Extracto
tasas
de supervivencia para los pacientes con cáncer de páncreas son extremadamente pobres debido a su progresión asintomática hasta la etapa avanzada y metastásica para los que las terapias actuales siguen siendo en gran medida ineficaces. Por lo tanto, se desean nuevos agentes terapéuticos y métodos de tratamiento para mejorar el resultado clínico. En este estudio, determinamos los efectos de honokiol, un componente biológicamente activo de hierba medicinal oriental
Magnolia officinalis /grandiflora
, en dos líneas celulares de cáncer pancreático, MiaPaCa y Panc1, solo y en combinación con el fármaco quimioterapéutico estándar , gemcitabina. Honokiol ejerce efectos inhibidores del crecimiento en ambas líneas celulares de cáncer de páncreas, causando la detención del ciclo celular en G
1 fase y la inducción de apoptosis. A nivel molecular, honokiol disminuyó notablemente la expresión de las ciclinas D1 y (E) y quinasas dependientes de ciclina (CDK2 y Cdk4), y provocó un aumento de Cdk inhibidores, p21 y p27. Además, el tratamiento honokiol llevó a aumento de Bax /Bcl-2 y Bax /Bcl-XL proporciones para favorecer la apoptosis en células de cáncer pancreático. Estos cambios fueron acompañados por un aumento de la acumulación citoplásmica de NF-kappa B con una disminución concomitante en la fracción nuclear y reducción de la actividad transcripcional de NF-kappa B promotor sensible. Esto se asoció con una disminución de la fosforilación de inhibidor de la kappa B alfa (I? B-α) causando su estabilización y por lo tanto el aumento de los niveles celulares. Es importante destacar que, honokiol también potenció los efectos citotóxicos de gemcitabina, en parte, mediante la restricción de la acumulación nuclear gemcitabina inducida por NF-kB en las líneas celulares de cáncer pancreático tratados. En conjunto, estos resultados demuestran, por primera vez, los efectos inhibitorios del crecimiento de la honokiol en el cáncer de páncreas e indican su potencial utilidad como un agente natural novela en la prevención y la terapia
Visto:. Arora S, Bhardwaj A, Srivastava SK, Singh S, McClellan S, Wang B, et al. (2011) Cell Cycle honokiol detenciones, induce la apoptosis, y potencia el efecto citotóxico de la gemcitabina en células de cáncer de páncreas humano. PLoS ONE 6 (6): e21573. doi: 10.1371 /journal.pone.0021573
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de mayo de 2011; Aceptado: June 2, 2011; Publicado: 24 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Arora et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el apoyo de subvención de los Institutos nacionales de /Instituto Nacional del cáncer de la Salud (NIH /NCI) (CA137513) y USAMCI. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una de las enfermedades más letales en Estados Unidos con la tasa de mortalidad aumenta cada año que viene [1], [2]. De acuerdo con la estimación de la Sociedad Americana del Cáncer, 43140 estadounidenses fueron diagnosticados con cáncer de páncreas en 2010 y 36.800 murieron, marcando esta patología como la cuarta causa principal de muerte por cáncer [2]. Debido a su progresión asintomática, el cáncer de páncreas se diagnostica en una etapa en la que ya se ha hecho metástasis o localmente avanzado [3]. Los enfoques terapéuticos contra la enfermedad avanzada en gran parte han fallado y aproximadamente & gt; 80% de los pacientes diagnosticados con esta enfermedad maligna aún mueren dentro de 2-8 meses [4]. Gemcitabina, una norma FDA aprobado por la FDA para el tratamiento del cáncer de páncreas, se informó a ser mínimamente eficaz que mejora la supervivencia del paciente mediante la par de semanas solamente [3], [5]. Por lo tanto, es de suma importancia el desarrollo de regímenes terapéuticos alternativos y estrategias para el manejo efectivo del cáncer de páncreas.
