Extracto
invasión celular es un mecanismo crucial de la metástasis del cáncer y los tumores malignos . Metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP-9) es una importante enzima proteolítica implicada en el proceso de invasión de células de cáncer. Los altos niveles de expresión de MMP-9 en el cáncer gástrico correlación positiva con la agresividad del tumor y tienen una correlación negativa significativa con el tiempo de supervivencia de los pacientes. Recientemente, los mecanismos de supresión de MMP-9 por fitoquímicos son cada vez más investigado. Chrysin, una sustancia química natural en las plantas, se ha informado que suprime la metástasis tumoral. Sin embargo, los efectos de la crisina sobre la MMP-9 expresión en el cáncer gástrico no han sido bien estudiados. En el presente estudio, hemos probado los efectos de la crisina sobre la MMP-9 expresión en células de cáncer gástrico, y se determinó su mecanismo subyacente. Se examinaron los efectos de la crisina sobre la MMP-9 expresión y la actividad a través de RT-PCR, zimografía, estudio promotor, y el Western Blot en células AGS de cáncer gástrico humano. Chrysin inhibida de forbol-12-miristato 13-acetato (PMA) inducida por MMP-9 expresión en una forma dependiente de la dosis. Uso de AP-1 oligodesoxinucleótidos señuelo, confirmamos que AP-1 fue el factor transcripcional crucial para MMP-9 expresión. Chrysin bloqueado AP-1 a través de la supresión de la fosforilación de c-Jun y c-Fos través del bloqueo de los /2 y ERK1 /2 vías JNK1. Además, las células AGS pretratados con PMA mostraron un marcado aumento de la invasividad, el cual fue parcialmente abrogada por la crisina y el anticuerpo MMP-9. Nuestros resultados sugieren que la crisina puede ejercer al menos parte de su efecto contra el cáncer mediante el control de MMP-9 expresión a través de supresión de la actividad AP-1 a través de un bloque de las JNK1 /2 y ERK1 /2 vías de señalización en las células AGS de cáncer gástrico.
Visto: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin Inhibe tumor promotor inducida por MMP-9 expresión mediante el bloqueo AP-1 a través de represión de ERK y JNK vías en células de cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10.1371 /journal.pone.0124007
Editor Académico: Pankaj K. Singh, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 5 de Octubre, 2014; Aceptado: 9 Marzo 2015; Publicado: 15 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Xia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación (0.720.570) desde el Centro Nacional del cáncer (www.ncc.re.kr), la subvención del Programa de Investigación de Ciencias básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación un Centro de Investigación médica de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2010 a 0.009.910, www.moe.go.kr), y (2012-000-9442) beca de la Fundación de Ciencias de Corea y la Ingeniería ( www.nrf.re.kr). Todos los proveedores de fondos anteriores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer gástrico ocupa el segundo lugar en la mortalidad global de cáncer, con un estimado de 990.000 nuevos casos y 738.000 muertes por cáncer en todo el mundo cada año como resultado, aunque la incidencia de carcinoma de estómago ha disminuido en las últimas décadas [1,2]. órgano distante o metástasis de tejido es un signo de mal pronóstico en pacientes con cáncer gástrico. La metástasis es la característica más mortal de los tumores malignos, lo que representa más del 90% de las muertes relacionadas con el tumor [2]. Se ha demostrado que la quimioterapia y la radioterapia no puede prolongar de manera significativa y mejorar la calidad de vida de los pacientes en aquellos casos en [3,4]. Las células tumorales de metástasis es un proceso muy complejo que comprende de la proliferación, migración, invasión, y la posterior adhesión y angiogénesis en otros órganos o tejidos [3].
