Extracto
La administración de la terapia contra el cáncer inefectiva se asocia con toxicidad y desarrollo de clones resistentes innecesaria. Las células madre, como el cáncer (CSLCs) resistir a la quimioterapia, lo que provoca la recaída de la enfermedad. Así, el desarrollo de una prueba que identifica la gestión más eficaz de la quimioterapia ofrece una gran promesa para los tratamientos contra el cáncer individualizados. Hemos desarrollado un ensayo de sensibilidad quimioterapia ex vivo (ChemoID), que mide la sensibilidad de CSLCs, así como la mayor parte de las células tumorales a una variedad de agentes de quimioterapia. Dos pacientes, un varón de 21 años (paciente 1) y una hembra de 5 meses (paciente 2), afectada por anaplásico fueron seleccionados utilizando el ensayo de la OMS ChemoID ependimoma de grado III. Paciente 1 fue encontrado sensibles a la combinación de irinotecán y bevacizumab, que resultó en una progresión de la enfermedad periodo libre prolongado de 18 meses. Después de la recidiva, la combinación de varios medicamentos de quimioterapia se probó de nuevo con el ensayo ChemoID. Se encontró que el isotiocianato de bencilo (BITC) se incrementó en gran medida la quimiosensibilidad de las células ependimoma a la combinación de irinotecán y bevacizumab. Después paciente 1 se trató durante dos meses con irinotecán, bevacizumab y suplementos de extractos vegetales crucíferos que contienen BITC, se observó regresión tumoral más de 50% en comparación con el pre-ChemoID exploración como se evidencia por resonancia magnética. Paciente 2 fue encontrado resistente a todos los tratamientos ensayados y siguientes 6 ciclos de vincristina, carboplatino, ciclofosfamida, etopósido y cisplatino en varias combinaciones, el tumor de este paciente progresó rápidamente y se recomienda la terapia de haz de protones. A medida que los estudios en animales realizados con xenoinjertos esperadas derivadas del paciente tratados con fármacos evaluados ChemoID recapitulan la observación clínica. Este ensayo demuestra que los pacientes con la misma etapa histológico y el grado del cáncer pueden variar considerablemente en su respuesta clínica, lo que sugiere que las pruebas de ChemoID que mide la sensibilidad de CSLCs, así como la mayor parte de las células tumorales a una variedad de agentes de quimioterapia podría conducir a más tratamientos contra el cáncer eficaces y personalizadas en el futuro
Visto:. Mathis SE, Alberico A, Nande R, W Neto, Lawrence L, McCallister DR, et al. (2014) quimio-predictivo Ensayo para atacar a las células de vástago como el cáncer en pacientes afectados por tumores cerebrales. PLoS ONE 9 (8): e105710. doi: 10.1371 /journal.pone.0105710
Editor: Caterina Cinti, Instituto de Fisiología Clínica, c /o Toscana Vida Fundación de Ciencias, Italia |
Recibido: 27 de mayo de 2014; Aceptado: 23 de julio de 2014; Publicado: 21 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Mathis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. El presente estudio se apoya en parte por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación, Institutos Nacionales de Salud, a través de la subvención número UL1TR000117 del Centro Nacional para Recursos de investigación (CNRR), y 5P20RR020180 del Instituto Nacional del cáncer, WV-INBRE 5P20RR016477, y en parte por un premio traslacional Universidad de Marshall, y un premio del Departamento de la Universidad de Marshall of Neuroscience (al PPC). El contenido de este manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de la CNRR y los NIH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de que los ependimomas son el tercer tipo más común de tumor cerebral en los niños (y siguientes astrocitoma meduloblastoma), son relativamente poco frecuentes, con aproximadamente 200 casos diagnosticados en los EE.UU. cada año [1], [2]. Ellos representan el 60% de todos los tumores intramedulares y el 50% surgir en el filum terminal [3].
El tratamiento de los ependimomas puede ser un reto. El tratamiento estándar inicial para ependimoma es a menudo la cirugía seguida de radioterapia y quimioterapia. Aunque la quimioterapia se ha utilizado ampliamente en los niños con ependimomas, hay poca evidencia clínica de que la quimioterapia mejora la supervivencia de los niños con este tipo de tumor. La quimioterapia a menudo se reserva para los pacientes con tumor residual después de la cirugía y para los niños menores de 3 años de edad, en un intento de retrasar la radioterapia [4].
