Extracto
presencia citoplasmática de Hsp60, que es principalmente una chaperonina mitocondrial codificada por el gen nuclear, ha sido con frecuencia declaró, pero su papel en la señalización intracelular es en gran parte desconocida. En este estudio, hemos demostrado que la Hsp60 citosólico promueve la activación de TNF-α mediada por la vía de supervivencia IKK /NF-kB a través de la interacción directa con IKK /β en el citoplasma. pérdida selectiva o el bloqueo de citosólica Hsp60 por oligonucleótido antisentido específico o anticuerpo neutralizante disminuyen la activación de IKK /NF-kappa B y la expresión de NF-kB genes diana, tales como Bfl-1 /A1 y MnSOD, que por lo tanto aumenta la producción de ROS intracelular y ASK1 la muerte celular dependiente de, en respuesta a TNF-α. Por el contrario, la expresión ectópica de Hsp60-dirigida de citosol mejorado la activación de IKK /NF-kB. Mecánicamente, la citosólica Hsp60 mejorada activación IKK a través de la regulación positiva de la fosforilación de la serina de activación dependiente de una manera chaperona-independiente. Por otra parte, el estudio de ratones transgénicos mostró que la Hsp60 citosólico suprimió la muerte celular hepática inducida por diethylnitrosamine
in vivo
. La Hsp60 citosólico es probable que sea un componente regulador de IKK complejo y que implica el primer factor mitocondrial que regula la supervivencia celular a través de la vía NF-kB
Visto:. Chun JN, Choi B, Lee KW, Lee DJ, Kang DH, Lee JY, et al. (2010) Hsp60 citosólico está involucrado en la Supervivencia NF-KB dependiente de las células del cáncer a través del Reglamento IKK. PLoS ONE 5 (3): e9422. doi: 10.1371 /journal.pone.0009422
Editor: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil |
Recibido: December 2, 2009; Aceptado 18 de enero de 2010; Publicado: 23 Marzo 2010
Derechos de Autor © 2010 Chun et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio contó con el apoyo del Proyecto 21C Frontier funcional Proteómica (FPR08-B1-190), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia & amp; Tecnología y por KOSEF través del Centro de Señalización Celular & amp; Investigación para el descubrimiento de drogas (CCS & amp; DDR, R15-2006-020) en la Universidad de Mujeres Ewha. Este estudio también fue apoyado en parte por una subvención del Plan Nacional de I & amp; D Programa de Control del Cáncer, Ministerio de Salud & amp; Bienestar (0.420.190). J. N. Chun, K. W. Lee, J. Y. Lee, B. A. Choi, I. y H. Kim fueron apoyados por Cerebro Corea 21 subvención del Ministerio de Educación, Ciencia & amp Corea; Tecnología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células de mamífero expresan un número de genes de supervivencia que desempeñan los papeles en la inhibición de la activación de caspasas, la eliminación de los radicales de oxígeno dañinos, la defensa de la función mitocondrial, y la comprobación del ciclo celular. Entre los factores de transcripción responsables de la inducción de los genes de supervivencia, factor nuclear-kB (NF-kB) es un elemento clave que orquesta el complejo de respuesta de supervivencia de células [1]. En particular, los genes de supervivencia NF-kappa B-dependientes incluyen genes anti-apoptóticos, tales como c-IAP y c-FLIP, y genes de salvaguardia mitocondriales, tales como manganeso-superóxido dismutasa (MnSOD) y 2 Bcl-miembros de la familia [2] , [3], [4]. A quinasa central en vía de activación NF-KB es el inhibidor de kappa B quinasa (I? B quinasa o IKK) que fosforila la proteína I? B en dos residuos de serina amino-terminal, lo que lleva a su ubiquitinylation y proteosomal degradación y a la consiguiente liberación de NF-kB proteínas [5]. Los estímulos extracelulares para activar NF-kappa B convergen