Desde la invasión es una de las propiedades fundamentales de las células cancerosas malignas, el control de la invasión, es una importante diana terapéutica. matriz celular-extracelular (ECM) interacciones, la desconexión de adhesión intercelular, la degradación de la MEC, y la invasión de vasos linfáticos y sanguíneos son pasos importantes en la invasión del cáncer y la metástasis [5]. La invasión tumoral requiere un aumento de la expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) [6]. MMP, una familia de endopeptidasas dependientes de cinc que inducen la invasión celular y propagación del cáncer, juegan un papel crucial en la metástasis a través de la degradación de la MEC y la membrana basal [7]. Metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP-9), conocido como 92 kDa colagenasa de tipo IV o la gelatinasa B, es una de las MMPs más importantes, y se codifica por el gen de la MMP-9 en los seres humanos [8]. Se ha informado de que la sobreexpresión de MMPs puede aumentar el desprendimiento de células tumorales y la metástasis, que están asociados con malignidad y pobres resultados clínicos en diversos tipos de cáncer incluyendo el cáncer gástrico [9,10].
Debido a la función de MMP 9 en el curso de la enfermedad maligna, la supresión de los niveles de MMP-9 es una estrategia importante para controlar el cáncer. En los últimos años, cada vez más atención se ha centrado en la búsqueda de un inhibidor de MMP-9, sobre todo a partir de materiales de origen natural. Kim et al. silibinina descubierto que inhibe la expresión inducida por PMA MMP-9 a través de la supresión de la fosforilación de ERK en células MCF-7 de cáncer de mama humano [11]. Más recientemente, Khoi et al. informado de que (-) - nicotina inducida por bloques de epigalocatequina-3-galato MMP-9 expresión y de invasión a través de la supresión de NF-kB y AP-1 en las células endoteliales ECV304 [12]. Chrysin, 5,7-dihidroxiflavona, un tipo de flavonoide de origen natural, se ha conocido para inhibir la angiogénesis y la metástasis [13,14]. Lin et al. demostró que la crisina suprime la angiogénesis inducida por IL-6 a través de la regulación por disminución de la vía de señalización de IL-6 soluble receptor /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF [13]. Recientemente se ha informado de que la crisina podría aumentar la apoptosis dependiente de caspasa regulada por TRAIL en la línea celular HCT 116 y células CNE1 [15]. Yang et al. descubrió que la crisina suprime la invasión de células de una manera dependiente de la dosis en las células TNBC. Por otra parte, la crisina disminuye moléculas relacionadas con metástasis-vimentina, caracoles y babosas, y bloquea la vía de señalización Akt [16]. Sin embargo, los efectos inhibidores de la crisina en MMP-9, así como el mecanismo, no han sido bien estudiados, especialmente en células de cáncer gástrico. En el presente estudio, se investigó los efectos de Chrysin el PMA inducida por la expresión de MMP-9 en el cáncer gástrico, y reveló su mecanismo subyacente.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y condiciones de cultivo
la línea celular de cáncer gástrico humano AGS se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 0,6% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera que contiene 5% de CO
2. Para determinar los efectos de la crisina en PMA inducida por la expresión de MMP-9, las células se trataron previamente con diferentes concentraciones de crisina y luego tratados con PMA. El nivel de MMP-9 RNA mensajero (mRNA) se determinó por análisis de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). El papel de las vías de señalización específicos en la expresión inducida por PMA MMP-9 fueron examinados por el pretratamiento de las células AGS con el PD98059 ERK 1/2 inhibidor (New England Biolabs, Beverly, MA), el inhibidor SP600125 de JNK (Calbiochem, La Jolla , CA), el SB203580 inhibidor p38 MAPK (Calbiochem, la Jolla, CA), y crisina (Sigma Aldrich, EE.UU.) durante 1 hora antes de la estimulación con PMA.
la viabilidad celular
las células ( 5 × 10
3) se incubaron en una placa de 96 pocillos en medio RPMI con 10% de FBS que contiene 0-100 crisina mu M durante 24 horas, y la respiración celular se determinó mediante un establecido 3- [4,5-dimetiltiazol-2 il] -2,5-difeniltetrazolio (MTT; Sigma-Aldrich) de ensayo. Después de la incubación, 10 l de 5 mg /ml de MTT se añadieron a cada pocillo de las placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C durante 2 horas. Los gránulos obtenidos de formazán se disolvieron en 100% de dimetilsulfóxido, y la absorbancia a 570 nm se detectó con un pocillos 96 lector de ELISA (Biotek Inc., Winooski, VT, EE.UU.).