Varias nuevas estrategias, que tienen como objetivo la promoción de vías de crecimiento solo y en combinación con gemcitabina, se han probado en el cáncer de páncreas a mejorar los resultados terapéuticos [6]. Además, varios estudios recientes han identificado elementos de señalización desreguladas, tales como Ras, Akt, NF-kB, miRNAs, etc., que no sólo promover la progresión del cáncer, sino también confiere quimiorresistencia en cáncer de páncreas [7] - [9]. La inducción de estas vías de supervivencia resultados de la activación de mutaciones de genes, la pérdida de las vías y /o potenciación de inhibición a través de mecanismos de señalización autocrina y paracrina [3], [10]. De hecho, ahora se ha demostrado que la orientación de algunos de estos nodos de señalización puede ser útil en la inhibición de crecimiento del tumor y la progresión así como en la restauración de la sensibilidad de las células tumorales a los fármacos citotóxicos [3], [9], [10] .
los productos naturales han estado en el centro de la quimioterapia del cáncer de últimas décadas y, de hecho, más del 60% de los medicamentos contra el cáncer actuales tienen su origen a partir de fuentes naturales [11]. En varios estudios recientes, se han identificado compuestos derivados de plantas novedosos para actuar como agentes anti-tumorales a través de la modulación de las vías biológicas [12]. Honokiol, un compuesto biológicamente activo biphenolic aislado de los
Magnolia officinalis /grandiflora, España ha recibido mucha atención debido a sus propiedades anti-tumorales y anti-angiogénicas potentes [13], [14]. Se ha producido datos prometedores contra la piel, colon, pulmón y de mama [13], [15] - [17]. El aspecto sorprendente de honokiol como un fármaco antineoplásico es su potencial para inhibir el factor nuclear kappa B (NF-kB), que se asocia con la supervivencia de células de cáncer y la quimiorresistencia [9], [10], [18]. El NF-kB se activa constitutivamente en una variedad de tumores malignos hematológicos y sólidos, incluyendo cáncer de páncreas y controla la expresión de un conjunto de genes implicados en la proliferación celular y la supervivencia a través de mecanismos directos e indirectos [18] - [20]. En el presente estudio, hemos examinado, por primera vez, los efectos de honokiol contra el cáncer de páncreas. Nuestros datos muestran que honokiol inhibe el crecimiento de líneas celulares de cáncer pancreático humano, MiaPaCa y Panc1, al causar la detención del ciclo celular y la inducción de la apoptosis. Por otra parte, nuestro estudio proporciona evidencia de un papel de honokiol en quimiosensibilizantes las células del cáncer pancreático a los efectos citotóxicos de gemcitabina.
Resultados
Crecimiento efecto inhibidor de honokiol en las células de cáncer de páncreas humanos
Dos líneas celulares de cáncer de páncreas humano a saber. MiaPaCa y Panc1 fueron empleados como un sistema modelo para investigar el efecto de honokiol sobre el crecimiento celular del cáncer de páncreas. Las células tratadas con honokiol (10-60 M) mostraron alteraciones en la morfología en comparación con vehículo (DMSO) células tratadas. Con el aumento de concentración de honokiol, las células se convirtieron en redondo, encogido y separado del sustrato (Figura 1A), en consonancia con los cambios morfológicos asociados con la apoptosis. Posteriormente, cuantificamos los efectos citotóxicos de honokiol mediante la medición de la viabilidad por ciento usando WST-1 de ensayo. Nuestros datos demuestran que honokiol indujo una disminución de la dosis y dependiente del tiempo en el crecimiento tanto de las líneas celulares de cáncer de páncreas con CI
50 valores de ~43.25, 31.08 y 18.54 m (contra MiaPaCa), y ~47.44, 34.17 y 21.86 M (contra Panc1) después de 24, 48 y 72 tratamientos h, respectivamente (Figura 1B). En conjunto, estos hallazgos indican que honokiol tiene efectos inhibidores del crecimiento en células de cáncer pancreático.
células (A) y MiaPaCa Panc1 se sembraron en placa de 6 pocillos (1 x 10
5 células /pocillo) y se dejaron alcanzar 70-80 tratamiento antes de honokiol (10-60 M)% de confluencia durante 48 h. Después del tratamiento, se observó un cambio significativo en la morfología celular, tanto de los tipos de células como se examina bajo el microscopio de contraste de fase. Las células se convirtieron en redondo, encogido y separado de la superficie celular de una manera dependiente de la dosis. micrografías representativas son de uno de los campos aleatorios de vista (200X aumentos) de las células tratadas con 20, 40 o 60 honokiol M. (B) células MiaPaCa y Panc1 se cultivaron en placas de 96 pocillos de microtitulación (1 × 10
4 células /pocillo) y se trataron con honokiol (10-60 M) a 70-80% de confluencia. viabilidad ciento de las células se midió por ensayo de WST-1 después de 24, 48 y 72 h. Un valor de OD de las células de control (tratados con un volumen igual de DMSO, la concentración final, & lt; 0,1%) se tomó como 100% de viabilidad. Honokiol inhibió la viabilidad celular en una dosis-y tiempo- manera dependiente tanto para los tipos de células que sugieren el efecto anti-tumor de honokiol. Los datos se expresan como media ± desviación estándar; (N = 3).