para IKK [6]. Por lo tanto, se han hecho numerosos esfuerzos para delinear la regulación de la activación de IKK. En primer lugar, la regulación dependiente de la fosforilación de la activación de IKK se ha caracterizado [7]. La fosforilación de dos residuos de serina (Ser 177 /Ser181 en IKKβ humana) en la activación de T-bucle es esencial para la activación, mientras que la autofosforilación del clúster serina carboxilo-terminal se apaga la activación. Muchas quinasas se han implicado estar involucrado en la fosforilación de activación: NF-kappa B que induce quinasa (NIK) [8], [9], activada por mitógenos proteína quinasa /ERK quinasa quinasa 1 (MEKK1) [10], MEKK2 /3 [11], [12], progenitoras hematopoyéticas quinasa-1 (HPK1) [13], de linaje mixto quinasa 3 (MLK3) [14], el TGF-β quinasa activada 1 (TAK1) [15]. Sin embargo, excepto TAK1, no está claro cómo la quinasa aguas arriba activa el complejo IKK. En segundo lugar, la regulación dependiente de ubiquitina de la activación de IKK se ha estudiado durante muchos años [15], [16]. Recientemente, la subunidad reguladora IKKγ (o NEMO) de complejo de IKK se ha demostrado para ser ubiquitinada, así como para reconocer la cadena polyubiquination vinculado-Lys63 en la proteína receptor de interacción 1 (RIP1) [17], [18]. En tercer lugar, la regulación de la activación de IKK a través de la interacción de proteínas se ha caracterizado. Los mejores ejemplos son las proteínas de choque térmico. Por ejemplo, se ha informado de Cdc37 y Hsp90 para actuar como componentes adicionales del complejo IKK que estabilizan el complejo [19], [20]. Hsp27 se ha demostrado que interactúan con IKKβ de una manera TNF-α-dependiente [21]. Hsp70 también interactúa con IKKγ pero interfiere con la activación de IKK [22]. Además, la asociación entre la proteína fosfatasa 2Cβ (PP2Cβ) y el complejo IKK se ha demostrado [23], y ELKS también ha sido identificado como una nueva subunidad reguladora de complejo IKK que media el reclutamiento de I? B para el complejo [24]. Sin embargo, no hay indicios de una proteína mitocondrial implicada en la activación de IKK /NF-kB.
Recientemente hemos identificado la proteína de choque térmico 60 (Hsp60) como una proteína IKK-interactuando. Hsp60 es la chaperonina mitocondrial que promueve el plegamiento de la proteína importada para conformación nativa. No obstante, la existencia y la función de Hsp60 en compartimentos extramitocondriales con frecuencia se ha señalado [25]. Por ejemplo, Hsp60 puede ser un ligando para los receptores de la superficie celular como Toll-like receptor [26]. Intracelularmente, Hsp60 se ha demostrado que la interacción con la procaspasa-3 o Bax [27], [28], [29]. Sin embargo, no se ha informado de la función de Hsp60 en relación con la señalización de la supervivencia celular. En este estudio, Hsp60 se encontró para mediar la supervivencia NF-KB dependiente de la señalización en las células. Específicamente, Hsp60 interactuaba directamente con IKK /β en el citoplasma y luego promueve la activación dependiente de la fosforilación de la quinasa en respuesta a TNF-α. Tal función de señalización de Hsp60 era independiente de su actividad chaperona, que establece Hsp60 aparte de otras proteínas de choque térmico que funcionan a través de la estabilización o desestabilización de complejo de señalización [30]. También puso de manifiesto
in vivo
evidencia de que la expresión de Hsp60 citosólico protege a las células hepáticas contra el daño inducido por productos químicos a través de la mejora de la activación de IKK. Por lo tanto, este hallazgo representa la nueva función pro-supervivencia de Hsp60 citosólico y arrojar una luz en la comprensión de la función de Hsp60 en compartimentos extra-mitocondrial [25].
