina V conjugada con Alexa Fluor® 594) y un sistema de citometría de flujo de clasificación, las células apoptóticas en fase inicial se pueden distinguir de toda la población celular.
Como se muestra en la figura 3 , el tratamiento de cúrcuma en los monocultivos inducidas apoptosis tanto en las células A549 y células MRC-5 a 9,87% y 19,05% de células apoptóticas, respectivamente. Esta relación fue menos significativa que nuestros resultados MTS, así como los resultados de otros estudios anteriores [20]. Estas diferencias se explican por la falta de células muertas, que no puede ser discriminado por FACS con solamente tinción PS.
diferentes porcentajes de células apoptóticas se obtuvieron en las células tumorales A549 y MRC-5 fibroblastos monocultivos y en el mixto cultura de estas 2 líneas celulares. [Una figura de color se puede ver en la edición en línea].
En cultivos mixtos sin un efecto vecino entre las células tumorales y fibroblastos, se espera que una proporción de células apoptóticas totales de 9,87% a 19,05% en las mismas condiciones experimentales. Curiosamente, la proporción de células apoptóticas en los cultivos mixtos se determinó que era 33,71%. Este resultado sugiere que el efecto inhibidor de célula a célula estaba presente en paralelo con el efecto tóxico de la curcumina para ambos tipos de células. Sin embargo, los efectos específicos de cada línea celular fueron difíciles de determinar mediante FACS.
El efecto inhibitorio de los fibroblastos de la proliferación normal de las células tumorales
Para discriminar la contribución particular de cada línea celular con el total efecto inhibidor, se examinaron las condiciones celulares a través de las respuestas de impedancia en un modelo de co-cultivo. datos de la resistencia en bruto de células A549 a diferentes distancias de distancia a partir de fibroblastos (0,1, 0,25, 0,65, 1,45, y 3,05 mm) fueron linealmente equipado y normalizado, como se muestra en la figura 4A. Los datos de resistencia correspondientes después de las 24 y las 48 horas se convirtieron en valores de CI utilizando la ecuación se muestra en la sección 1 (Figura 4B). Durante las primeras 24 horas después del contacto célula, el efecto de la distancia era indistinta, y los valores de CI no mostró diferencias significativas entre el 1 array
st electrodo (0,1 mm) y la 5
ª serie de electrodos (3.05 mm) .
(a) Las respuestas celulares de resistencia (en 10 mV, 10 kHz) de las células tumorales A549 como una función del tiempo y la distancia a partir de fibroblastos más de 54 h de co-cultivo en condiciones de crecimiento normales. Los datos en bruto fueron linealmente equipada y se convierten en valor de CI con respecto a la respuesta del electrodo libre de células (2,6 kW). valores (B) de CI de las células tumorales en 5 diferentes distancias lejos de los cultivos de fibroblastos. Después de 48 h en co-cultivo, los valores de CI indicaron que las células tumorales que se enfrentan a los fibroblastos fueron claramente inhibidas en comparación con las células distantes. (* P & lt; 0,02). (C) Las imágenes de campo brillante de la confrontación entre las células tumorales y fibroblastos a las 0 h y 48 h. La barra de escala representa 200 micras.
