Extracto
macrófagos asociados a tumores son conocidos por influir en la progresión del cáncer mediante la modulación de la función, la angiogénesis y la metástasis de células inmunes, Sin embargo, poco se sabe acerca de las redes de señalización de quimiocinas que regulan este proceso. La utilización de células de cáncer de colon CT26 y macrófagos RAW 264.7 como un modelo de sistema celular, se demuestra que el tratamiento de células CT26 con RAW 264.7 medio condicionado induce la migración celular, invasión y metástasis. el análisis de microarrays de genes inflamatorios indicó estimuladas con CT26 RAW 264,7 macrófagos regular al alza SDF-1α y VEGF, y que estas citoquinas contribuyen a la migración CT26
in vitro
. RAW 264,7 macrófagos también mostraron una respuesta quimiotáctica sólido hacia quimiocinas derivadas-CT26. En particular, el análisis de microarrays y pruebas funcionales revelaron CSF-1 como el principal quimioatrayente para macrófagos RAW 264.7. Curiosamente, en el modelo de pollo CAM de la progresión del cáncer, RAW 264.7 macrófagos localizados específicamente a la periferia del tumor en el que se encontraron para aumentar el crecimiento CT26 tumor, la densidad microvascular, la interrupción vascular, y la metástasis de pulmón, lo que sugiere que estas células hogar de invadir activamente áreas de la tumor, pero no el núcleo hipóxica de la masa tumoral. En apoyo de estos resultados, las condiciones de hipoxia regulados por la producción de CSF-1 en varias líneas de células tumorales y la disminución de la migración RAW 264,7 macrófagos
in vitro
. Juntos, nuestros resultados sugieren un modelo en el comunicado de las células tumorales de normoxia CSF-1 para reclutar macrófagos a la periferia del tumor donde se segregan de la motilidad y angiogénicos factores que facilitan la invasión de células tumorales y la metástasis
Visto:. Verde CE, Liu T, Montel V, Hsiao G, Lester RD, Subramaniam S, et al. (2009) quimiotáctica de señalización entre las células tumorales y los macrófagos regula la migración de las células del cáncer, la metástasis y la neovascularización. PLoS ONE 4 (8): e6713. doi: 10.1371 /journal.pone.0006713
Editor: Derya Unutmaz, Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York, Estados Unidos de América
Recibido: 22 de mayo de 2009; Aceptado: 9 Julio 2009; Publicado: 21 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Green et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. CEG, TL y R.L.K son apoyados por subvenciones del NIH R01CA097022 y R01GM068487. V. M., R.D.L y S.L.G. son apoyados por NIH subvención R01CA94900. G. H. S. S. y están soportados por el NIH subvención R01GM078005. www.nih.gov. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la propensión a los tumores para el progreso y metástasis refleja no sólo las mutaciones oncogénicas en las células cancerosas, pero también las interacciones dinámicas que implican células no malignas en el microambiente de las células tumorales. Las células no malignas que se infiltran en un cáncer en desarrollo incluyen fibroblastos, adipocitos, células endoteliales, células perivasculares y células inmunes, todos los cuales pueden contribuir a la progresión del cáncer [1]. Entre las células inmunitarias, los macrófagos se ha demostrado que desempeñan un papel de apoyo, la promoción de la supervivencia del tumor celular, la proliferación y la metástasis [2]. macrófagos asociados a tumores (TAM) se derivan de monocitos circulantes de sangre periférica que son atraídos por la vasculatura del tumor en el que se extravasan en el intersticio y se diferencian [3]. Aunque homing de macrófagos a los tumores no se conoce bien, se sabe que las células tumorales para liberar quimioatrayentes macrófagos incluyendo CCL2, CCL5, CCL7, CCL8, CXCL12, VEGF y CSF-1 [4]. En comparación con los macrófagos activados clásica (M1) que funcionan como las células efectoras primarias en el sistema inmune innato, M2 TAM apoyo supervivencia del tumor mediante la promoción de la angiogénesis local y la remodelación de tejidos, mientras que la supresión de la respuesta inmune [5]. TAM localizar a las áreas invasivas del tumor donde secretan una variedad de citocinas y proteasas implicadas en la invasión de células tumorales y la metástasis [6], [7]. En este papel, los TAM contribuir activamente a la progresión del tumor y la transición a la malignidad que a menudo se correlaciona con un mal resultado clínico. Sin embargo, el desciframiento de las redes de quimiocinas de células de tumor que regulan la progresión del cáncer
in vivo
sigue siendo un reto importante.