Resultados
Hsp60 interactúa con IKK complejo en el citoplasma
Para identificar un componente adicional, se analizó la composición molecular del complejo IKK latente usando una técnica que combina proteómico de purificación por inmunoafinidad y espectrometría de masas. Brevemente, el complejo de IKK se precipitó a partir de los lisados de células HeLa S3 estimuladas utilizando perlas de anticuerpo anti-IKK, y las proteínas co-precipitados se secuenció por cromatografía en tándem líquido espectrometría de masas. La identificación de las subunidades de IKK y Hsp90 indicó que la inmunopurificación de IKK complejo bastante trabajó (Fig. 1A). Como consecuencia, este estudio proteómico identificó una proteína de choque térmico, Hsp60, en los precipitados (Fig. 1A y 1B). La presencia de las subunidades de IKK y Hsp60 en los precipitados se confirmó por inmunotransferencia (Fig. 1C). Entonces, decidimos investigar el significado biológico de la interacción IKK-Hsp60.
A. Un gel de poliacrilamida teñido con plata la solución del complejo IKK purificado por afinidad. B. espectros MS /MS de [M + 2H]
2 + iones de los péptidos derivados de la banda de proteína correspondiente a Hsp60. C. inmunotransferencia (IB) el análisis de las subunidades de IKK y Hsp60 en el complejo purificado por afinidad. D. Interacción de Hsp60 con el complejo IKK. complejo IKK se inmunoprecipitó (IP) a partir de lisados celulares (HeLa proteínas totales 500 g de cada uno) con IKK, IKKβ, y los anticuerpos IKKγ-específicos. Las subunidades de IKK /β /gamma, Hsp60, Hsp90 y se inmunotransfirieron. CMT, toda lisado celular. E. TNF-α-independiente interacción de Hsp60 y IKK complejo. F. Co-inmunoprecipitación de Hsp60 y IKK complejo en la fracción citosólica.
Panel superior
, sobrenadante post-nuclear (PNS), se immunoblotted citosol (cito), y las mitocondrias (Mito) fracciones de células HeLa. COX4 y tubulina se utilizaron como marcadores mitocondriales y citosólicas, respectivamente.
Panel inferior
, Hsp60 se inmunoprecipitó a partir de la fracción citosólica usando ya sea el control de IgG de cabra o de anticuerpos anti-Hsp60 (K-19 y N-20). borrones representativos se muestran (
n
= 3).
El primer paso fue verificar la interacción endógena de Hsp60 y IKK por experimentos de co-inmunoprecipitación. Cuando los complejos de IKK heterogéneos fueron precipitados con anticuerpos contra IKK, IKKβ, y IKKγ, cada uno de los anticuerpos de la subunidad específica de IKK parecida precipitados Hsp60 (Fig. 1D). Además, Hsp90 fue también co-precipita con IKK complejo [20], [21]. Se encontró que esta interacción a ser afectados por el tratamiento TNF-α (Fig. 1E), lo que indica que Hsp60 es una proteína componente de los complejos de IKK heterogéneos. Una inmunoprecipitación inversa se llevó a cabo a continuación con la fracción citosólica para excluir la contaminación mitocondrial. Los anticuerpos anti-Hsp60 co-precipitaron IKKγ con Hsp60, mientras que el control de IgG de cabra no (Fig. 1F), lo que confirma que la interacción citosólica de Hsp60 y IKK. Con el fin de visualizar la interacción virtual de Hsp60 con IKK en el citoplasma, se realizó la tinción inmuno combinado con la microscopía electrónica (EM). Los complejos inmunes de Hsp60 y IKK con sus anticuerpos específicos se detectaron de manera diferente usando anticuerpos secundarios marcados con 20 NM- y 40 partículas de oro nm de diámetro, respectivamente. Como resultado, las partículas de oro Hsp60 de etiquetado se distribuyeron a lo largo de las estructuras celulares: no