Se observó una diferencia significativa en la proliferación de células A549 a las 48 h. Los valores de CI de las células A549 en directamente en contacto y el contacto adyacente con fibroblastos (es decir, al 1
ª y 2
nd matrices de electrodos) ligeramente disminuido de 6.12 y 6.23 a la 5.57 y 5.77, mientras que los del A549 más células (es decir, a las 3
er, 4
º y 5
º matrices de electrodos) mantenido estables respuestas de impedancia en la densidad de células confluentes (figura 4C). Estos resultados mostraron claramente que los fibroblastos son capaces de inhibir la tasa de proliferación de células tumorales en cultivos que se enfrentan con más eficacia que los efectos mediados a través del entorno de medios
células
Fibroblastos-tumorales interacción en condiciones de tratamiento:. Efecto vecino obvio a distancias
Para proporcionar una comprensión completa del efecto vecino entre los fibroblastos y las células tumorales
in vitro
, se construyó un modelo de co-cultivo con células MRC-5 y las células A549 en condiciones terapéuticas. La curcumina se introdujo en los cultivos que se enfrentan a la concentración previamente definido, 30 micras; a continuación, la impedancia se controló por los siguientes 84 h. Las respuestas promedio se normalizaron y no lineal ajustan usando un algoritmo de dosis-respuesta (Fig 5A). Curiosamente, el efecto de la distancia se demostró claramente en los primeros tiempos después de la exposición al fármaco (Figura 5A y 5B). Después de 24 h, los valores promedio de CI obtenidos fueron 5,57, 5,77, 6,35, 6,34 y 6,40 para las células tumorales que se ubicaron en 0.1, 0.25, 0.65, 1.45 y 3.05 mm de distancia de la línea de fibroblastos confrontación. Después de 48 h y 72 h, una disminución significativa de todos los valores de CI y la aparición de huecos entre las matrices reflejan claramente el efecto apoptótico combinado intensivo tanto de la actividad del fármaco anti-cáncer y la inhibición del crecimiento a través de interacciones de fibroblastos. También se realizó un ensayo de migración en las condiciones de co-cultivo se enfrentan a investigar la capacidad de migración de los fibroblastos en el área de las células tumorales y por lo tanto ser capaz de distinguir el efecto directo de célula a célula de la interacción del efecto inhibidor total (figura 5C). Después de 72 h, la intensidad de fluorescencia restante mostró el efecto apoptótico eficiente de la curcumina sobre las células MRC-5, pero no se observó migración significativa. Estos resultados se corresponden bien con los de otros estudios sobre los efectos del tratamiento de cúrcuma de la cinemática de migración de fibroblastos cultivados.
(A) respuestas de resistencia celular (a 10 mV, 10 kHz) de las células tumorales A549 como una función del tiempo y la distancia a partir de fibroblastos más de 84 h de co-cultivo en la condición de tratamiento de cúrcuma. Los datos en bruto se ajustaron y se convierten a valores de CI con respecto a las respuestas de los electrodos libres de células (2,6 kW). valores (B) de CI de las células tumorales en 5 diferentes distancias lejos de los cultivos de fibroblastos. El efecto inhibidor de los fibroblastos en las células tumorales se observó más claramente en el ambiente tóxico después de 24 h (* P & lt; 0,04). (C) La tasa de migración de fibroblastos en el área de las células tumorales se evaluó mediante un ensayo de tinción de seguimiento celular. En la condición de tratamiento, no se observó migración significativa. Los puntos grises indican la ubicación de las matrices de electrodos. La barra de escala representa 500 micras.
Discusión
biosensores basados en células impedimétrico han sido reconocidos como una plataforma de caracterización versátil y fiable para los estudios de bio-analítico debido a sus importantes ventajas, tales como alta sensibilidad, alto rendimiento y capacidad de grabación en tiempo real. El uso de varios diseños de electrodos geométricas, plataformas ECIS han sido ampliamente utilizado en los estudios de unión de las células y la difusión de [21,22], la motilidad celular [23], las funciones de barrera de la capa de células [24], así como para
in vitro
estudios toxicológicos y de detección de drogas [25,26]; estas plataformas también se han integrado con otros sistemas de bio-analítica [27]. El diseño del electrodo sobresaliente es la matriz de microelectrodos, que consiste en muchos microelectrodos individuales uniformes sobre una plataforma compartida. Debido a que son del orden de micras de tamaño, microelectrodos individuales son capaces de hacer frente a las propiedades heterogéneas de células que se ocultan dentro de las poblaciones de células promedio, en lugar de proporcionar una respuesta celular colectiva a una condición fisiológica dada. Sin embargo, el uso de microelectrodos individuales en la medición celular tiene que hacer frente a la extraordinaria sensibilidad de los comportamientos celulares tales como micro-movimientos, el apego, la difusión y proliferación. Esta fluctuación de la señal presenta un desafío para la determinación del comportamiento real de la celda en la superficie de un electrodo. La solución proporcionada en este estudio estaba usando matrices para la repetición de medición, y luego la aplicación de métodos de ajuste adecuadas a los datos medios obtenidos. Usando este método, los cambios relativos de la viabilidad celular se pueden mostrar a través del número de CI y pueden ser fácilmente convertidos en porcentajes en comparación con los valores iniciales de CI.