honokiol provoca G detención del ciclo celular en fase 1
e induce la apoptosis en células de cáncer de páncreas
Supresión del crecimiento de células cancerosas puede ser causada ya sea en virtud de detención de la progresión del ciclo celular o debido a la inducción de la apoptosis o ambos [12]. Nuestros datos sobre la distribución del ciclo celular demostraron que el tratamiento con honokiol dio lugar a un enriquecimiento de las células de cáncer de páncreas en G
1 fase con una disminución concomitante en el número de células en fase S (fracción proliferativa) (Figura 2). Se ha observado una disminución ~1.28, 2,16 y 2,46 (pliegues en MiaPaCa) y ~1.08, 1,53 y 1,93 (pliegues en Panc1) en el número de células en la fase S a los 20, 40 y 60 mM dosis de honokiol, respectivamente (Figura 2 ). En los ensayos de apoptosis, nuestros datos demostraron un aumento considerable en el índice de apoptosis (células negativas positivo /7AAD PE Anexina V) de una manera dependiente de la dosis después de 24 h de tratamiento honokiol (Figura 3). A las 20, 40 y 60 micras concentraciones de honokiol, observamos ~1.25, 2,04 y 3,96 pliegues aumentan en los índices apoptóticos de MiaPaCa y ~1.34, 1.98 y 3.32 pliegues aumentar en los índices de apoptosis de células Panc1, respectivamente. En conjunto, nuestros resultados demuestran que honokiol tiene propiedades tanto citostáticos y citotóxicos contra las células de cáncer de páncreas.
MiaPaCa y Panc1cells (1 × 10
6 células /pocillo) se sincronizan mediante el cultivo en un medio libre de suero durante 72 h , seguido de incubación en medio que contenía suero durante 24 h y posterior tratamiento con ya sea honokiol (20, 40 o 60 mM) o DMSO (control) durante 24 h. Distribución de células en diferentes fases del ciclo celular se analizó mediante yoduro de propidio (PI) tinción seguido por citometría de flujo. Se observó una mayor acumulación de células MiaPaCa y Panc1 en el G
1 fase del ciclo celular después del tratamiento con honokiol de una manera dependiente de la dosis (como se indica por los histogramas de flujo), con una disminución concomitante de células en fase S.
células MiaPaCa y Panc1 se cultivaron en placas de 6 pocillos (1 x 10
6 células /pocillo) y se dejó que alcanzara el 70-80% de confluencia. Las células se trataron con honokiol (20, 40 o 60 mM) o DMSO (control) durante 24 h y posteriormente se tiñeron con 7-AAD y PE Anexina V seguido por citometría de flujo. Los cuadrantes inferior izquierda de cada paneles muestran las células viables (negativos para ambos, PE Anexina V y 7-AAD). Los cuadrantes superiores derechos contienen células apoptóticas o necróticas finales (positivos para ambos, PE Anexina V y 7-AAD). Los cuadrantes inferiores derecha representan las células apoptóticas tempranas (PE anexina V positivas y negativas 7-AAD). Los datos muestran un aumento dependiente de la dosis en el número de células apoptóticas en células tanto MiaPaCa y Panc1 después del tratamiento con honokiol en comparación con las células de control, lo que indica apoptotis potencial de inducir honokiol.