sólo en la matriz y en el espacio intermembrana de las mitocondrias, sino también en el citoplasma y la membrana plasmática (Fig 2B.). En contraste, las partículas de oro y IKKα- IKKβ de etiquetado se detectaron principalmente en el citoplasma (Fig. 2C y 2D), mientras que la IKK también fue detectado en el núcleo, que es coherente con los informes anteriores [31], [32] . Aunque las subunidades básicas de IKK se ha demostrado que se encuentra en la fracción mitocondrial [33], nuestros datos muestran que las partículas de oro de IKK-etiquetado se ven a menudo en las estructuras vesiculares en lugar de las mitocondrias (Fig. 2C y 2D). Esta discrepancia puede deberse al estudio previo realizado con el fraccionamiento subcelular. Cuando la Hsp60 y IKK fueron co-manchado, la unión directa de 20 nm y 40 nm partículas de oro se detectó claramente en el citoplasma (Fig. 2E y 2F). Debe tenerse en cuenta que no toda la IKK y IKKβ estaban asociados con Hsp60. Estos resultados indican que la Hsp60 colectivamente interactúa directamente con el complejo IKK en el citosol.
células HeLa se immunoreacted sin primario (A), anti-Hsp60 (B), anti-IKK (C), anti-IKKβ (D), anti-Hsp60 anticuerpos /IKKβ (F) anti-Hsp60 /IKK (e), y, a continuación, etiquetados con los anticuerpos secundarios conjugados con correspondientes 20 nm o 40 nm partículas de oro, tal como se describe en el Procedimiento Experimental. El etiquetado se evaluó mediante microscopía electrónica de inmuno-oro. Los núcleos (Nu) y las mitocondrias (M) se indican.
Las flechas indican
adherencia directa de Hsp60- y partículas de oro de IKK-etiquetado. No hay señal inmunorreactiva se observó en la muestra sin anticuerpos primarios (A). Los experimentos se repitieron dos veces con los mismos resultados, y los resultados representativos se muestran.
Hsp60 interactúa directamente con IKK /β, no IKKγ
A continuación, analizamos la interacción molecular de Hsp60 y IKK. Para ello, se construyó una versión específica de citosol-Hsp60 (Hsp60c), que se ha suprimido la secuencia señal de direccionamiento mitocondrial,. Cuando se co-expresó Hsp60c con cada una de las subunidades básicas de IKK, Hsp60c interactuó con IKK y, aunque en menor medida, con IKKβ, pero no con IKKγ (Fig. 3A). Entonces, un
in vitro
experimento de unión usando las proteínas recombinantes de glutatión-S-transferasa (GST) y -fused Hsp60 (Su)
6-etiquetados subunidades básicas IKK fue evaluado por un GST pull-down ensayo. El resultado, de nuevo, indica que Hsp60 se une directamente a IKK y IKKβ, pero no a IKKγ (Fig. 3B).
A. La unión directa de Hsp60 y IKK subunidades. Las células 293T se cotransfectaron con Hsp60c (etiqueta HA) y cada una de las proteínas de subunidades de IKK (etiqueta FLAG) durante 24 hrs. B.
in vitro
asociación de Hsp60 con IKK y IKKβ. proteínas Hsp60 GST fusionado unidos a las perlas de sefarosa de glutatión se incubó con los lisados de células de insecto Sf9 para expresar sus proteínas IKK
6-etiquetados. Hsp60 y IKK se detectaron por inmunotransferencia para las etiquetas GST y HA, respectivamente. C. diagrama esquemático que muestra los mutantes de deleción de Hsp60. Los sitios de fosforilación putativos de quinasas, incluyendo PKA /PKG (1) y PKC (2), se indican. D y E. La interacción de Hsp60 de tipo salvaje (WT) y mutantes de deleción con IKK ectópica expresada en células 293T (D) o al complejo de IKK endógeno en células HeLa (E). El vector de control (C) está indicado. Las transferencias se muestran imágenes representativas y (
n
= 3). N. S., no específica.