Gelatina zimografía
células pretratadas con o sin crisina durante 1 hora, se trataron con 100 nM PMA durante 20 horas. Después de la incubación, se recogió el sobrenadante y se realizó medios zimografía de gelatina para comprobar la actividad de MMP-9. Posteriormente, los medios de comunicación se mezcló con un volumen igual de 2P-9 activityrazolium b [mM Tris-HCl 62,5 (pH 6,8), 25% de glicerol, 4% de SDS, y 0,01% de azul de bromofenol] y se carga en una acrilamida 7,5%: bisacrilamida (29: 1; Bio-Rad, EE.UU.) de gel que contiene 625 mg /ml de gelatina (Sigma). Después de la electroforesis, el gel se lavó con 2,5% de Triton X-100 tres veces (20 minutos por hora), luego se incubaron durante 24 horas a 37 ° C, en el tampón de incubación [Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, 5 mM CaCl
2, y 1 mM ZnCl
2]. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie R250 (Bio-Rad, EE.UU.) durante 3 horas, y después se aclararon. La actividad proteolítica se reflejó como bandas claras contra el fondo azul de la gelatina de colores. Control de carga para zimografía de gelatina: gel de Coomassie Brilliant Blue R-250 mancha de 10% de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida sin gelatina, para mostrar la misma cantidad de sobrenadante se cargó en cada carril
PCR con transcripción inversa
el ARN total se extrajo de las células AGS usando el reactivo TRIzol (Invitrogen). Una g de ARN total se utiliza para la síntesis de ADN complementario de primera cadena utilizando cebadores aleatorios y la transcriptasa M-MLV (Promega). El ADN complementario se sometió a amplificación por PCR con los conjuntos de cebadores para GAPDH y MMP-9 usando una solución mezcla maestra de PCR (intrón, Corea). Las secuencias de los cebadores específicos fueron las siguientes: sentido GAPDH, 5 'TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3' y antisentido GAPDH, 5 'TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836 pb); y MMP-9 sentido, 5'-AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT -3 'y MMP-9 antisentido, 5'-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3' (497 pb); c-Jun sentido, 5'-GGA GAC AAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ', y c-Jun antisentido, 5'-GAA CCC CTC CTC CTG ATC TGT CAC GTT CTT-3' (287bp); sentido c-Fos, 5'-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 'y c-Fos antisentido, 5'-GAA TAA GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3' (246bp). Las condiciones de PCR fueron las siguientes:. Desnaturalización a 94 ° C durante 30 segundos, hibridación a 52 ° C durante 20 segundos y extensión a 72 ° C durante 30 segundos
Medición de MMP-9 actividad promotora
la regulación transcripcional de MMP-9 se examinó por la transfección transitoria de un constructo informador de luciferasa promotor-MMP-9 (pGL4-MMP-9). El pGL4-MMP-9 promotor plásmido (que abarca los nucleótidos desde -925 a +13) fue proporcionado amablemente por el Dr. Young-Han Lee (Universidad de Konkuk, Corea). células AGS se sembraron y cultivaron hasta que alcanzaron el 70% de confluencia. A continuación, los pGL4-MMP-9 promotor plásmidos se transfectaron en las células utilizando Fugene 6 (Promega, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. PRL-TK se transfectó como control interno. Las células se incubaron en el medio de transfección durante 12 horas y después se trataron con PMA durante 4 horas. Los efectos de la crisina sobre MMP-9 actividad del promotor se determinaron mediante el pretratamiento de las células con crisina durante 1 hora antes de la adición de PMA. Los estudios se realizaron co-transfección en presencia o ausencia del vector de expresión que codifica el dominante negativo mutante MEK-1 (PMCL-K97M), dominante JNK mutante negativo (PMCL-TAM67), o dominante MAPK negativo mutante p38 (PMCL-MP38 ) que fueron amablemente proporcionados por el Dr. GN Ahn (Universidad de Colorado-Boulder, CO), por el Dr. M. J. Birrer (Instituto Nacional del Cáncer, Rockville, MD), y por el Dr. J. Han (Instituto de Investigación Scripps, CA), respectivamente. Las células se recogieron con un reactivo de lisis de cultivo celular (Promega, EE.UU.), y las actividades de luciferasa se determinaron utilizando un luminómetro (Centro XS lb960 luminómetro de microplacas, Berthold Technologies, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Transient transfección de AP-1 reportero
La AP-1 plásmido indicador de luciferasa se adquirió de Clontech (Palo Alto, CA, EE.UU.). Cuando las células AGS alcanzaron 60 a 70% de confluencia, se lavaron con medio Opti-MEM y se transfectaron con un vector pGL-3 que contiene el reportero AP-1 utilizando Fugene 6 (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. células Reporter transfectadas se trataron previamente con crisina durante 1 hora y después se trataron con 100 nM PMA durante 4 horas y las actividades de luciferasa se midieron usando un luminómetro.