No está del todo claro por qué no hay una mejoría en la supervivencia con quimioterapia, pero se sabe que la resistencia a una variedad de agentes quimioterapéuticos utilizados frecuentemente es común en ependimoma [5]. Por lo tanto se requieren investigación y desarrollo de nuevas estrategias y terapias integradas para encontrar tratamientos más eficaces para este tipo de tumor.
Los pacientes con la misma etapa y el grado del cáncer pueden variar considerablemente en su respuesta clínica y tolerancia de la quimioterapia. terapia contra el cáncer ineficaz puede resultar en toxicidad innecesaria y el desarrollo de clones resistentes. Las células de cáncer que sobreviven a menudo son más resistentes a la terapia. Muchos intentos se han hecho en los últimos años para desarrollar un
ex vivo de ensayo anti-cáncer de Windows que podría ayudar a discernir las mejores opciones de tratamiento para cada paciente individual, mientras que se minimiza la toxicidad.
modelos de xenoinjerto animal tienen muestra que sólo un subconjunto de células cancerosas dentro de cada tumor es capaz de iniciar el crecimiento del tumor. Esta capacidad ha sido demostrado en varios tipos de cánceres humanos, para incluir ependimomas [6]. Este conjunto de células cancerosas se define operacionalmente como el subconjunto "Cáncer-Stem Cell Al igual que" (CSLC). De acuerdo con la teoría de la "célula de cáncer de tallo-like", los tumores son un complejo de crecimiento de la población de células anormales procedentes de una minoría de CSLCs,. Estas células madre mantienen características similares en cuanto a que proliferan muy lentamente y tienen la capacidad intrínseca de auto-renovarse y diferenciarse en fenotípicamente heterogéneo progenie, aberrante [7] - [10]. A diferencia de la mayor parte de las células tumorales, CSLCs resisten la quimioterapia y la radiación y son responsables de la recaída del tumor y la metástasis [9], [10].
Algunos ependimomas expresan diversos marcadores de stemness, incluyendo CD133. Además, los tumores en recaída presentan una expresión genética constituida por hasta reguladas genes implicados en el cinetocoro (ASPM, KIF11) o en el desarrollo neural (vías CD133, Wnt y Notch) [11].
Orientación en CSLCs Además de la mayor parte de otras células de cáncer dentro de un tumor es un nuevo paradigma en el tratamiento del cáncer. Nuestros estudios recientes muestran que un biorreactor de enfoque hidrodinámico (HFB) (Celdyne, Houston TX) enriquece selectivamente CSLCs de líneas celulares de cáncer que se pueden utilizar en un ensayo de quimiosensibilidad [8]. Además, el uso de esta estrategia hemos optimizado el enriquecimiento de CSLCs de biopsias de tumores y hemos desarrollado el ensayo de sensibilidad quimioterapia ChemoID, que mide la respuesta de CSLCs y la mayor parte de las células tumorales a la quimioterapia para determinar la combinación más eficaz de medicamentos contra el cáncer para los tumores malignos de el sistema nervioso.
En este estudio se reporta, por primera vez, nuestra investigación utilizando el ensayo ChemoID para medir la sensibilidad y resistencia de CSLCs y el volumen de las células tumorales cultivadas a partir de biopsias de 2 ependimoma humana desafió con varios agentes de quimioterapia que también se correlacionaron con la respuesta de los xenoinjertos de animales tratados con los medicamentos previstos y con la respuesta clínica de los pacientes tratados.
Materiales y Métodos
Reactivos
bencilo isotiocianato (BITC) se adquirió de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El bevacizumab (Avastin), cisplatino, oxaliplatino, arabinósido-C, VP-16, irinotecan (Camptosar, CPT-11), busulfán, metotrexato, fueron adquiridos como agentes quimioterapéuticos de grado clínico.
Los pacientes
Caso 1 es un paciente masculino de 21 años de edad con diagnóstico de intradural, intramedular y extramedular anaplásico difuso ependimoma espinal, la OMS grado III. El caso 2 es una paciente de edad de 5 meses diagnosticado con anaplásico III de la OMS ependimoma de grado.