La angiogénesis, que es crítica para la progresión del cáncer, es controlada por una variedad de factores conocidos estimular el crecimiento de los vasos sanguíneos y /o la maduración, incluyendo VEGF, TGF-β, EGF, bFGF y TNF-α. TAM representan una fuente principal de muchas de estas proteínas angiogénicas en el microenvironement tumoral [8], [9], [10]. En particular, VEGF es liberada por TAM y es un potente estímulo para el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, aumento de la densidad microvascular, la interrupción vascular, y de fugas [11]. Los vasos sanguíneos que están experimentando remodelación son porosos y frágiles y por lo tanto más susceptibles a la intravasación de células tumorales [12]. Por lo tanto, en la parte delantera invasiva, TAM puede promover la metástasis de tumores mediante la estimulación de la formación de redes microvasculares densas de vasos con fugas que son permisibles a la intravasación de células tumorales, mientras que la activación simultánea de migración de células de cáncer y la invasión por la liberación de una variedad de quimioquinas, mitógenos y proteasas.
Además de la parte delantera invasiva, TAM también puede localizarse en el núcleo hipóxico avascular del tumor [13], [14]. VEGF es liberada por TAM en el núcleo del tumor en respuesta a la hipoxia y la estabilización de HIF1α y HIF2α [15], [16]. VEGF también pueden estar involucrados en TAM de reclutamiento para el núcleo del tumor, además de otros factores mal definidos presentes en los residuos celulares como resultado de la necrosis del tumor [13]. Una vez localizado en el núcleo, TAM podrá no sólo los restos celulares clara, pero también regulan la neovascularización tumoral y la supervivencia. Por lo tanto, hay subconjuntos de TAMs que se distribuyen diferencialmente en el microambiente tumoral que pueden servir funciones especializadas durante la progresión del cáncer [2]. Nuestra hipótesis es que la oxigenación del tumor es un determinante importante de la actividad de los macrófagos en los cánceres. Por ejemplo, en el núcleo del tumor hipóxico, TAM puede ser principalmente angiogénico y fagocítica, mientras que en condiciones de normoxia en la periferia del tumor, TAM puede contribuir a la metástasis tumoral mediante el aumento de la remodelación tisular y la densidad vascular. En este último caso, la liberación de VEGF por TAM se puede regular de forma independiente de la hipoxia a través de interacciones con las células tumorales invasivas o células del estroma.
La comprensión del papel de TAM en la progresión del cáncer de
in vivo
se complica la capacidad de descifrar en la multitud de factores presentes en el microambiente del tumor. Por lo tanto, los sistemas modelo que recapitular
in vivo interacciones
tumor de células-TAM
in vitro
son necesarios para ayudar a desentrañar las complejidades de la progresión tumoral y la metástasis en condiciones definidas. En el presente estudio, hemos desarrollado un sistema modelo para investigar directamente la señalización de citoquinas entre las células de cáncer de colon CT26 y RAW 264,7 macrófagos. El uso de este sistema de modelo único, se demuestra que los macrófagos RAW 264.7 y células tumorales CT26 se atraen mutuamente el uno al otro y que los macrófagos inducen un fenotipo altamente migratorias y protrusión en las células tumorales. Inflamatoria análisis conjunto de genes y pruebas funcionales revelaron que derivado de células del tumor CSF-1 es el principal factor quimiotáctico de macrófagos RAW 264.7, mientras que los macrófagos derivados SDF-1α y VEGF contribuyen a la invasión de las células cancerosas CT26. Además, un total de 270 genes en macrófagos RAW 264.7 y 85 genes en las células tumorales CT26 fueron arriba o hacia abajo-regulada durante la incubación en medios acondicionados, lo que sugiere que las vías adicionales más allá de los ensayados se activan durante probable señalización bidireccional. En CAM de pollo inoculados con células tumorales, los macrófagos RAW 264.7 se localizan en la periferia del tumor, donde se facilitan la remodelación vascular y potencian metástasis de células tumorales a los pulmones de pollo. Estos resultados apoyan un modelo en el que la señalización paracrina entre las células tumorales y los macrófagos regula la localización de los macrófagos en el tumor y la propensión de las células tumorales a la metástasis.