Transfección de AP-1 oligodesoxinucleótidos señuelo
sobre la base de la ATGAGTCAT sitio de unión de AP-1, hemos diseñado el señuelo AP-1 phosphorothioated desoxinucleótido oligo de doble hebra (ODNs) de la siguiente manera, 5'-CGST CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 ', y 3 'GAA -GsCA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TSGC-5'. Cuando las células AGS crecieron hasta 60-70% de confluencia, AP-1 y ODNs pGL4-MMP-9 promotor plásmidos se co-transfectaron en células utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Después de incubar durante 20 horas, las células transfectadas se trataron con PMA durante 4 horas y las actividades de luciferasa se midieron usando un luminómetro.
análisis de transferencia de Western
células AGS tratadas con PMA se lavaron en fosfato solución salina tamponada (PBS), individual usando tampón de tripsina-EDTA, y almacenadas a -70 ° C hasta que se necesite. La proteína celular se extrajo con un tampón RIPA [1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS)] y los inhibidores de proteasa (aprotinina, leupeptina, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidina, inhibidor de tripsina, ortovanadato de sodio ). Cincuenta microgramos de las proteínas se separan luego mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10% y se transfirieron a membranas de Hybond-P (Amersham Pharmacia Biotech). Las membranas se bloquearon en una solución de TBST que contiene 5% de leche desnatada, se incubaron con un anticuerpo primario en una solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C, y se lavaron tres veces con 0,1% de Tween-20 en solución salina amortiguadora Tris (TBST) a intervalos de 10 minutos . El rábano picante anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Amersham, Arlington Heights, IL, EE.UU.) se utilizó para detectar las proteínas inmunorreactivas por quimioluminiscencia. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-fosfo-p44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.), anti-fosfo-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP 9 (Cell Signaling Technology), anti-fosfo-c-Fos (Cell Signaling Technology), y anti-fosfo-c-Jun (Cell Signaling Technology). Los niveles de proteína total se sometieron a ensayo por lavado de la membrana sometida a transferencia con una solución de decapado compuesta por 100 mM 2-mercaptoetanol, 2% de SDS, y 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) durante 30 minutos a 50 ° C, y la membrana fue entonces re-probaron con o bien el anti-β-actina (Cell Signaling Technology), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-total de JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Biotecnología anti-total de Santa Cruz , Inc., CA, EE.UU.) o anti-c-Jun (Santa Cruz).
Matrigel invasión de ensayo
el ensayo de invasión de células se llevó a cabo utilizando la cámara de chemotasis 10 pocillos (Neuro sonda, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) con 8 M de membrana de poro (Neuro Probe) con un 10% de FBS que contiene RPMI como el quimioatrayente en la cámara inferior. células AGS (10
5 en 280 l) se añadieron a la cámara superior con PMA, en presencia de crisina, anticuerpo MMP-9 o no específica de IgG, y se incubaron a invadir el Matrigel durante 24 horas. Con el fin de determinar el efecto de la crisina y inhibidores de la señalización en la invasión de células inducida por PMA, las células AGS se preincubaron con la crisina, la curcumina, PD98059, o SP600125 durante 1 hora, y se incubaron con PMA para el período de la invasión 24 horas. Las células no invasoras en la superficie superior de cada membrana se retiraron de la cámara, y las células invasoras en la superficie inferior de cada membrana se tiñeron con el kit Quick-Diff mancha (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) . Después de dos lavados con agua, las cámaras se les permitió secar al aire. El número de células invasoras se contaron usando un microscopio de contraste de fase.