ChemoID ensayo se realizó después de obtener el consentimiento informado por escrito del paciente de acuerdo con las normas éticas de la Declaración de Helsinki (1964, modificado en último en 2008) de la Asociación médica Mundial. Cualquier información, incluyendo las ilustraciones, se ha anónima. Marshall Universidad Institucional Review Board (IRB) ha aprobado esta investigación en el marco del protocolo#326290. Los participantes o tutores de los participantes (en caso de un niño participante) dieron su consentimiento por escrito en un IRB aprobado formulario de consentimiento informado para participar en este estudio después de haber sido educado sobre el protocolo de investigación. Los comités de ética /IRB de la Universidad de Marshall aprobado este procedimiento de consentimiento. Para los participantes de los niños en el estudio, el consentimiento informado por escrito se obtuvo de los familiares, cuidadores o tutores en nombre de los menores /niños inscritos en el estudio.
suspensión de células individuales y Cell Cultura y Primaria
suspensiones de una sola célula de las biopsias ependimoma se prepararon usando el gentleMACS Disociador (Miltenyi, Auburn, CA), y C los tubos usando un protocolo estandarizado, semi-automatizado basado en una combinación de interrupción tejido mecánica y la incubación con un 50% solución al 0,025% de tripsina y accutase (Cell Technologies innovadoras, San Diego, CA). Las células fueron en serie en placas en 24 pocillos, 12 pocillos, 6 pocillos, 10 cm tratados platos y se cultivaron a subconfluencia en medio RPMI-1640 suplementado con 5% irradiado, inactivado por calor, que se define de suero bovino fetal (ThermoFisher /Hyclone), y 50 U de penicilina y 5 mg de estreptomicina /ml de medio (ThermoFisher /Mediatech).
tridimensional biorreactor CSLCs Cultura y
Un biorreactor de enfoque hidrodinámico (HFB) (Celdyne, Houston TX ) se usó como se describe previamente para proliferar selectivamente las células madre como CD133 (+) del cáncer [8]. Los medios de cultivo, la oxigenación, la velocidad, la temperatura y el CO
2 se mantuvieron consistentemente constante durante diez días.
Las células se contaron y se colocaron 1 × 10∧6 células en el recipiente de rotación fijado a 25 rpm con el flujo de aire fijado en 20%. Las células se retiraron a continuación y se contaron de nuevo usando exclusión de azul de tripano para determinar la viabilidad celular y número de células y se sembraron en 96 pocillos para el ensayo de quimiosensibilidad. Las células también se incubaron con anticuerpos fluorescentes para [8].
Cell Ordenando
Hasta 1 × 10∧7 células fueron ordenados por un magnético de células activadas por la clasificación del sistema (MACS) caracterización fenotípica , que consta de perlas magnéticas conjugadas con un anticuerpo contra CD133 (Miltenyi, Auburn, CA). En breve, las células se recogieron usando tripsina al 0,25%, se sedimentaron y se marcaron con CD133 /1 biotina y CD133 /2-PE. Las células se lavaron y se marcaron con perlas magnéticas anti-biotina, y luego pasan a través de una columna magnética donde CD133 se mantuvieron células (+), mientras que las células no marcadas pasan a través de la columna. El CD133 (+) retenido células se eluyeron de las columnas después de la eliminación del imán. Las células positivas y negativas fueron analizadas por FACS para la pureza.
Citometría de Flujo Estudios
Las células fueron analizadas por los criterios antigénicas utilizando anti-CD34 (Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD38 ( Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD44 (BD Bioscience, Sparks, MD), -CD117 (Milteny Biotech, Auburn, CA), -CD133 /2 (prominin1) (Milteny Biotech, Auburn, CA), -Oct3 /4 (BD Bioscience, Sparks, MD), y -Nanog (BD Bioscience, Sparks, MD). Brevemente, las células fueron separadas utilizando 0,02% de EDTA en PBS y se sedimentaron (10 min a 1.000 rpm), se lavaron en 0,1% de BSA en 1X PBS a 4 ° C y se incubaron en una solución de 1 mg de anticuerpo 9 ml 0,1% de BSA en 1X PBS. Las células fueron lavadas en la misma solución de una vez y se analizaron mediante un citómetro de flujo C6 Accuri (BD Biosciences, San Jose, CA).