Honokiol altera la expresión de ciclo celular y las proteínas de supervivencia asociada a
Para investigar la base mecanicista de efectos inhibidores del crecimiento de honokiol, el próximo examinado su efecto sobre la expresión de las proteínas clave implicadas en la proliferación celular y la supervivencia. Nuestros datos revelaron una disminución dependiente de la dosis en la expresión de las ciclinas D1 y (E) y quinasas dependientes de ciclina (CDK2 y Cdk4); mientras que se observó una expresión inducida de los inhibidores de quinasa dependientes de ciclina (p21 y p27) después del tratamiento honokiol tanto en células de cáncer pancreático Panc1 (Figura 4) y MiaPaCa. Entre las proteínas de supervivencia, se observó una reducción dependiente de la dosis en los niveles de la proteína anti-apoptótica de Bcl-2 y Bcl-xL, mientras que un aumento concomitante en el nivel de proteína pro-apoptótica se observó Bax (Figura 5A) que conduce a un aumento en la relación de Bax /Bcl-2 (Figura 5B, panel superior) y Bax /Bcl-xL (Figura 5B, panel inferior). Estos hallazgos demuestran que honokiol altera la expresión de las proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular y la apoptosis de conferir su efecto inhibidor del crecimiento.
cáncer de páncreas células (MiaPaCa y Panc1) se trataron con honokiol (20, 40 o 60 M) o DMSO (control) durante 24 h. La proteína total se aisló y se sometió a análisis de inmunotransferencia de las proteínas del ciclo asociada a diversas células (ciclina D1, ciclina E, CDK2, Cdk4, p21 y p27). β-actina se utilizó como control de carga. Intensidades de las bandas inmunorreactivas se cuantificaron por densitometría. densitométricas normalizaron los valores se indican en la parte superior de las bandas que muestran una disminución dependiente de la dosis en la expresión de ciclina D1, ciclina E, Cdk2 y Cdk4 y aumento en la expresión de los inhibidores de ciclina; p21 y p27, después de la exposición a honokiol, tanto en los tipos de células.
células (A) y MiaPaCa Panc1 se trataron con honokiol (20, 40 o 60 mM) o DMSO (control) para 24 h. La inmunotransferencia se realizó para Bcl-XL, Bcl-2 y las proteínas Bax seguido por densitometría de bandas inmunorreactivas. densitométricas normalizaron los valores se indican en la parte superior de las bandas. (B) Diagrama de barras que resume los efectos del tratamiento honokiol en relación Bax /Bcl-2 (panel superior) y la relación de Bax /Bcl-XL (panel inferior). Los datos sugieren que honokiol induce la apoptosis mediante la regulación positiva de pro-apoptótica Bax y la regulación negativa de las proteínas Bcl-2 y Bcl-XL anti-apoptóticos.
honokiol atenúa la activación constitutiva de NF-kB en las células de cáncer de páncreas humanos
NF-kappa B es constitutivamente activo en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de páncreas [18] - [20] y se ha demostrado que la activación de este nodo de señalización facilita la progresión del ciclo celular [21] y la resistencia a la apoptosis [22 ]. Por lo tanto, se investigó si el tratamiento de las células del cáncer pancreático con honokiol tiene un impacto en la activación de NF-kB en las células de cáncer de páncreas. Examinamos primero el efecto de honokiol en la actividad transcripcional de NF-κB- promotor sensible en un ensayo de indicador de luciferasa. Nuestros datos indican una reducción dependiente de la dosis en la actividad transcripcional de NF-kB (células ~1.40, 2.08 y 4.0 pliegues en MiaPaCa, y ~1.29, 1,96 y 5,26 pliegues en Panc1) a los 20, 40 y 60 micras de tratamiento honokiol, respectivamente (Figura 6A). Para apoyar aún más esta observación, el próximo estudió la localización celular (citoplasmática vs. nuclear) de la subunidad p65 de NF-kB. Nuestros datos demostraron que el tratamiento de inmunotransferencia honokiol causó una disminución marcada y dependiente de la dosis en los niveles de NF-KB en la fracción nuclear tanto de las células de cáncer de páncreas y MiaPaCa Panc1 con un aumento simultáneo de la fracción citoplásmica (Figura 6B). distribución celular de NF-KB es controlada por la expresión relativa de su I? B inhibidor de la biológica, que mantiene NF-kB secuestrado en el citoplasma en un complejo inactivo [23]. Por lo tanto, se analizaron los extractos citoplasmáticos de las células de cáncer de páncreas honokiol tratados para la determinación del nivel de I? B-α. Nuestros datos demuestran un aumento dependiente de la dosis en el nivel de la I? B-α en honokiol-tratamiento (Figura 6B). Esto se asoció con una disminución concomitante en la fosforilación de I? B-α indica el aumento de la estabilización de I? B-α después de la exposición a honokiol. En conjunto, nuestros datos indican que honokiol suprime la activación constitutiva de NF-kB en las células de cáncer de páncreas.