Estadísticas
Los datos se muestran como media ± desviación estándar, y representan la media de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado. Las diferencias entre cada dos conjuntos de datos se determinaron mediante pruebas t. Las diferencias que se describen como significativos en el texto corresponden a
P
. & Lt; 0,05
Resultados
Efecto inhibidor de la crisina en estimulados con PMA MMP-9 expresión
para investigar el efecto supresor de la crisina en contra de la regulación positiva de la MMP-9, las células AGS pretratados con crisina se incubaron con PMA, y se realizaron zimografía de gelatina y análisis RT-PCR. Como se muestra en la figura 1A, PMA-estimulado MMP-9 fue inhibida por crisina de una manera dependiente de la dosis, como se ilustra mediante el ensayo de zimografía de gelatina. Antes de nuestro experimento, si crisina directamente inhibida la actividad de MMP-9 o inhibida la expresión de MMP-9 era aún desconocido. Para responder a esta pregunta, que co-incubaron las secretada-AGS MMP-9 con chrysin durante 3 horas, y la gelatina zymography se realizó para comprobar el nivel final de la actividad de MMP-9. Como muestra la figura 1B, crisina no podía afectar secretada MMP-9 actividades. Por lo tanto, la hipótesis de que la inhibición de la crisina contra MMP-9 puede ser a través de la supresión de la MMP-9 expresión. Para verificar esta hipótesis, inversa PCR de la transcripción y se realizaron ensayos de MMP-9 promotor para comprobar las MMP-9 niveles de transcripción. Como se muestra en la figura 1C, después de ser tratado con la crisina, la inducida por PMA mRNA de MMP-9 se redujo de una manera dependiente de la dosis. Además, MMP-9 actividad de luciferasa promotor fue inhibida por crisina de una manera dependiente de la dosis (Fig 1D). Y transferencia Western también mostró el efecto inhibidor de la crisina en MMP-9 expresión (Fig 1E). Las concentraciones de crisina utilizados en el presente estudio no afectaron la viabilidad celular (Fig 1F). Estos resultados indican que la crisina inhibe la actividad de MMP-9 en células AGS a través de una reducción de la eficacia de la transcripción.
Un total de 2 × 10
6 células pretratadas con las concentraciones indicadas de la crisina por 1 h fueron tratados con 100 nM PMA durante 20 h. Después de la incubación, se recogió el sobrenadante de cultivo de células y los medios de comunicación zimografía de gelatina se realizó para analizar la actividad de MMP-9 (A). Los medios de cultivo de células que contienen células AGS secretadas MMP-9 se incubaron con diferentes concentraciones de crisina en 37 ° C durante 3 h, a continuación, zimografía de gelatina se realizó para analizar los finales de MMP-9 actividades (el primer carril, la carga de un control, contenía el sobrenadante de cultivo celular de soporte sin la incubación con crisina) (B). Las células tratadas previamente con las concentraciones indicadas de crisina durante 1 h se trataron con 100 nM PMA durante 4 h. Después de la incubación, RT-PCR se realizó para analizar la mRNA de MMP-9.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (C). Las células fueron transfectadas transitoriamente con un pGL4-MMP-9 constructo informador promotor. Las células transfectadas se trataron previamente con las concentraciones indicadas de crisina durante 1 h, a continuación se incubaron con 100 nM de 4 h, en la que la actividad de luciferasa punto se determinó usando un luminómetro.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (D). Las células tratadas previamente con las concentraciones indicadas de crisina durante 1 h se trataron con 100 nM PMA durante 8 h. Después de la incubación, perno de Western se realizó para analizar el nivel de proteína MMP-9.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (E). Las células se co-incubaron con 0-80 crisina mu M durante 24 h, y luego sus viabilidades se ensayaron por el método MTT. *
P Hotel & lt; 0,05 frente al control (sin chrysin) (F). Los datos representan la media ± SD de mediciones por triplicado.