ChemoID Ensayo
La sensibilidad a la quimioterapia se evaluó mediante un ensayo de viabilidad (WST8) en 1 × 10∧3 células sembradas en 5 réplicas en placas de 96 pocillos. En pocas palabras, el mismo número de grueso de las células tumorales cultivadas en monocapa y CSLCs cultivados en el biorreactor, se contaron y se sembraron separadamente en placas de 96 pocillos y se incubó a 37 ° C durante 24 horas. Las células fueron luego desafiados para un pulso de 1 hora con un panel de medicamentos contra el cáncer como elegido por el oncólogo para imitar el programa de infusión de quimioterapia clínica media.
Para estudiar el efecto de BITC en quimiosensibilización de las células cancerosas a la quimioterapia fármacos, las células se trataron con un pulso 5-30 BITC M horas seguido de una hora de los diversos medicamentos contra el cáncer. Cada medicamento contra el cáncer ha sido probado en una gama de dosis, incluyendo la dosis clínicamente relevante
.
Un ensayo WST8 se realizó 48 horas después del tratamiento de quimioterapia para evaluar la viabilidad celular como se describe anteriormente [12]. Un gráfico de respuesta a la dosis fue desarrollado en el que las muestras se puntuaron como sensible (la supervivencia celular 0-30%), intermedio (supervivencia de las células 30 a 60%), y no responde (supervivencia de las células 60 a 100%).
dilución limitante Tumorígeno Ensayo en ratones inmunodeficientes
Una gama de 1 × 10∧2, 1 × 10∧3, 1 × 10∧4, y 1 × 10∧5 células ependimoma de paciente 1 se inyectaron en 5 inmunodeficientes atímicos desnudos ratones
nu /nu por grupo. En pocas palabras, un número igual de mayor parental de células tumorales cultivadas en monocapa 2D, CD133 (+) tridimensionalmente cultivar en el biorreactor hydrofocusing, y CD133 (+) MACSorted CSLCs fueron inyectados con 100 l de matrigel en el flanco de NOD-
Scid
ratones y en comparación con el crecimiento de las células CD133 negativas durante 3 meses.
la quimioterapia Estudio animales
Todos los estudios con animales han llevado a cabo tras la aprobación de la Universidad CICUAL Marshall, el protocolo#373017. Los efectos de las quimioterapias seleccionados in vitro por el ensayo ChemoID se puso a prueba en las biopsias de tumores humanos que eran xenoinjerto en el flanco de una NOD-
Scid
modelo de ratón. 1 × 10∧6 células ependimoma se mezclaron con 100 l de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) inyectaron por vía subcutánea en el flanco de 10 atímicos, NOD.Cg-Prkdc
Scid
ll2rgtm1wjl /SZJ ratones inmunodeficientes ( NOD-
Scid
) /grupo y se cultivaron durante 10 semanas o hasta 100 mm∧3. Los ratones se asignaron al azar en diferentes grupos de tratamiento y de control y la quimioterapia se administró por vía intraperitoneal (i.p.) inyecciones en 200 l de la siguiente manera en un período de 4 semanas: 1) Grupo#1, el grupo de control con células de tumor primario inyectado en el flanco y la recepción de i.p. inyecciones de solución salina estéril. Grupo#2, Grupo experimental inyecta por vía intraperitoneal con la quimioterapia menos eficaz como se determina por el ensayo de
in vitro
ChemoID. Grupo#3, Grupo experimental inyecta por vía intraperitoneal con la quimioterapia más eficaz según lo determinado por la
vitro
ensayo en ChemoID. Grupo#4, Grupo experimental inyecta por vía intraperitoneal con la segunda quimioterapia más eficaz según lo determinado por la
vitro
ensayo en ChemoID. Grupo#5, Grupo experimental inyecta por vía intraperitoneal con la quimioterapia combinatoria más eficaz según lo determinado por el
ensayo in vitro
ChemoID.
ratón dosis de quimioterapia fueron calculados utilizando un área de superficie corporal (BSA) método de normalización [13] a partir de la dosis clínica y verificadas de acuerdo a las dosis previamente determinados por una búsqueda en la literatura.
la eutanasia
los animales fueron sacrificados siguiendo las directrices actuales establecidos por el último informe del Panel AVMA sobre la eutanasia mediante inhalación de CO2 y la asfixia seguidas de cuello de útero dislocación.
análisis estadístico
el análisis estadístico se realizó utilizando el software estadístico SPSS de IBM. Los resultados para cada variante en los diferentes diseños experimentales representan un promedio de 3 experimentos diferentes. Se promediaron los datos de 5 mediciones; el coeficiente de variación entre estos valores nunca excedió 10%. Los valores medios y los errores estándar se calcularon para cada punto de la agruparon normalizaron a datos de control. El análisis estadístico de la significación de los resultados se realizó con un ANOVA de 1 vía.