Materiales y Métodos
líneas celulares, reactivos y anticuerpos
CT26 línea de cáncer de colon de ratón, los macrófagos RAW 264.7 línea de ratón y MDA-MB-468 línea de cáncer de mama se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). CL16, una variante metastásica de MDA-MB-435, se derivó como se describió anteriormente [17]. células CT26 se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad CA) y 1% de glutamina. RAW 264.7, MDA-MB-468 y CL16 células se cultivaron en DMEM (Invitrogen, Carlsbad CA) suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 1% glutamax (Invitrogen, CA). RAW 264.7 que expresan GFP se realizaron infectando células con Lenti-Green sobrenadante (BioGenova, Rockville, MD). Las mayores células que expresan el 0,1% fueron luego ordenados por FACS. células CT26 que expresan DsRed se generaron mediante la infección de células con el lentivirus, pEF1-DsRed-pur, seguido de selección en puromicina (1 mg /ml). Donde se indique, las células fueron tratadas con el bloqueo anti-CSF-1R mAb (AFS98, eBioscience, San Diego, CA), el bloqueo anti-EGF-R (Millipore, Billerica, MA), de ratón recombinante CSF-1 (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN), EGF recombinante de ratón (amp I +;.; D Systems, Minneapolis, MN), ratón SDF-1α recombinante (Millipore, Billerica, MA) o VEGF 165 recombinante (Millipore, Billerica, MA)
celular cuantitativa ensayos de migración e invasión
en la imagen de lapso de tiempo de la migración celular en co-cultivo, RAW 264.7-GFP se incubaron en fibronectina (10 g /ml, Sigma-Aldrich) recubiertas Lab-Tek cámara de diapositivas (Nunc, Rochester, NY) durante 30 min a 37 ° C antes de la adición de CT26-DsRed (10
7 células /ml). Una vez que se añadieron CT26, la diapositiva cámara se colocó inmediatamente en una Inc-2000 Sistema de Incubadora (20/20 Technology Inc., Wilmington, Carolina del Norte) y luego fotografiado a 20x (NA = 0,75) durante 15 horas a 4 imágenes /hr utilizando una Nikon C1-Si invertida microscopio confocal (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) equipado con detectores PMT y láseres apropiados para GFP (488 nm) y DsRed (561 nm). descanned imágenes fueron adquiridas mediante Nikon software EZ-C1 a continuación, prestados para el seguimiento y análisis de células usando la forma Imaris (Bitplane, Saint Paul, MN). Tras la adhesión, la ubicación de los centroides de las células CT26-DsRed individuales coordenadas se registraron en cada trama sobre el transcurso de tiempo de migración. Estas coordenadas se utilizan para crear pistas de migración de las cuales se determinaron la rectitud migración, el desplazamiento y la distancia total. La migración es la rectitud valor sin unidades que relaciona el número de puntos de ramificación o convierte en una pista a la distancia total de la migración. Longitud total de migración se determinó sumando migración paso a distancias cada cuadro lo largo de la secuencia de vídeo. desplazamiento neto de migración se cuantificó como la distancia directa entre el inicio de la migración y el fin de la migración. El índice de forma es la relación de la longitud del eje mayor a lo largo del eje menor para las células individuales de orugas sobre el transcurso de tiempo de la migración.