La interacción molecular de Hsp60 con IKK se caracteriza además por experimentos de mapeo de dominio. Debido a que la deleción C-terminal obstaculizada la expresión ectópica, una serie de mutantes de deleción N-terminales de Hsp60c fue probado para IKK de unión a través de la co-expresión con IKK Bandera de etiquetado en las células HEK293 (Fig. 3C). Los resultados mostraron que la parte N-terminal (~ 160 aminoácidos de N-terminal) de la proteína Hsp60 ha demostrado ser prescindible para la interacción (Fig. 3D). Se obtuvo el mismo resultado cuando complejo IKK endógeno se inmunoprecipitó a partir de células HeLa transfectadas con las construcciones de Hsp60c (Fig. 3E). Los resultados bastante indican que el dominio de unión del núcleo se encuentra en el medio de la proteína Hsp60.
Hsp60 está implicada en la IKK /NF-kB activación
A continuación, el efecto biológico de citosólica Hsp60- interacción IKK se investigó en ruta de NF-kappa B mediada por TNF-α. Para lograr el objetivo, el paso esencial consiste en manipular el nivel de Hsp60 citosólico sin afectar el mitocondrial porque la deficiencia de Hsp60 se sabe que causa un defecto funcional mitocondrial [34], [35], [36]. Curiosamente, un número de estudios ha informado anteriormente de que un oligodesoxinucleótido antisentido (AS-ODN) complementaria a una secuencia que rodea el codón de iniciación del marco de lectura abierto Hsp60 humano en realidad reduce el nivel de Hsp60 citosólico [27], [37], [38] . Nosotros, por lo tanto, decidimos probar este AS-ODN (designado como AS-1) para un efecto de derribo selectivo. Con el fin de excluir la posibilidad de una acción no específica de una secuencia de ODN en particular, se optó por un segundo AS-ODN (AS-2) que es complementaria a la región (+ 95~ + 110 del codón de inicio) cerca del extremo 5 ' , pero después mitocondrial secuencia señal de direccionamiento (MTS), del marco de lectura abierto Hsp60 (Fig. S1 a). El sentido ODN (S-ODN) complementarios a AS-1 se utilizó como un ODN control. Dado que el ODN antisentido es un bloqueador de traslación moderado, no provocó la reducción del nivel total Hsp60 (Fig. S1B). Sin embargo, la transfección de AS-ODN de hecho reduce selectivamente los niveles de Hsp60 citosólico en comparación con el simulacro o control S-ODN sin afectar el nivel mitocondrial (Fig. 4A). Para entender este fenómeno, la hipótesis de que la vida media de la proteína Hsp60 en dos compartimentos puede ser diferente. Para demostrarlo, la vida media de Hsp60 citosol-dirigida (Hsp60c) se evaluó después de la inhibición de la síntesis de proteínas. Sorprendentemente, el nivel de proteína Hsp60 citosólico se redujo rápidamente (calculado
t
½ = 3,2 min), mientras que el nivel total de las proteínas Hsp60 y IKK endógenos se mantuvo sin cambios (Fig. 4B). Por otra parte, esta reducción fue completamente bloqueado por el tratamiento de un inhibidor del proteasoma MG132 (Fig. 4C). Se observa que el tratamiento MG132 también resultó en el notable aumento del nivel basal de la proteína Hsp60c. Por lo tanto, este resultado, al menos en parte, explica por qué el nivel de Hsp60 citosólico fue más sensible al tratamiento AS-ODN, y además sugiere que el nivel de Hsp60 citosólico podría ser controlado por proteasoma.