valores de p
de menos de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
El paciente 1 Historia y Selección de quimioterapias con ChemoID Ensayo
Una actividad física 17 años de edad, presentó en octubre de 2005 con parestesias en sus pies y una pérdida perceptiva bastante grave. Esto empeoró progresivamente en diciembre de 2005 subiendo las piernas con adormecimiento bastante severo en la pierna derecha y el dolor en su pierna izquierda, a partir de la mitad del muslo hasta la mitad de la pantorrilla medial. En el examen no tenía debilidad focal a través de sus extremidades superiores e inferiores. Tenía hipoalgesia con el nivel sensorial parcial en la columna torácica superior hacia abajo. También tuvo la pérdida de la propiocepción severo en sus pies y dedos de los pies. La resonancia magnética (RM) de la columna cervical mostró la presencia de una masa realzada anormal, que se extendió desde mediados de C5 a C7 inferior (4,5 de longitud x 1,0 x 2,0 en la dimensión céfalo-caudal y anteroposterior) que causó la compresión del cordón (Figura 1A). Resonancia magnética de la columna torácica mostró una lesión en la mejora de T2-3 (1,5 × 0,6 de largo x 0,6 cm de anteroposterior y dimensión transversal) con varias otras masas nodulares más pequeños, mejor visto en la secuencia T2 ponderado, que se extendían a lo largo del nivel torácico de T11 (Figura 1B).
a) Imagen de Resonancia magnética (MRI) de la columna cervical que muestra la presencia de una masa de mejora, que se extiende desde mediados de C5 a C7 inferior (4,5 de longitud × 1.0 × 2.0 en cephalocaudal y la dimensión antero-posterior) y causando la compresión del cordón. B) Resonancia magnética de la columna torácica que muestra una lesión en la mejora de T2-3 (1,5 × 0,6 de largo x 0,6 cm de anteroposterior y dimensión transversal) con varias otras masas nodulares más pequeños, mejor se ve en la secuencia T2 ponderado, que se extendía a lo largo de la columna torácica nivel de T11. C) hematoxilina y eosina de una sección de tumor que muestra un componente celular denso predominante en general, con características primitivas nucleares, la actividad mitótica, necrosis y proliferación vascular. La presencia de bien formados, pseudorrosetas perivasculares obvias (con el patrón vasocentric, zonas libres de armas nucleares perivasculares, y los procesos gliales finos clásicos que irradian hacia /desde la pared del vaso) se encontraron apoyo para el diagnóstico de intradural anaplásico, extramedular ependimoma médula difusa, la OMS grado III.
el paciente recibió una laminectomía en diciembre de 2005 en C5, C6, C7 y con resección parcial del tumor bajo el microscopio utilizando técnicas microquirúrgicas. Después de la cirugía, el paciente fue tratado con radioterapia y temozolomida
El análisis morfológico de las secciones histológicas teñidas con hematoxilina & amp.; Eosina mostró un componente celular denso predominante en general, con núcleos primitivos y pleomórficas, aumentó la tasa de mitosis y apoptosis, y focos con la proliferación microvascular. La presencia de bien formados, pseudorrosetas perivasculares obvias (con el patrón vasocentric, zonas libres de armas nucleares perivasculares, y los procesos gliales finos clásicos que irradian hacia /desde la pared del vaso) se encontraron para apoyar el diagnóstico de ependimoma anaplásico espinal, la OMS grado III difusa. La figura 1C muestra la tinción con hematoxilina y eosina de una sección del tumor al momento del diagnóstico en 2005.
Las secciones del tumor se evaluaron mediante técnicas de inmunoperoxidasa con tinción de secciones de control apropiadas. El tumor mostró tinción positiva con anticuerpos frente a enolasa específica de neuronas, vimentina, S-100, y GFAP. Tinción débil ocurrió con los anticuerpos contra la actina. tinción focal ocurrió con anticuerpos para el antígeno de membrana epitelial, citoqueratina AE1 /AE3, y sinaptofisina. El tumor fue negativo para el antígeno leucocitario común, desmina, y miogenina. Además, una sección teñida con PAS mostró un material fibrilar PAS-positivo focal. Secciones y bloque de tumor también fueron enviados al Centro de Biopatología (BPC) del Grupo de Oncología Infantil (COG) eran dos neuropatólogos examinaron de forma independiente del caso y confirmaron el diagnóstico de ependimoma anaplásico, grado III de la OMS.