Se realizaron
Ensayos de quimiotaxis como se describe previamente con modificaciones menores [18]. Brevemente, modificado cámaras de Boyden (Transwell, 6,5 mm de diámetro; Corning, Lowell, MA) que contienen membranas de policarbonato con 8 micras poros fueron revestidas en ambos lados con fibronectina (10 g /ml, Sigma-Aldrich) durante 2 h a 37 ° C, se enjuagó una vez con PBS, y luego se coloca en la cámara inferior que contiene 500 l de tampón de adherencia migración (MAB; DMEM con 0,1% de BSA fracción RIA de grado V (Sigma-Aldrich), 1% de penicilina-estreptomicina y 1% de glutamina), medios completos (DMEM suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 1% de glutamina), medio acondicionado o tampón de migración que contiene SDF-1α (100 ng /ml), VEGF165 (10 ng /ml), EGF (100 ng /ml) o CSF-1 (40 ng /ml), como se indica. medios condicionados se recogieron de CT26 o RAW 264.7 culturas tras 48 horas de incubación a 37 ° C. Las diluciones de medios condicionados se hicieron en medio de cultivo base apropiada. Donde se indique, anti-CSF-1R (20 mg /ml) y anti-EGF-R (20 g /ml) estaban presentes en ambos pozos superior e inferior a lo largo del ensayo. Privadas de suero RAW 264.7 o células CT26 fueron retirados de las placas de cultivo con solución salina equilibrada de Hanks que contiene EDTA 5 mM y Hepes 25 mM, pH 7,2, y 0,01% de tripsina, se lavaron dos veces con tampón de migración, y luego se resuspendieron en tampón de migración en 10
6 células /ml. 10
5 células en tampón de migración 100 l se añade a la parte superior de cada cámara de la migración y se dejó migrar a la cara inferior de la membrana porosa durante diversos tiempos, por triplicado. RAW 264.7 emigró durante 24 horas en todas las condiciones y CT26 emigró durante 3 horas en todas las condiciones. Las células no migratorias en la superficie de la membrana superior se eliminaron con un hisopo de algodón, y las células migratorias unidos a la superficie inferior de la membrana se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en 0,1 M de borato, pH 9,0, y 2% de etanol durante 20 min a la habitación temperatura. El número de células por chemotaxing membrana se contó usando un microscopio de contraste de fase invertida a 40X. Para RAW 264.7 quimiotaxis en condiciones de hipoxia, la cámara inferior se complementó con DMEM completo que contiene 10% de SFB para crear un gradiente quimiotáctico. RAW 264.7 fueron autorizados a emigrar durante 24 horas en condiciones de normoxia (21% de oxígeno) o hipoxia (1% de oxigeno) utilizando una incubadora ISOTEMP (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). células migratorias se fijaron con 100% de metanol durante 5 min y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en 0,1 M de borato, pH 9,0, 2% de etanol durante 20 min. Las membranas se cortaron de la Transwell y se colocaron en 200 ml de 10% de ácido acético para eluir la mancha entonces absorbancia se leyó a 570 nm.
Para examinar la invasión de macrófagos en colágeno, CT26-DsRed o fluorescente de color rojo (580 nm de excitación /605 nm de emisión) microesferas de poliestireno (10 m; Molecular Probes, Carlsbad, CA) se incrusta en gel de colágeno filtrado estéril tipo 1 (PureCol; Nutacon, Leimuiden, Países Bajos) que contenía 1X RPMI (Sigma-Aldrich), 25 mM de sodio bicarbonato y se ajustó a pH 7,4 utilizando hidróxido de sodio 0,1 M, tal como se describe anteriormente [19]. La solución de colágeno que contiene CT26-DsRed (10
7 células /ml) o perlas (10
7 perlas /ml) se dejó en gel en 10 ml de alícuotas de fibronectina (10 mg /ml, Sigma-Aldrich) recubierto Lab-Tek cámara de diapositivas (Nunc, Rochester, NY) durante 30 min antes de la adición de RAW 264.7-GFP (10
5 células /ml). la migración inicial de RAW 264.7-GFP en la interfaz con la caída de colágeno Se obtuvieron imágenes a 20x (NA = 0,75) durante 12 horas a 4 cuadros /hr utilizando una Nikon C1-Si invertida microscopio confocal (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) equipado con detectores PMT y láseres apropiados para GFP (488 nm) y DsRed (561 nm). descanned imágenes fueron adquiridas mediante Nikon software EZ-C1 a continuación, prestados para el rastreo de células usando Imaris (Bitplane, Saint Paul, MN). Ubicación coordenadas de centroides para individuales RAW 264.7-GFP se registraron en cada cuadro sobre el transcurso de tiempo de la migración. Estas coordenadas se utilizaron para calcular el desplazamiento y la distancia total migran para las células dentro y fuera de 100 micras de la frontera gota de colágeno. Las láminas fueron incubadas durante otros 7 días, utilizando imágenes de microscopía confocal (10X; NA = 0,45). A 1 micras incrementos a lo largo de todo el eje Z de la caída de colágeno