A. La ablación de citosólica Hsp60 por ODNs antisentido. Las fracciones citosólica y mitocondrial preparados a partir de células HeLa transfectadas simuladas o-ODN fueron immunoblotted. S, sentir ODN; AS-1 y AS-2, ODNs antisentido. La fracción mitocondrial se cargó a un volumen de un quinto de la fracción citosólica correspondiente. En particular, Prx III, que es una enzima antioxidante presente en la matriz mitocondrial, se utilizó como marcadores mitocondriales para ver la ruptura mitocondrial no específica. B. La vida media de la proteína expresada Hsp60c ectópica-(etiqueta HA) después de la inhibición de la síntesis proteica con cicloheximida. La intensidad de la banda de HA se midió y se normalizó por la cantidad de banda de IKK. Los datos en el gráfico son medias ± S. D. de dos experimentos independientes y equipado en el software SigmaPlot 8.0. C. rotación proteasoma dependiente de la proteína citosólica Hsp60c. Las células HeLa se trataron previamente con o sin MG132 (5 M) 30 min antes del tratamiento con cicloheximida. D. TNF-α inducida por la activación de IKK y JNK1 en las células transfectadas simuladas o-ODN. El
in vitro
la actividad quinasa en (KA) se promedió con los valores de dos experimentos independientes, y se representa como un aumento del pliegue de la actividad en comparación con las células no transfectadas y falsos (carril 1). E. NF-kB activación transcripcional en las células transfectadas simuladas o ODN. Se ensayó la concentración cada vez mayor de AS-ODN (100 nM o 200 nM). La actividad luciferasa se normalizó con respecto a la actividad β-galactosidasa y los datos son medias ± S. D. de cuatro experimentos independientes (*
P Hotel & lt; 0,0001, **
P Hotel & lt; 0,001 frente a las células transfectadas-S-ODN estimulados).
El TNF inducida por la activación de IKK -α /NF-kB se examinó en las células transfectadas-AS-ODN. Un
vitro
ensayo de quinasa in demostró que la transfección de ODN AS-redujo apreciablemente la activación IKK en respuesta a TNF-α por 60% en comparación con la de la maqueta o S-ODN (Fig. 4D). Sin embargo, el AS-ODN no tuvo ningún efecto sobre la activación de la MAP quinasa en respuesta a TNF-α (Fig. 4D y la Fig. S1C), revelando el efecto específico de la Hsp60 AS-ODN sobre la activación de IKK. Además, los ODNs AS-abolió casi por completo la activación de la transcripción NF-KB en respuesta a TNF-α, mientras que S-ODN no lo hizo, en comparación con el modelo de células tratadas (Fig. 4E). Debido a su eficacia de abatimiento, AS-1 es más potente que la AS-2. Sin embargo, la transfección de ODN en sí no indujo la activación basal NF-kB, lo que indica ningún efecto fuera del objetivo de ODN. Además, el efecto reductor de AS-ODN sobre la actividad transcripcional de NF-kappa B también fue evidente en las células 293T y A549 (Fig. S1D). Un experimento de control adicional mostró que los AS-ODN no tuvo ningún efecto otra activación del factor de transcripción, tales como AP-1, NF-AT, y CRE (Fig. S1E).
Un estudio similar se llevó a cabo mediante el bloqueo de la citosólica Hsp60 utilizando un anticuerpo específico (Hsp60N), que se ha usado para la inmunoprecipitación y immunostaing de Hsp60 (ver Fig. 1). La transducción de anticuerpo se consigue mediante un sistema de entrega de la proteína péptido mediada por [39]. Se encontraron el control de IgG de cabra y anticuerpo Hsp60N para ser entregado con éxito a citoplasma, como no siendo fusionado con Mitotracker (Fig. 5A), y Hsp60N, pero no IgG de control, con destino a la Hsp60 (Fig. 5B). Este resultado indica que el anticuerpo entregado puede actuar como un bloqueador de función. Entonces, la activación de IKK /NF-kB fue examinada en células de anticuerpos transducidas. El anticuerpo Hsp60N reduce evidentemente la activación IKK en respuesta a TNF-α por 50% del nivel obtenido con la IgG control (Fig. 5C). Por el contrario, la activación de JNK inducida por TNF-α no se vio afectada, lo que demuestra una vez más que el papel de Hsp60 es específico de la activación de IKK. En consonancia, el anticuerpo Hsp60N redujo significativamente la actividad transcripcional de NF-kappa B (Fig. 5D). Los datos llegan a la conclusión de que colectivamente citosólica Hsp60 promueve la señalización IKK /NF-B inducida por TNF-α.