Este estudio tiene por objeto proponer un método simple pero eficaz para investigar la interacciones de las células tumorales y fibroblastos en un modelo de co-cultivo, con especial énfasis en el efecto de la distancia entre estas 2 líneas celulares. Los efectos inhibidores y tóxicos generales en las células cancerosas A549 se muestran en la Fig 6. Cabe señalar que otros estudios previos han examinado la inhibición de la proliferación de células tumorales y la motilidad por los fibroblastos [28-31]; la conclusión común fue que el efecto de inhibición era tanto contacto- y soluble dependiente de factor. Sin embargo, todavía no se había determinado la distancia efectiva entre las células tumorales y los fibroblastos. Mediante la integración de una plataforma de MEA en un modelo de co-cultivo, se determinó con éxito las diferencias de comportamiento de células tumorales A549 a diferentes distancias lejos de fibroblastos MRC-5 tanto en condiciones normales de proliferación y tratamiento. Nuestros resultados mostraron que las influencias en las células tumorales pueden ser categorizados en 3 zonas diferentes sobre la base de la viabilidad de las células tumorales. La primera zona se encuentra hasta 0,25 mm de distancia de la línea de fibroblastos confrontación, donde las células cancerosas se inhibió tanto en condiciones normales y tóxicos. Este resultado puede explicarse por la participación de las moléculas de la superficie de los fibroblastos, así como los factores solubles que son secretadas por la confrontación entre los fibroblastos y las células tumorales [31]. La segunda zona se encuentra un máximo de 3 mm de distancia de la primera zona, donde el efecto en condiciones de crecimiento normales fue indistinta pero se demostró claramente en la condición de tratamiento. Este resultado se explica también por los factores solubles secretadas a partir de fibroblastos de una distancia limitada. La tercera zona abarca el área restante. En los co-cultivos normales, las células tumorales A549 en esta zona mantienen valores de CI de 6,6 y 6,5, lo que indica una tasa de proliferación normal a pesar de la diafonía de células distantes. En la condición de tratamiento, la viabilidad celular A549 se determinó que era 75,6%, que era aproximadamente el mismo valor determinado por el ensayo de MTS mitocondrial base (72,1%). Esta equivalencia obviamente indica que los medios condicionados no causaron ningún efecto inhibitorio cuando las células cancerosas eran más de 3 mm de los fibroblastos.
La respuesta de las células humanas malignas al microentorno del estroma y terapéuticos es regímenes un tema fundamental en la investigación del cáncer, pero una comprensión completa no se ha logrado debido a un exceso de confianza en ensayos de punto final [32-34]. En este estudio, hemos introducido un ensayo bien establecido a una plataforma de detección novedoso para la primera vez para facilitar la supervisión continua y la evaluación dependiente de la ubicación de los efectos de inhibición celular. Nuestros resultados hicieron hincapié en que el factor del tamaño tumoral podría afectar a la eficacia de la quimioterapia del cáncer y se debe considerar como un parámetro influyente en los sistemas de co-cultivo. Otros estudios que caracterizan a los elementos moleculares secretadas por las células, así como las vías de señalización que utilizan nuestra plataforma y sistemas 3D de co-cultivo similares para cada tipo de cáncer serán muy beneficiosos para la comunidad de investigación sobre el cáncer.
Conclusión
a lo mejor de nuestro conocimiento, este estudio es el primer intento de abordar el factor de la distancia en la inhibición diferencial de la proliferación de células tumorales por los fibroblastos humanos. Nuestros resultados basados en células impedimétricos revelaron que el efecto de supresión vecino de fibroblastos normales depende no sólo el tipo de células y el modo de interacción, sino también la distancia entre las líneas de células de 2. las células tumorales A549 se inhibieron intensamente dentro de 0,25 mm a partir de fibroblastos MRC-5, mientras que no se observó inhibición a 3 mm y más. Con la capacidad de las mediciones automáticas, nuestro ensayo de alto rendimiento puede facilitar la preliminarmente evaluación de las interacciones célula-célula deseados en diferentes condiciones de crecimiento o de tratamiento antes de la utilización de cualquier otro ensayos biológicos.