Papel de la AP-1 inducida por PMA en la expresión de MMP-9
Según lo informado por la literatura previa, AP-1 es el más importante factor de transcripción en MMP-9 expresión [17]. En este estudio, para confirmar que la AP-1 es requerido por la crítica en este curso, hemos empleado un señuelo AP-1 phosphorothioated oligodesoxinucleótido de cadena doble (ODN) y pGL3-AP-1 plásmido de luciferasa para co-transfectar a las células AGS. Las células co-transfectadas se trataron con PMA, y las actividades de luciferasa se determinaron utilizando un luminómetro. Como se muestra en la figura 2A, las actividades de luciferasa MMP-9 promotor inducido por PMA fueron inhibidos por el señuelo AP-1. En consonancia, la AP-1 señuelo también inhibió PMA inducida por MMP-9 expresión de ARNm (Figura 2B). Se demostró que la anulación de la componente de AP-1 c-Fos y c-Jun también disminuyó inducida por PMA la expresión de MMP-9 (Fig 2C). Además, la curcumina, un inhibidor de AP-1, se empleó también para comprobar la función de AP-1 inducida por PMA en la expresión de MMP-9. Como los datos de RT-PCR ilustra, la curcumina inhibe la expresión inducida por PMA MMP-9 en una forma dependiente de la dosis (Fig 2D). Los datos anteriores indican que la AP-1 es el factor esencial de la MMP-9 expresión. Después de demostrar el papel crucial de la AP-1 en los altos niveles de MMP-9 expresión, la hipótesis de que el mecanismo de inhibición chrysin de MMP-9 expresión era a través de la supresión de la actividad AP-1. Posteriormente, las células AGS transfectadas con plásmidos informadores de luciferasa de AP-1 se trataron previamente con crisina, y luego estimulados por PMA. Como se muestra en la figura 2E, crisina suprime la actividad de AP-1lucifease inducida por PMA de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que la crisina tiene la capacidad de disminuir la actividad de AP-1.
El AP-1 señuelo oligonucleótido fue co transfectadas con un promotor pGL4-MMP-9 en células AGS. Después de la incubación con 100 nM PMA durante 4 h, MMP-9 actividad de luciferasa promotor se examinó utilizando un luminómetro (A), y MMP-9 mRNA fue examinado por RT-PCR (B).#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA. células AGS transfectadas c-jun y c-Fos siRNA se incubaron con 100 nM PMA durante 4 h, y después de la cosecha de células MMP-9 mRNA fue examinado por RT-PCR.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (C). células AGS pretratadas con la concentración indicada de la curcumina para 1 h se incubaron con 100 nM PMA durante 4 h. Después de la incubación, el ARNm de MMP-9 en los lisados celulares se determinó mediante RT-PCR.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (D). Las células transfectadas pGL3-AP-1 fueron pretratados con las concentraciones indicadas de crisina durante 1 h, y luego se incubaron con 100 nM PMA durante 4 h, y se determinó la AP-1 actividad de la luciferasa usando un luminómetro.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (E). células AGS pretratados con las concentraciones indicadas de crisina durante 1 h se incubaron con 100 nM PMA durante 4 h. Después de la incubación, c-Jun y c-fos mRNA en los lisados celulares se determinó por RT-PCR (F). Las células tratadas previamente con las concentraciones indicadas de crisina se incubaron con 100 nM PMA, y los lisados celulares se analizaron para la fosforilados c-Jun (G), fosforilados c-Fos (H), el total de c-Jun y el total de c-Fos por Western blot análisis.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA. Los datos anteriores representan la media ± SD de mediciones por triplicado.
Chrysin inhibe la expresión inducida por PMA MMP-9 mediante la inhibición de factor de transcripción AP-1 a través de la supresión de c-Jun y c-Fos fosforilación
es bien conocido que c-Jun y c-Fos son componentes de la AP-1 vía [18]. Quisimos determinar el mecanismo detrás del efecto inhibidor sobre la crisina AP-1, e investigó si chrysin realidad ejerce su efecto sobre c-Jun y c-Fos. Se midió la cantidad de ARNm total de ambos c-Jun y c-Fos por RT-PCR. Como se muestra en la figura 2F, crisina no inhibió los niveles de expresión de c-Jun y el ARNm c-Fos. A continuación, para probar si la crisina inhibe la activación de c-jun y c-Fos, el Western Blot se llevó a cabo para controlar la fosforilados c-Jun y c-Fos. Fig 2G y 2F muestra que crisina hizo suprimir la inducida por PMA c-Jun y la fosforilación de c-Fos en una forma dependiente de la dosis.