pollo CAM Ensayo
El ensayo de metástasis de embrión de pollo se llevó a cabo como se describe anteriormente [20], [21]. Brevemente, CT26-DsRed (2 × 10
6 células) solo o combinado con RAW 264.7-GFP (2 × 10
5 células) se suspendieron las células en hielo en Matrigel (BD Bioscience) fue inoculado en el corioalantoidea de pollo membrana (CAM) en el día de desarrollo 9. Después de 11 días, en días de desarrollo 20, los embriones fueron sacrificados y se extrajeron los tumores primarios, proyectado en 0.63x y 2X por estereomicroscopía, pesados y medidos para el diámetro. El corazón y los pulmones fueron aislados, y la difusión celular se cuantificó contando los racimos de células mediante microscopía confocal a 10X (NA = 0,45) con una distancia de paso de 1 m. Los tumores se seccionaron y posteriormente se colocan directamente sobre un cubreobjetos de vidrio para la formación de imágenes por microscopía confocal (10X; NA = 0,45). Los tumores se obtuvieron imágenes de 0 a 0,5 cm de la periferia o borde (periferia tumor), 0,5 cm a 1 cm de la periferia (pared tumor) y 1,0 cm a 3 cm de la periferia del tumor (núcleo tumor). La cuantificación de RAW 264.7 distribución-GFP dentro de los tumores CT26-DsRed se determinó promediando mapas de bits GFP pixel sobre un campo de vista para producir una intensidad de fluorescencia media para cada región del tumor usando Image Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics, Bethesda , MD). De brillo y contraste se hicieron ajustes por igual a todos los canales y no modificaron las diferencias relativas entre la intensidad de GFP píxel en diversas regiones del tumor.
qPCR
CT26, MDA-MB-468 o CL16 las células tumorales se incubaron a 37 ° C en el medio completo apropiado por 24 hrs bajo condiciones hipóxicas (1,0% de oxígeno) o de normoxia (21% oxígeno). a continuación, el ARN total se extrajo utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ADNc se sintetizó a partir de 2 g de ARN total utilizando el kit de síntesis de cDNA iScript (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). qPCR se realizó con un instrumento System 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un programa de un solo paso: 95 ° C, 10 min; 95 ° C, 30 ×, 60 ° C, 1 min durante 40 ciclos. los niveles de CSF-1 y GAPDH mRNA se midieron por triplicado y se normalizó en contra de HPRT-1 mRNA.
Microarray análisis
Para examinar la expresión de genes inflamatorios, tampones acondicionados se recogieron de CT26 o RAW 264.7 culturas siguiente 48 horas de incubación a 37 ° C y se aplica a cultivos de células del tipo opuesto durante 24 hrs. a continuación, se aisló el ARNm utilizando el kit RNeasy (Quiagen, Valencia, CA), a transcripción inversa utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se analizaron por triplicado por hibridación a la Codelink mamíferos inflamación Bioarray que contiene solo varados 30 -mer sondas de oligonucleótidos (GE Healthcare, Piscataway, NJ), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. la expresión génica prima para las réplicas se promedió y normalizó utilizando el Software de Análisis de Expresión Génica CodeLink v5.0 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Para determinar estadísticamente la regulación positiva o regulación a la baja de las transcripciones de genes significativa, se aplicó la varianza Modelado posterior Inferencia con regional Exponenciales (VAMPIRO) el análisis de microarrays suite de web para los valores de expresión de transcripción en bruto, tal como se describe anteriormente [22], [23]. En cuanto al error de grupo asociado a múltiples comparaciones se corrigió usando un conservador de Bonferroni corregido umbral del 5% (alfa = 0,05). La agrupación jerárquica de matriz de datos estandarizados se realizó utilizando dChip (distancia: correlación, vinculación: centroide) en base a las anotaciones de ontología de genes para la angiogénesis, la proliferación celular y la quimiotaxis [24]. Para el análisis de mapa de calor, las puntuaciones de intensidad se calcularon en base a la importancia del gen de la altura o baja regulación, según lo determinado por análisis de vampiro. Estos genes fueron organizan en base a las anotaciones de ontología de genes para la angiogénesis, la proliferación celular y la quimiotaxis utilizando dChip (distancia métrica: correlación, vinculación método: promedio).