(A) y MiaPaCa Panc1cells (0,5 × 10
6 células /pocillo) se sembraron en placas de 12 pocillos . Al día siguiente, en 60% de confluencia, las células fueron co-transfectadas con el reportero de luciferasa NF-kappa B y luciferasa TK-Renilla (control) plásmidos. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se trataron con honokiol (20, 40, o 60 mM) para el próximo 24 h. Proteína lisados se hicieron y la luciferasa (luciérnaga; prueba y Renilla, el control de la eficacia de transfección) la actividad evaluó a través de un sistema de ensayo de doble-luciferasa. Los datos se presentan como normalizado factor de cambio en la actividad de luciferasa (media ± SD, n = 3, * p & lt; 0,05). (B) total, los extractos nucleares y citoplasmáticas se prepararon a partir de células tratadas con honokiol (20, 40, o 60 mM) durante 6 h y la expresión de NF-kB /p65, p-I? B-α (S32 /36) y IκB- α se determinó mediante análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como control de carga. Intensidades de las bandas inmunorreactivas se cuantificaron por densitometría. valores de densitometría normalizados se indican en la parte superior de las bandas que indica una localización disminuida de NF-kB /p65 en el núcleo con un aumento concomitante en el citoplasma. En contraste, la expresión de p-I? B-α se redujo dando lugar a mayores niveles de I? B-α. En conjunto, estos datos sugieren claramente que honokiol inhibe la actividad de NF-kB mediante la estabilización de I? B-α.
honokiol chemosensitizes las células del cáncer pancreático para la toxicidad de gemcitabina
La gemcitabina es el único FDA aprobado fármaco quimioterapéutico contra el cáncer de páncreas; Sin embargo, sigue siendo muy poco eficaces debido a la quimio-resistencia [3], [5], [10]. Puesto que la activación de NF-kappa B se considera como uno de los mecanismos de potenciación quimiorresistencia, examinamos si honokiol actuaría como un quimiosensibilizador en células de cáncer pancreático. células de cáncer pancreático (MiaPaCa y Panc1) fueron tratados con gemcitabina sola o en combinación con al sub-IC
50 concentraciones de honokiol y el efecto sobre la inhibición del crecimiento se examinó usando un ensayo de viabilidad celular. Nuestros datos demuestran que la gemcitabina inhibe el crecimiento de células de cáncer de páncreas en una forma dependiente de la dosis y el tratamiento combinado con honokiol condujo a una reducción significativa en el IC
50 de gemcitabina (Figura 7A). A los 10 y 20 mM dosis de honokiol, respectivamente, una ~1.53 y 2,41 veces (en MiaPaCa) y ~1.40 y 2,08 veces (en Panc1) disminución de IC se observó
50 de gemcitabina significando el efecto quimiosensibilizador de honokiol (Figura 7A). Para identificar un papel de NF-kappa B, examinamos su localización celular en gemcitabina (solo o en combinación con honokiol) tratados con células de cáncer pancreático. Nuestros datos muestran una acumulación mejorada de NF-kappa B en el compartimiento nuclear y una disminución concomitante en la fracción citoplásmica con dosis crecientes de gemcitabina tanto en las células Panc1 (Figura 7B) y MiaPaCa. En particular, se observó que honokiol (incluso a dosis 20 M) fue eficaz en la inhibición de la activación gemcitabina inducida por NF-kB en las células MiaPaCa y Panc1 (Figura 7C). Estos resultados sugieren claramente que honokiol potencia la eficacia antitumoral de la gemcitabina, actuando como un quimio-sensibilizador en células de cáncer pancreático
.