A. Transducción de anticuerpo Hsp60-neutralizante (Hsp60N) en el citoplasma de las células HeLa. Mitotracker Red (Molecular Probes, EE.UU.) y DAPI indican las mitocondrias y los núcleos, respectivamente. B. El anticuerpo Hsp60N transducidas unido a endógena Hsp60. Después de la transfección de anticuerpos, los lisados de células HeLa se sometieron a precipitación usando proteína A Sepharose bolas. Las proteínas precipitadas se immunoblotted de Hsp60. C. IKK y JNK1 activación en respuesta a TNF-α en IgG de control o células HeLa transfectadas con anticuerpos Hsp60N. La
vitro
actividad de la quinasa en (KA) se promedió con los valores de dos experimentos independientes, y se representa como un aumento de veces de la actividad en comparación con el no estimulada y controlar las células transfectadas con IgG (carril 1). activación de la transcripción NF-kB D. TNF-α inducida por anticuerpos en células transfectadas (*
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con las células transfectadas con IgG estimulados).
La expresión ectópica de citosol -targeted Hsp60 promueve suficientemente IKK /NF-kB activación
a la inversa, el papel de Hsp60 citosólico en la vía IKK /NF-kB fue dirigida por la sobre-expresión de Hsp60c citosol de orientación. El Hsp60c ectópica expresada se encontró a asociarse con el complejo (Fig. 6A) IKK y marcadamente mejorado la activación de IKK y NF-kappa B en respuesta a TNF-α (Fig. 6B y 6C). Cabe señalar que la expresión ectópica de Hsp60c inducida marginalmente la basal de activación de IKK y NF-kB. El efecto de la expresión Hsp60c en la activación de NF-kB fue completamente abolida en células IKKβ deficiente (Fig. 6D), lo que indica que la actividad reguladora de citosólica Hsp60 es IKK-dependiente. Además, la expresión ectópica de Hsp60c no aumentar, ya sea la activación de JNK o la activación de otros factores de transcripción tales como AP-1, CRE, y NF-AT (Fig. S2). Este resultado indica que el aumento del nivel de Hsp60 citosólico aumenta /activación de NF-kB inducida por IKK-TNF-α.
Las células fueron transfectadas con cualquiera de control (CGN) o Hsp60c de codificación de plásmido (etiqueta HA) durante 24 horas y después se trató con TNF-α. A. Incorporación de Hsp60c ectópica expresado-(etiqueta HA) en el complejo IKK. B. TNF-α inducida por la activación de IKK en células HeLa. C TNF-α inducida por la activación de NF-kB en las células HeLa (
n
= 4, *
P Hotel & lt; 0,0001 frente contraparte no estimulada). la activación de NF-kB D. TNF-α inducida en el transfectadas IKKβ
- /- 3T3 (
n
= 4, *
P Hotel & lt; 0,001 frente estimulado CGN-transfectadas células, no detectado ND).