El análisis estadístico se realizó
Análisis de los datos utilizando la versión 4.0 del software GraphPad Prism (GraphPad software, San Diego, CA.). Todos los datos se presentan como media ± SE. los datos del grupo no paramétricos se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) y la prueba posterior Neuman-Keuls. los valores medios de Gauss-distribuido fueron analizados por Estudiante
t
prueba. comparaciones de grupos se consideraron significativas para 2 colas
valores de P inferiores a 0,05
.
Resultados
Migración y morfológico El análisis de las células del cáncer CT26 co-cultivadas con macrófagos RAW 264.7
en primer lugar, se realizó un análisis cinemático del comportamiento de la migración de células tumorales y cambios en la forma celular determinada en respuesta a co-cultivo con macrófagos. Para examinar directamente cómo macrófagos alteran el comportamiento migratorio y la persistencia de células de cáncer de colon, células de cáncer de colon de ratón CT26 fueron imágenes por microscopía confocal durante el co-cultivo durante 15 horas en presencia o ausencia de macrófagos RAW 264.7 del ratón (Fig. 1
Un
). células CT26 solo exhibieron una longitud total de 199 ± migración de 78 micras (media ± DE) (Fig. 1
B Opiniones). Este valor era indistinguible de CT26 co-cultivadas con células RAW 264.7, que exhibió una longitud de migración de 154 ± 46 micras. Sin embargo, a pesar de longitudes de migración similares, CT26 que fueron co-cultivadas con células RAW 264.7 migrado a lo largo de un camino significativamente más recta, con valores de rectitud de 0,34 para CT26 co-cultivadas con células RAW 264.7 en comparación con 0,15 para CT26 sola (Fig. 1
B Opiniones). Este aumento de 2 veces en la rectitud fue acompañado por un aumento significativo de desplazamiento total o persistencia de la migración por las células CT26 co-cultivadas con células RAW 264.7. células CT26 co-cultivadas con los macrófagos mostraron un desplazamiento promedio de 49 ± 24 micras en comparación con 28 ± 20 micras para las células CT26 solo (Fig. 1
B
). Estos hallazgos sugieren que los macrófagos RAW 264.7 promueven la migración de las células CT26
in vitro
. Es importante destacar que las células CT26 se cultivaron con o sin los macrófagos mostraron viabilidad similar. De hecho, el análisis de crecimiento de células tumorales durante varios días indicó que las células CT26 crecieron más rápidamente en presencia de macrófagos (resultados no mostrados). Co-cultivo de células RAW 264.7 con células CT26 no cambió la adhesión celular 264.7 RAW a las proteínas de la matriz extracelular. Además, la evaluación de la conducta 264.7 de células RAW en este ensayo no reveló diferencias significativas en la distancia de migración, el desplazamiento, la rectitud, o forma de la célula cuando las células fueron co-cultivadas con células CT26 (resultados no mostrados), lo que sugiere la ausencia de gradientes químicos suficientes de la quimiotaxis de macrófagos. En conjunto, estos hallazgos indican que los macrófagos RAW 264.7 inducen la migración de células de cáncer persistente en superficies CT26 2-D.
A, B) CT26-DsRed (10
5 /ml) se incubaron en la fibronectina con RAW 264.7 GFP (10
5 /ml), como se indica, durante 12 horas a 37 ° C. Durante este tiempo, la rectitud, la longitud total recorrida y el desplazamiento acumulado total de centroides de células CT26 individuales fueron rastreados (líneas amarillas) a 4 imágenes /hr en presencia y ausencia de macrófagos RAW 264.7 mediante microscopía confocal a 20X. Los datos se presentan como la cuantificación pista individual de 55-75 células de más de 3 experimentos, con la media indicada por bar. barra de escala de aumento representa 30 micras. * Indica una diferencia significativa en la rectitud ruta de migración (p & lt; 0,0001). ** Denota una diferencia significativa en el desplazamiento ruta de migración (p & lt; 0,0001).