células (A) y MiaPaCa Panc1 se cultivaron en placas de 96 pocillos de microtitulación (1 × 10
4 células /pocillo). En sub-confluencia, las células se trataron con gemcitabina (1,25 a 40 M) solo o en combinación con honokiol (10 o 20 mM) durante 48 h. viabilidad porcentual se mide por WST-1 de ensayo. Los datos se presentan como porcentaje de viabilidad relativa con respecto a las células tratadas solamente-no tratados o honokiol Para el control de los efectos supresores del crecimiento de honokiol (media ± SD, n = 3. *, p & lt; 0,05). Una disminución significativa en IC
50 valores de gemcitabina se observó en las células tratadas con co-honokiol. (B) Las células se trataron con gemcitabina (5, 10 y 20 mM) durante 6 h y la expresión de NF-kB /p65 en nuclear, lisados celulares citoplasmáticos y total se determinó por análisis de transferencia Western. tratamiento de gemcitabina de células resultó en la acumulación nuclear mejorada de NF-kB /p65 de una manera dependiente de la dosis (C) Nuclear y extractos citoplasmáticos se prepararon a partir de células tratadas con gemcitabina (10 mM), honokiol (20 M) sola o en combinación para 6 marido. La expresión de NF-kB /p65 en lisados de células nucleares, citoplasmáticos y total se determinó por análisis de transferencia Western. Los datos muestran que el tratamiento conjunto honokiol restringido NF-kB /p65 acumulación nuclear inducida por gemcitabina. En conjunto, estos hallazgos sugieren que honokiol actúa como un quimiosensibilizador y aumenta los efectos citotóxicos de la gemcitabina en el cáncer de páncreas.
Discusión
El cáncer de páncreas sigue siendo una enfermedad maligna devastadora debido a la falta de un tratamiento eficaz para el tratamiento [3]. El presente estudio demostró que honokiol (un compuesto biphenolic natural) es eficaz en la supresión del crecimiento de células de cáncer de páncreas humanos (MiaPaCa y Panc1) debido a sus propiedades citostáticos y citotóxicos. Por otra parte, nuestros estudios proporcionan evidencia de un papel de honokiol en quimiosensibilizantes las células del cáncer pancreático a la toxicidad de gemcitabina. Honokiol inhibió la actividad de NF-kB y causó alteraciones en la expresión de muchas proteínas del ciclo celular y la supervivencia asociada a conferir su supresor del crecimiento y los efectos quimiosensibilizantes en células de cáncer de páncreas.
crecimiento desregulado en las células cancerosas a menudo se atribuye a la pérdida de control en las vías de proliferación y apoptosis [24]. De hecho, los estudios moleculares han revelado que la expresión de reguladores del ciclo celular y proteínas asociadas con la supervivencia celular está frecuentemente alterado en múltiples cánceres humanos [25] - [27]. ciclo celular está regulado por la acción concertada de las ciclinas, quinasas dependientes de ciclinas (CDK) e inhibidores de Cdks [26], [28]. Hemos observado que el tratamiento de células de cáncer pancreático con honokiol resultó en G
arresto 1-fase de la progresión del ciclo celular, junto con la reducción en la ciclina D1, ciclina E, Cdk2 y Cdk4 y aumento de la p21 y p27 a nivel de proteínas. Ciclina D1 y su socio catalítica Cdk4 dominan en G
1 fase, mientras que, la ciclina E y complejo Cdk2 regula la progresión del ciclo celular de G
1 a S [26], [28]. Por lo tanto, nuestros resultados indican que la detención honokiol inducida de las células de cáncer de páncreas en G
fase del ciclo 1 de células podría ser mediada a través de la regulación a la baja de las ciclinas y Cdk junto con la regulación al alza de las proteínas p21 y p27, que forman complejos heterotrimeric con G
1-S Cdk y ciclinas para inhibir su actividad [29]. Estos resultados están de acuerdo con estudios anteriores sobre el efecto de la leucemia linfoide honokiol en humanos, escamosas de cáncer de pulmón y cáncer de mama células [16], [17], [30].
Tras G
1- fase de detención del ciclo celular, las células pueden ser sometidos a reparación o entrar en la vía apoptótica para mantener la integridad celular y la eliminación de las células pre-malignas y neoplásicas mutadas errado /[31]. Por lo tanto, la inducción de la apoptosis es uno de los mecanismos de protección contra el cáncer de iniciación y las células de progresión y el cáncer a menudo han adquirido resistencia a la apoptosis [24]. En el presente estudio, se observó una inducción significativa de la apoptosis en células de cáncer de páncreas tratados con honokiol lo que indica que honokiol es capaz de potenciar la maquinaria apoptótica. La supervivencia celular se mantiene por un equilibrio de las proporciones de pro-apoptóticos (por ejemplo, Bad y Bax) y las proteínas anti-apoptóticas (por ejemplo, Bcl-2 y Bcl-XL), que controlan el proceso de la apoptosis mediante la liberación de las caspasas [ ,,,0],32], [33]. Por lo tanto, la expresión de las proteínas Bcl-2 de la familia observadas tras el tratamiento honokiol de las células de cáncer de páncreas de una manera que favorece el aumento de las proporciones de Bax /Bcl-2 y Bax /Bcl-xL podría subyacer el efecto apoptótico observado de honokiol alterado. La desregulación de las proteínas relacionadas con la apoptosis también se ha reportado en células de condrosarcoma después del tratamiento honokiol apoyar aún más su papel en la inducción de la apoptosis [34].