Chrysin inhibe la c-Jun y la fosforilación de c-Fos mediante el bloqueo de JNK y ERK señalización vía
A continuación se investigó cómo chrysin suprimida c-Jun y la fosforilación de c-Fos. Debido a la importancia del papel de MAPK en la activación de AP-1, se investigó el papel de la vía MAPK en MMP-9 expresión. Como se muestra en la figura 3A, entre los inhibidores de MAPK, PD98059 (ERK1 /2 inhibidor), SP600125 (JNK1 /2 inhibidor), y SB203580 (p38 inhibidor de MAPK), sólo el PD98059 y SP600125 fueron capaces de inhibir PMA inducida la expresión de MMP-9 , que indicó que las /2 y JNK1 /2 vías ERK1 pueden ser cruciales para el PMA inducida por la expresión de MMP-9. Además, con el MEK-dominante plásmido negativo PMCL-K97M, plásmido negativo JNK-dominante PMCL-TAM67 y p38 MAPK-dominante plásmido negativo PMCL-MP38, que confirma el papel fundamental de ERK y JNK en MMP-9 expresión en el cáncer gástrico AGS células (Fig 3B). Por otra parte, como se muestra en la figura 3C, ERK1 /2 y JNK1 /2 se requieren críticamente importante para el AP-1 de activación por PMA, demostrado a través de nuestro experimento con MEK y JNK plásmidos negativos dominantes. Seguidamente, se verificaron las funciones de JNK1 /2 y ERK1 /2 en c-Jun y la activación de c-Fos. Como se muestra en la figura 3D, SP600125 y PD98059 suprimidos c-Jun inducida por PMA y la fosforilación de c-Fos, respectivamente, lo que indica que JNK1 /2 es críticamente aguas arriba de c-Jun, mientras que ERK1 /2 es críticamente aguas arriba de c-Fos. Ya que descubrimos que JNK1 /2 y ERK1 /2 jugaron un papel esencial en MMP-9 expresión a través de AP-1, la hipótesis de que la crisina puede trabajar a través de una inhibición de la JNK1 /2 o ERK1 /2 para suprimir la MMP-9 expresión. Para verificar nuestra hipótesis, se realizó el Western Blot para determinar el efecto de la crisina en JNK1 /2 o ERK1 /2 fosforilación. Como la figura 3E y 3F espectáculo, el tratamiento con PMA llevó a un notable aumento de la JNK1 /2 y p42 ERK /44 fosforilación; sin embargo, en presencia de crisina, inducida por PMA JNK1 /2 y ERK1 /2 fosforilación se inhibió de una manera dependiente de la dosis.
Las células pretratadas con una concentración de 50 micras PD98059 (PD), 50 micras SP600125 (SP ) o 20 M SB203580 (SB) por 1 h se incubaron con 100 nM PMA durante 4 h. Después de la incubación, el ARNm de MMP-9 en los lisados celulares se determinó mediante RT-PCR.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (A). Los vectores de expresión que codifican un mutante dominante negativo MEK (K97M), JNK mutante (TAM67), o de MAPK p38 mutante (MP38) fueron co-transfectadas con pGL4-MMP-9 promotor construcciones en células AGS. Después de la incubación con 100 nM PMA durante 4 h, se determinó la actividad luciferasa utilizando un luminómetro. Los datos representan la media ± SD de mediciones por triplicado.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (B). Expresión PMCL vector vacío, que codifica una MEK dominante negativo mutante (K97M) o JNK mutante (TAM67) se co-transfectadas con pGL3-AP-1 luciferasa construir en células AGS. Después de la incubación con 100 nM PMA durante 4 h, se determinó la actividad luciferasa utilizando un luminómetro. Los datos representan la media ± SD de mediciones por triplicado.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (C). células AGS pretrataron con 50 PD98059 mu M, 50 mM SP600125, y 20 mu M SB203580 se incubaron con 100 nM PMA, y los lisados celulares se analizaron para la fosforilados c-Jun y fosforilados c-Fos mediante análisis de transferencia western.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
P Hotel & lt; 0,05 frente a sólo el PMA (D). células AGS pretratados con concentración indicada de crisina se incubaron con 100 nM PMA, y los lisados celulares se analizaron para la fosforilado JNK1 /2 y p42 fosforilada /44 mediante análisis de transferencia western.#