Después de recurrencia y progresión, el paciente recibió régimen de quimioterapia complejo en enero de 2006 y marzo de 2006 con ciclofosfamida, talidomida, celecoxib, seguido de etopósido, la talidomida y celecoxib. El tratamiento con quimioterapia se concluyó en septiembre de 2006, pero en agosto de 2007 paciente tuvo un crecimiento tumoral en T7-T8 para el cual fue sometido a un tratamiento de radiocirugía robótica. El paciente tenía otra cirugía de reducción de volumen en abril de 2008, pero después, en diciembre de 2008 tuvo adormecimiento progresivo en las piernas, junto con el dolor de espalda con la RM que muestra la recurrencia en el área quirúrgica (Figura 2A), así como la columna lumbar. Posteriormente, fue tratada de nuevo con temozolomida, pero no tuvo respuesta al tratamiento.
A) 2009 resonancia magnética de la columna cervical que muestra la recurrencia en el área quirúrgica. B) 2009 resonancia magnética de la columna torácica que muestra la progresión de la lesión principal que mide 23,9 mm, y la aparición de varias otras lesiones más pequeñas. C y D) 2010 resonancia magnética de la columna cervical y torácica que muestra la regresión del tumor después de un tratamiento con irinotecan y bevacizumab.
En marzo de 2009 debido a la progresión de la enfermedad que tuviese una laminectomía torácica y la resección de la tumor intramedular intradural. Tenía compresión de la médula grave y comenzó a tener debilidad en las piernas. Debido a una mayor recurrencia, el paciente tuvo entonces otra cirugía de reducción de volumen en julio de 2009. También recibió oxaliplatino y tratamiento etopósido en julio y agosto de 2009, pero el tumor progresó aún más (Figura 2B).
adecuado consentimiento informado firmado y en el momento de la cirugía de reducción de volumen de julio de 2009, una biopsia estéril fue tomada para evaluar la sensibilidad de las células tumorales (grueso del tumor y CSLCs) hacia los medicamentos de quimioterapia estándar de atención utilizando nuestro ensayo ChemoID. La biopsia se colocó en medio RPMI-1640 estériles y el tejido se disoció en nuestro laboratorio en una suspensión de una sola célula con el uso de un disociador tejido gentleMACS (Miltenyi, Aubourn, CA). La suspensión ependimoma de una sola célula se cultivó en medio RPMI-1640 en presencia de 5% irradiado, inactivado por calor, suero bovino fetal definido, estreptomicina y penicilina y las células fueron cultivadas como una monocapa durante 15 días. Las células se immunophenotyped por citómetro de flujo utilizando anticuerpos contra CD34, CD38, CD44, CD117, CD133, OCT3 /4 y Nanog.
Se encontró que las células ependimoma positiva a OCT3 /4 (2,73%), Nanog (0,95 %), CD133 (49,93%), CD117 (36,81%), y CD44 (20,39%) en comparación con un anticuerpo de control de isotipo (Figura S1 AE). Un doble tinción de CD34 y CD38 mostró la presencia de 1,88% de las células CD34 + /CD38 +, y el 78,4% CD34 + /células CD38- (Figura S1 F).
Para expandir la población CSLC de las células CD133 + de la ependimoma cultivo primario, las células se cultivaron como se ependimoma [8] se describe anteriormente. 1 × 10∧6 de las células ependimoma de un cultivo primario monocapa se cultivaron durante diez días con enfoque hidrodinámico biorreactor (HFB) (Celdyne, Houston, TX) [8]. Las células ependimoma cultivadas en los grupos de células del biorreactor formado (Figura 3A), que se expandieron 14,7 veces (Tabla 1) y parecía ser un 95,93% CD133 positivas después de 10 días de cultivo en el biorreactor (Figura S1 C, CSLCs enriquecidos).