La capacidad de las células cancerosas para formar invadapodia y de membrana protuberancias se ha relacionado con aumento de la migración y la invasión de tejidos [25]. Por lo tanto, se analizó la morfología celular CT26 en respuesta al co-cultivo con macrófagos RAW 264.7. Dentro de 6 horas, co-cultivo con los macrófagos RAW 264.7 promueve un fenotipo mesenquimal mejorada en las células CT26, caracterizado por numerosas protuberancias de membrana largos que irradiaban hacia fuera desde el cuerpo de la célula (Fig. 2
A
). Esta morfología se mantuvo durante más de 12 horas y fue evidente en todas las células CT26 en el co-cultivo que estuvieron en contacto con uno o más macrófagos (Fig. 2
B
). Para determinar el tiempo mínimo necesario para que las células RAW 264.7 para provocar cambios en la morfología CT26, se midió la cinética de cambio de forma (Fig. 2
C
). A partir de la adhesión inicial de las células a la placa, los ejes mayor y menor de la migración de las células CT26 se determinaron cada 20 min a lo largo de 12 horas de cultivo con o sin células RAW 264.7 utilizando un portaobjetos de cámara y microscopía confocal. Como se preveía, las células CT26 solos o en co-cultivo fueron efectivamente redondo, sobre la adhesión inicial al plato con índices de forma de ~ 1. células CT26 incubadas con células RAW 264.7 fueron sometidos a una rápida elongación celular, ya que el eje mayor a lo largo de las extensiones de la membrana polarizadas era ~ 4 veces más largo que el eje menor tan pronto como 4 horas después de la adhesión celular inicial en comparación con células cultivadas en ausencia de RAW 264.7 macrófagos (Fig. 2
C
). El cambio de forma alcanzó una meseta a ~5.5 después de 8 horas de co-cultivo. Como era de esperar, las células CT26 que fueron cultivadas solas también mostraron un aumento inicial de extensión forma que se adhirieron y propagación. Sin embargo, en este caso, las células sólo se extienden salientes cortos y fracasaron para alargar significativamente, ya que el índice de forma sólo alcanzó un máximo de ~ 2 después de 6 horas de cultivo (Fig. 2
C
). En su conjunto, el análisis cuantitativo de la migración celular y la morfología dinámica CT26 indican que los macrófagos RAW 264.7 provocan un aumento rápido y sostenido de la migración de las células que se asocia con un aumento de la formación de protuberancias de la membrana.
DsRed-CT26 (10
5 /ml) se incubaron en la fibronectina con GFP-RAW 264.7 (10
5 /ml), como se indica, durante 15 horas a 37 ° C. Fluorescente imágenes fueron adquiridas mediante microscopía confocal (20X) a 4 imágenes /hr. A) Evolución temporal de Ds-Red-CT26 dinámica de más de 12 horas cuando se incuba solo o con macrófagos RAW 264.7-GFP. Las imágenes son representativas de movimiento CT26 más de 3 experimentos independientes. barra de escala de aumento representa 20 micras. B) acumulativa de distribución CT26-DsRed y protrusión después de 15 horas de incubación solos (derecha) o con macrófagos RAW 264.7-GFP (izquierda y centro, con el canal verde apagado). Las imágenes son representativos de 3 experimentos separados. barra de escala de aumento representa 30 micras. C) El índice de forma (eje mayor /eje menor) de las células CT26 en la presencia o ausencia de células RAW 264.7 se siguió más de 12 horas de migración. Los datos representan la media ± SEM de 10 celdas más de 3 experimentos independientes.
Los macrófagos RAW 264.7 y células tumorales CT26 liberan factores quimiotácticos solubles que Promueven recíproco quimiotaxis
A continuación examinó si la inducción de un fenotipo invasivo en las células CT26 por células RAW 264.7 se debe a una interacción directa con los macrófagos o una respuesta a factores quimiotácticos solubles liberados por los macrófagos utilizando un ensayo de cámara de Boyden estándar [18]. células CT26 demostraron una respuesta quimiotáctica y robusto dependiente de la dosis hacia un gradiente de células RAW 264.7 medio condicionado (CM), mientras que la exposición para controlar el medio basal sola no indujo una respuesta migratoria (Fig. 3
Un
). Es importante destacar que la migración celular fue predominantemente direccional hacia el gradiente de concentración, como la migración de las células tumorales se redujo en un ~ 60% cuando se añadió celular RAW 264.7 CM uniformemente a las cámaras, tanto superior e inferior (Fig. 3
Un
). Estos resultados indican que los macrófagos RAW 264.7 liberan factores solubles que promueven la migración direccional de células de cáncer de colon CT26.