También se observó la inhibición de la actividad de NF-kB en el tratamiento honokiol, que se asoció con inhibición de la fosforilación de I? B-α y aumento concomitante de su expresión. Factor de transcripción NF-kB se activa constitutivamente en múltiples neoplasias y se ha informado de que se implicada patológicamente en el cáncer de páncreas [18] - [20]. Estudios recientes han demostrado que el efecto de crecimiento supresores de honokiol en los cánceres de próstata y de colon es mediada a través de la inhibición de NF-kappa B [35]. El factor de transcripción NF-kB se compone de heterodímeros que consisten en Rel (p65, c-Rel, y RelB), p52, y las proteínas p50 y se localiza en el citoplasma en su forma inactiva en el complejo con I? B (inhibidor de NFkB que consiste en α y β subunidades que enmascara su señal de localización nuclear [36]. la activación de NF-kappa B es causado, cuando I? B-α se fosforila por la IKK (inhibidor de quinasa) complejo que conduce a su ubiquitinación y degradación. Esto resulta en la liberación de NFkB de la citoplasma y el transporte en el núcleo, seguido por la activación del promotor de NF-kappa B-sensible. NF-kB se sabe que inducen la expresión de ciclina D1, Bcl-2 y Bcl-xL (alterado por tratamiento honokiol en el estudio actual) junto con una serie de las proteínas implicadas en la proliferación celular y la supervivencia [37], [38]. por lo tanto, se puede sugerir que la supresión del crecimiento de células de cáncer pancreático por honokiol está mediada por la inhibición de NF-kB
.
el resultado clínico en cáncer de páncreas se ha mantenido pobre debido a estado avanzado y metastásico de la enfermedad en el momento del diagnóstico y la ineficacia de fármaco-terapia permisible debido a la quimiorresistencia [3], [5], [10]. En la actualidad, la gemcitabina es el fármaco quimioterapéutico estándar nacional para el tratamiento del cáncer de páncreas. Gemcitabina interfiere con la síntesis de ADN que conduce a la detención del ciclo celular y la apoptosis en el curso final [39], [40]. Uno de los mecanismos que limitan la eficacia de gemcitabina se induce la activación de NF-KB en respuesta a su tratamiento [41], lo que puede causar un retraso apoptótica o supresión. En este estudio, hemos demostrado el efecto quimiosensibilizador de honokiol en células de cáncer pancreático a la toxicidad de gemcitabina. Además, hemos demostrado que el tratamiento con gemcitabina induce la acumulación nuclear de NF-kappa B, que podría ser inhibida eficazmente por co-tratamiento con honokiol. Estos hallazgos paralelas indican que la inhibición de la actividad de NF-kappa B también puede mediar en la quimiosensibilización de las células de cáncer de páncreas por honokiol. De hecho, se ha informado anteriormente que los efectos anticancerígenos de agentes quimioterapéuticos puede ser potenciada por la inhibición de la actividad de NF-kB [22], [41].
En conclusión, hemos demostrado, por primera vez , el inhibidor del crecimiento y el potencial de quimiosensibilizante honokiol en el cáncer de páncreas. Honokiol provoca G
detención del ciclo celular 1 fase y la inducción de apoptosis mediante la alteración de la expresión de proteínas del ciclo celular y supervivencia asociada. La inhibición de NF-kappa B puede ser uno de los mecanismos importantes en supresora de crecimiento honokiol inducida y los efectos quimiosensibilizadores en las células de cáncer de páncreas. Por tanto, creemos que honokiol podría ser un prometedor agente natural novedoso para el tratamiento de cáncer de páncreas y también puede servir como un quimiosensibilizador para mejorar la eficacia terapéutica de gemcitabina, que ya está en uso clínico como un fármaco terapéutico.