imagen de la fase a) Contraste de un grupo de CSLCs enriquecidos después de 7 días de cultivo en un biorreactor hydrofocusing. B) inmunodeficientes ratones desnudos (nu /nu) inyectados con 1 x 10∧2 células ependimoma MacSorted CD133 (+) células o (+ células CD133 ependimoma) obtenidas en el biorreactor hydrofocusing, con la ayuda de 100 l de matrigel en el flanco formado un tumor dentro de los 3 meses en comparación con CD133 (-) células
para verificar el tumor iniciar la capacidad de las células HFB crecido, inyectamos 5 inmune ratones /grupo nude deficiente una gama de 1. × 10∧2, 1 × 10∧3, 1 × 10∧4, y 1 × 10∧5 las células cultivadas en la HFB (~96% CD133 +) y se comparó su crecimiento a un número igual de CD133 (+) células MACsorted y CD133 (-) de las células durante 3 meses. Hemos observado que tanto 1 × 10∧2 MacSorted CD133 (+) células o la CD133 (+) del biorreactor creció en todos los ratones inmunodeficientes inyectados y formó un tumor palpable dentro de las 12 semanas (Figura 3B).
Para realizar el ensayo ChemoID un número comparable de células (1 × 10∧5) mayor parte de las células tumorales cultivadas como una monocapa y CSLCs enriquecidos en el biorreactor 2D [8] se sembraron por separado en placas de 96 pocillos (n-5 réplicas) y fueron tratados durante una hora con una serie de fármacos contra el cáncer en un intervalo de concentraciones que incluye la dosis clínicamente relevante (Tabla 2). ChemoID ensayo se realizó con un grupo de medicamentos que comprenden de cisplatino, oxaliplatino, arabinósido-C, VP-16, busulfán, metotrexato, irinotecán y bevacizumab como elegido por el oncólogo tratante.
La sensibilidad a la quimioterapia se evaluó a las 48 horas de ensayo WST8 viabilidad. Se clasifican de la siguiente basado en el porcentaje de células no viables: sensible (la supervivencia celular 0-40%), (supervivencia de las células 40 a 70%) intermedio, y no responde (supervivencia de las células 70 a 100%). El ensayo se llevó a cabo WST8 tres veces por separado con réplicas n-5 así /fármaco /dosis cada vez.
ChemoID ensayo mostró que las células cultivadas en monocapa ependimoma y que representan la mayor parte de las células tumorales fueron sensibles a dosis clínicamente relevantes de cisplatino, irinotecan, busulfan, y una combinación de irinotecán y bevacizumab de una manera estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). Curiosamente, los CSLCs fueron sensibles a una combinación de irinotecán y bevacizumab (p & lt; 0,05), de forma intermedia sensibles a cisplatino, e irinotecán, pero no es sensible a busulfan. Por otra parte, tanto los CSLCs y la mayor parte de las células tumorales no fueron sensibles a metotrexato, oxaliplatino, arabinósido-C, y VP-16 (Figura 4).
1 × 10∧3 mayor parte de las células tumorales o CSLCs sembraron en 5 réplicas en placas de 96 pocillos fueron desafiados para un pulso de 1 hora con un panel de medicamentos contra el cáncer indicadas por el oncólogo. Un ensayo de WST-8 se llevó a cabo de 48 horas siguientes tratamientos de quimioterapia para evaluar la viabilidad celular. Los datos se representan en el gráfico de barras tan sensible (0-40% de viabilidad celular), moderadamente sensible (40-70% de viabilidad celular), y que no responde (70-100% de viabilidad celular). barra gris claro representan sensibilidad de CSLCs a la quimioterapia con respecto a las células control no tratadas negativos. barra gris oscuro representa la sensibilidad de la mayor parte de las células tumorales a la quimioterapia con respecto a las células control no tratadas negativos. medicamentos contra el cáncer probados indican en la parte inferior del diagrama. El análisis estadístico de la significación de los resultados se realizó con un ANOVA de 1 vía. Los asteriscos indican los valores de
p
de menos de 0,05.
Debido a la falta de respuesta a una gestión de oxaliplatino y etopósido dada en agosto de 2009 (Figura 2B) (que se inició antes de la la recepción de los resultados del ensayo ChemoID), la paciente fue sometida en octubre de 2009 un tratamiento con bevacizumab e irinotecán, que fue administrado cada dos semanas durante 6 meses. En un seguimiento de la RM escanear en mayo de 2010 el paciente mostró una regresión de la enfermedad inicial que queda libre de progresión de la enfermedad durante 18 meses (Figura 2 C y D). Esto se corresponde con el más largo periodo sin progresión de la enfermedad observada en este paciente sin cirugía mayor-de aumento de volumen.