A) CT26 (10
5 se añadieron /ml) a la parte superior de una cámara de Boyden con RAW 264.7 medio acondicionado, tampón de control o DMEM completo al pocillo inferior. CT26 se les permitió migrar durante 3 horas a 37 ° C antes de la tinción y cuantificación de la quimiotaxis. Los datos representan la media ± SEM de 15-30 campos seleccionados al azar más de 3-6 experimentos separados. * Denota significancia entre el 50% RAW CM y el control de los medios de comunicación (p & lt; 0,001) y el 50% RAW CM y 100% superior RAW CM /inferior (p & lt; 0,001). B) RAW 264.7 (10
5 se añadieron /ml) al pocillo superior de una cámara de Boyden con medios CT26 acondicionado, control de tampón o DMEM completo al pocillo inferior. RAW 264.7 se les permitió migrar durante 24 horas a 37 ° C antes de la tinción y cuantificación de la quimiotaxis. Los datos representan la media ± SEM de 15-30 campos seleccionados al azar más de 3-6 experimentos separados. ** Indica significancia entre 25% CT26 CM y el control de los medios de comunicación (p & lt; 0,001) y 25% CT26 CM y 100% superior CT26 CM /inferior (p & lt; 0,001). C) GFP-RAW 264.7 (10
5 /ml) se incubaron en recubiertos de fibronectina cámara de diapositivas con 10 l gotas de colágeno que contiene Ds-Red-CT26 (10
7 /ml) o 10 micras perlas fluorescentes rojas (10
7 /ml). la invasión de macrófagos en la caída del tumor incrustado o colágeno incrustado de perlas fue fotografiada después de 7 días a 10 veces por microscopía confocal. Vista lateral y ver imágenes superiores son representativos de la respuesta de los macrófagos promedio de más de 6 tumores de colágeno. Ampliación barra de escala para los mejores imágenes de vista representa 200 micras. D) La interfaz entre los macrófagos y la caída del tumor colágeno fue fotografiada usando microscopía confocal (20X) durante 12 horas a 4 fotogramas /hora después de la adición de RAW 264.7 a la diapositiva cámara. Durante este tiempo, la dinámica de la migración de macrófagos se cuantificó mediante el seguimiento de los centroides de células individuales a 4 imágenes /hr. Los macrófagos que inician la migración dentro de 100 m del límite del tumor (línea discontinua blanca) presentan pistas amarillas. Los macrófagos que inician la migración más allá de 100 m del límite del tumor exhiben pistas blancas. La imagen es representativa de la respuesta de los macrófagos promedio de 6 tumores de colágeno separadas. barra de escala de aumento representa 30 micras. E) el desplazamiento de pista y la longitud total de la pista se cuantificó para la migración de macrófagos dentro y más allá de 100 m del límite del tumor colágeno. Los datos representan la media ± SEM de 15 macrófagos dentro de 100 micras y 15 micras macrófagos más allá de 100 de los límites del tumor colágeno. #denotes una diferencia significativa en el desplazamiento ruta de migración (p & lt; 0,05). ## Denota una diferencia significativa en la longitud total de la ruta de migración (p & lt; 0,0001)
macrófagos RAW 264.7 mostraron una respuesta quimiotáctica robusto y dependiente de la dosis a un gradiente de CM de células CT26 (Fig 3
B Opiniones). De hecho, la extensión de la migración de células a sin diluir CM fue ~ 10 veces mayor que los niveles basales de la migración observada en respuesta a cualquiera de medio que contiene suero o tampón de migración que contiene sólo albúmina bovina. la migración de células RAW 264.7 era altamente direccional y no debido al movimiento chemokinetic azar como la adición de CT26 CM tanto a las cámaras superior e inferior abrogadas por completo la respuesta de migración (Fig. 3
B
). Curiosamente, en contraste con el sistema de co-cultivo donde RAW 264.7 no mostró un aumento en la distancia de migración o desplazamiento, el gradiente de factores quimiotácticos en la cámara de Boyden era suficientemente empinada para provocar la quimiotaxis robusta de macrófagos RAW 264.7.
Para investigar más la quimiotaxis de macrófagos hacia las células tumorales, se desarrolló un ensayo de migración 3D novela en la que se incluyeron células CT26 en gel de colágeno y el lugar gota a gota sobre un cubreobjetos con células RAW 264.7 distribuidos uniformemente a lo largo de la periferia de la matriz de gel. Como se muestra en la Fig.