materiales y Métodos
Reactivos
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y Roswell park Memorial Institute (RPMI-1640) se obtuvieron de medio Thermo Scientific (Logan, UT). de suero fetal bovino (FBS) era de Atlanta Biológicos (Lawrenceville, GA). Penicilina, estreptomicina y tripsina-EDTA se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Honokiol se adquirió de LKT Laboratories (St. Paul, MN). Gemcitabina fue proporcionado por la farmacia USAMCI. FuGENE reactivo de transfección, fosfatasa /inhibidores de la proteasa cóctel y la proliferación de células de reactivo WST-1 se adquirieron de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania). El yoduro de propidio /tampón de tinción de ARNasa y kit de detección de apoptosis PE Anexina V se compraron de BD Bioscience (San Diego, CA). kit de extracto nuclear se adquirió de Active Motif, LLC (Carlsbad, CA). Los anticuerpos contra Bcl-2, Bax y p-I? B-α (Ser32 /36) (policlonal de conejo), Bcl-XL y NF-kB /p65 (monoclonal de conejo), y I? B-α (monoclonal de ratón) se obtuvieron de Cell Signaling tecnología (Beverly, MA). Los anticuerpos contra p21, Cdk4 (monoclonal de ratón), p27, ciclina D1, ciclina E, Cdk2 (policlonal de conejo), y el rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa se adquirieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA). ß-actina (monoclonal de ratón) de anticuerpos se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL plus kit de detección de Western Blot se obtienen de Thermo Scientific. pGL4.32 plásmido [luc2P /NF-kB -RE /Hygro], el plásmido PRL-TK y el kit de doble sistema de ensayo de luciferasa fueron de Promega (Madison, WI).
Cultivo de células y tratamientos
Las líneas de células de páncreas humanos MiaPaCa y Panc1 (ATCC, Manassas, VA) se mantuvieron en cultivo como monocapa adherente en RPMI-1640 y DMEM respectivamente, suplementado con 10% (v /v) de FBS, penicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Las células se mantuvieron en 5% de CO
2 humidificado incubadora a 37 ° C. medio de cultivo se cambió cada 3 días y se dividieron las células (01:03) cuando alcanzaron 80% de confluencia. Para los tratamientos, solución madre de honokiol (10 mmol /L) se preparó en DMSO, se almacenaron a -20 ° C, y se diluyó con medio completo fresco inmediatamente antes de su uso. Las células se trataron con varias concentraciones de honokiol solamente, gemcitabina solos o en combinación (como se especifica en las leyendas de las figuras). Se agrega al control
Crecimiento de las células de ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (1 x 10
4; un volumen igual de DMSO (0,1% de concentración final, & lt). células /pocillo) un día antes de los tratamientos. La viabilidad celular en las células tratadas se examinó después de 24 a 72 h mediante el uso de WST-1 (4- [3- (4-yodofenil) -2- (4-nitrofenil) 2H-5-tetrazolio] -1, 3-benceno di-sulfonato) kit de ensayo según las instrucciones del fabricante con controles apropiados. Este ensayo se basa en la escisión de WST-1 en las células metabólicamente activas para formar formazán soluble en agua. La absorbancia de la formazan se midió a una longitud de onda de 450 nm, con la sustracción del fondo a 630, usando un lector de microplacas Benchmark Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). El crecimiento se calculó como porcentaje de viabilidad = [(A /B) x 100], donde A y B son la absorbancia de las células tratadas y de control, respectivamente.
Cell-ciclo de análisis
El efecto de tratamiento honokiol en la progresión del ciclo celular se determinó por citometría de flujo después de la tinción con yoduro de propidio (PI). En resumen, las células (1 × 10
6 células /pocillo) se sembraron en placa de 6 bien y sincronizado mediante el cultivo en medio libre de suero. Después de 48 h, el medio se reemplazó con medio completo que contenía concentraciones deseadas de honokiol o DMSO. Se recogieron las células flotantes y unidas después de 24 h de tratamiento y se fijaron en etanol al 70% durante la noche a 4 ° C. Las células fueron teñidas con yoduro de propidio, utilizando tampón de tinción PI /RNasa durante 1 hora a 37 ° C. Las células teñidas se analizaron por citometría de flujo en un BD-FACS Canto ™ II (Becton-Dickinson, San Jose, CA) para calcular el porcentaje de población de células en varias fases del ciclo celular utilizando software Mod Fit LT (Verity Software House, Topsham