La recurrencia del crecimiento del tumor después de 18 meses de la enfermedad libre de progresión nos llevó a explorar nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento de este paciente de cáncer. En este sentido, la quimioterapia de combinación se investigó con el fin de identificar los compuestos naturales que pueden aumentar la eficacia clínica de medicamentos contra el cáncer.
BITC se ha demostrado en otros laboratorios [14], [15] para aumentar la quimiosensibilidad del cáncer Células. Hemos observado recientemente en nuestro laboratorio (datos no mostrados) que isotiocianato de bencilo (BITC) aumenta específicamente la quimiosensibilidad de las células de cáncer positivo CD133. Debido a que las células primarias ependimoma de nuestro paciente muestran un alto porcentaje de células positivas para CD133, hemos querido poner a prueba la hipótesis de que podría aumentar su BITC quimiosensibilidad a irinotecán y bevacizumab. Encontramos con el ensayo ChemoID que concentraciones crecientes de BITC que van desde 2,5 mM a 20 mM disminuyeron la viabilidad de las células ependimoma CD133 (+) de Paciente 1 de 90% a 62% de una manera estadísticamente significativa (Figura 5A). ensayo ChemoID determinó también que la combinación de irinotecán y una concentración no tóxica de 10 M BITC redujo la viabilidad de las células ependimoma de 60% a 40% (más del 40% más sensible a la quimioterapia en comparación con no BITC células tratadas) (Figura 5 B) . Además, la combinación de irinotecán y bevacizumab con BITC reduce aún más la viabilidad de las células ependimoma a 30% (Figura 5 B). El paciente fue tratado con irinotecan y bevacizumab, pero esta vez con la combinación de 2 cápsulas /día de un extracto vegetal Triple Action crucífera que contiene una alta concentración de BITC (LifeExtension, http://www.lef.org), durante dos meses. Después de la terapia de combinación de irinotecán, bevacizumab y el suplemento de verduras crucíferas, hemos observado una regresión 4 cm (que corresponde a una regresión 50%) de las lesiones en la columna torácica y la zona cervical [comparar Figura 5C (en la recurrencia) a Figura 5D (después de la terapia)]. Adicionalmente, informamos que el paciente era capaz de tolerar todo el curso del régimen de quimioterapia irinotecán y bevacizumab con menos fatiga y tolerancia al frío.
A) 1 × 10∧3 CSLCs chapados en 5 réplicas en 96 pocillos placas fueron desafiados para un pulso de 1 hora con 2,5, 10, y 20 mM BITC. Un ensayo de WST-8 se llevó a cabo de 48 horas después de los tratamientos para evaluar la viabilidad celular. B) 1 × 10∧3 CSLCs sembraron en 5 réplicas en placas de 96 pocillos fueron desafiados para un pulso de 1 hora con 10 BITC mu M seguido por un pulso de 1 hora con mM CPT-11 0.5. Un ensayo de WST-8 se llevó a cabo de 48 horas después del tratamiento de quimioterapia para evaluar la viabilidad celular. Los datos se representan en el gráfico de barras tan sensible (0-40% de viabilidad celular), moderadamente sensible (40-70% de viabilidad celular), y que no responde (70-100% de viabilidad celular). barra gris claro representan sensibilidad de CSLCs a la quimioterapia con respecto a las células control no tratadas negativos. barra gris oscuro representa la sensibilidad de la mayor parte de las células tumorales a la quimioterapia con respecto a las células control no tratadas negativos. El análisis estadístico de la significación de los resultados se realizó con un ANOVA de 1 vía. Los asteriscos indican los valores de
p
de menos de 0,05. C) 2012 resonancia magnética de la columna vertebral que muestra la recurrencia cervical y torácica después de un período de 18 meses libre de progresión. D) 2012 resonancia magnética de la columna cervical que muestra marcada regresión del tumor de la lesión torácica después del tratamiento combinado con irinotecan (CPT11), bevacizumab (Avastin), y la suplementación BITC.
La eficacia de las quimioterapias proyectará en vitro por el ensayo de ChemoID se pusieron a prueba en las células ependimoma de paciente 1 que eran xenoinjertado en un NOD-
Scid
modelo de ratón (Figura 6 a y B).