P Hotel & lt; 0,05 frente a control; *
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. & Lt; 0,05 frente a sólo el PMA (E y F) guía empresas
Efecto de la crisina en la invasividad celular
Se ha sabido que los altos niveles de MMP expresión -9 son importantes para el fenotipo invasivo de las células cancerosas. Para examinar el efecto de la crisina en la invasión celular inducida por PMA, se analizó la invasión de células a través de una cámara de invasión de Boyden modificada. células AGS incubadas en PMA dieron como resultado un aumento del número de células invadidas que pasaron por el matrigel artificial. Sin embargo, en presencia de crisina o un anticuerpo MMP-9, el número de células invadidas disminuyó, lo que indica la crisina puede suprimir la invasión de células inducida por PMA mediante la inhibición de MMP-9 expresión (Fig 4A y 4B). Además, la figura 4C mostró crisina disminuyeron invasión AGS inducida por PMA de una manera dependiente de la dosis. A continuación, se investigó el efecto del inhibidor de la señalización en la invasión de células AGS inducida por PMA. Como se muestra en la figura 4D, crisina, la curcumina, PD98059 y SP600125 inhibieron la invasión celular inducida por PMA, lo que indica que la crisina probablemente inhibe PMA inducida por MMP-9 a través de AP-1 supresión, que resulta de bloqueo de las JNK1 /2 y ERK1 /2 vías .
las células fueron incubadas con 50 nM de PMA en la presencia o ausencia de 30 crisina mu M o 200 ng /ml de anticuerpo MMP-9 en un aparato de Matrigel BIOCOAT durante 24 h (a y B). Las células fueron incubadas con 50 nM de PMA en presencia de 0-50 crisina mu M (C). Las células fueron incubadas con 50 nM de PMA en la presencia de 30 crisina mu M, 20 mM curcumina, y, o bien 30 M PD98059 (PD) o SP600125 30 mM (SP) (D). Después de la incubación, las células invadieron la superficie inferior de las cámaras y se contaron usando un microscopio óptico de contraste de fase después de la tinción con un kit de tinción de Diff-Quick. Los datos representan la media ± SD de mediciones por triplicado.#
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. & Lt; 0,05 frente a sólo el PMA
Discusión
compuestos de origen natural con actividad contra el cáncer interfieren con el desarrollo tumoral y la progresión del cáncer mediante la inhibición diversos mecanismos incluyendo la migración celular, invasión y metástasis. Chrysin, un flavonoide natural, que se encuentra ampliamente en muchos extractos de plantas, miel y propóleo, tiene propiedades quimiopreventivos como actividades anti-proliferativos y pro-apoptosis contra diversos tipos de cáncer [19,20]. Sin embargo, las propiedades anti-invasión de chrysin no han sido bien estudiados en células de cáncer gástrico. Es bien sabido que las MMPs son la fuerza detrás de la destrucción de la matriz extracelular, así como los principales inductores de la invasividad de las células. Se investigaron los efectos inhibidores de la crisina sobre la expresión de MMPs en células de cáncer gástrico. Chrysin inhibe MMP-9 expresión (Fig 1) y otras MMP tales como MMP-2 y MMP-7 (datos no presentados). El mecanismo de regulación por parte de la crisina puede ser dependía de cada MMP, y en este estudio nos centramos en la regualtion MMP-9
.
PMA, forbol-12-miristato 13-acetato, un activador de la proteína quinasa, se utiliza comúnmente como herramienta de investigación biomédica en los modelos de carcinogénesis. En este estudio, hemos descubierto PMA aumentó la actividad de MMP-9 a través de la regulación positiva de su nivel de expresión. En presencia de la crisina, la MMP-9 inducida por PMA disminuyó de una manera crisina-dependiente de la dosis (Fig 1A).