Hsp60 regula la fosforilación de IKK en la activación del bucle T
Para comprender el mecanismo subyacente a la acción reguladora de Hsp60 en la activación de IKK /NF-kB, se intentaron varios enfoques experimentales. Para determinar si se requiere la actividad chaperona de la Hsp60, los dos residuos de aminoácidos que son conocidos por ser crítico para se consideró la actividad chaperona de la Hsp60. Uno de ellos es un resto de lisina (K28), que está implicado en la oligomerización de la proteína Hsp60 [40], [41]. El otro es un resto de aspartato (D423), que es un residuo de sitio activo para la actividad ATPasa [42], [43]. Por lo tanto, los mutantes Hsp60c, en el que K28 y D423 están sustituidos con glutamato y alanina, respectivamente, se construyeron. El experimento de co-transfección demostró que ambos mutantes interactuaron con IKK y IKKβ tan bien o incluso mejor que el de tipo salvaje (Fig. 7A). La activación IKK en respuesta a TNF-α en las células mutantes que expresan Hsp60 fue similar a la del tipo salvaje (Fig. 7B), lo que indica que tales mutaciones de pérdida de función no afectó a la actividad IKK-mejora. Además, inducida por TNF-α transcripción NF-kB fue incluso mejorada en las células mutantes que expresan Hsp60 en aproximadamente 4-6 veces mayor que en el control de vector (Fig. 7C). El efecto potenciador de los mutantes fue claramente IKKβ-dependiente, como se prueba de nuevo en las células 3T3 IKKβ deficientes. Por lo tanto, este experimento utilizando los mutantes de pérdida de función sugieren fuertemente que las funciones de Hsp60 citosólico independientemente de la actividad chaperona en la activación de IKK /NF-kB.
a. Asociación de Hsp60c de tipo salvaje (WT) y mutantes con IKK y IKKβ. Las proteínas indicadas se co-expresan en células 293T tal como se muestra en la Fig. 3A. B y C. IKK (B) y la activación de la transcripción NF-kB (C) en las células que expresan Hsp60c de tipo salvaje y mutantes de chaperona inactivos. Se analizaron las actividades de quinasa y reportero tal como se describe en la Fig. 4 (para el ensayo reportero,
n
= 6, *
P Hotel & lt; 0,0001 frente contraparte no estimulada). D.
vitro
actividad de la quinasa IKK En de en presencia de la proteína Hsp60 recombinante. El complejo IKK se inmunoprecipitó a partir de lisados de células HeLa y se incubó con o sin las proteínas GST se indican (20 g cada uno) en el tampón de reacción quinasa por 10 min antes de la reacción de la quinasa. fosforilación E. Serine de IKK /β en células HeLa transfectadas con ODN AS-1. Los datos en el gráfico son medias ± S. D. (
n
= 3, *
P Hotel & lt; 0,02, *
P Hotel & lt; 0,001). F. fosforilación de la serina de IKK /β en células HeLa Hsp60c-expresión. Se muestra una mancha representante (
n
= 3).
Uno de la proteína IKK-interactuando, alces, se ha demostrado que mediar en la contratación de I? B de IKK complejo [24] . Para probar este modo de acción, la proteína Hsp60 recombinante se añadió directamente en la reacción de la quinasa IKK, donde se incuba el complejo IKK activado con I? B humana de longitud completa como un sustrato. La
in vitro
actividad de la quinasa de la IKK activado hacia I? B no se vio afectada por la presencia de la proteína Hsp60 (Fig. 7D), lo que indica que Hsp60 no está implicado en la interacción de IKK y su I? B sustrato.
por último, una participación directa de Hsp60 citosólico en la activación de IKK se abordó mediante el examen de la fosforilación de la serina dependiente de la activación en el T-loop de IKK /β. La transfección AS-ODN marcadamente abolió la fosforilación inducida por TNF-α de IKK en Ser178 /181, lo que indica que la activación de IKK dependiente de la fosforilación se vio afectada (Fig. 7E). Por el contrario, la expresión ectópica de Hsp60c resultó en un aumento de la fosforilación de IKK (Fig. 7F). En general, los datos indican que la Hsp60 citosólico está implicado en la activación de IKK dependiente de la fosforilación, en lugar de la estabilización chaperona dependiente del complejo de IKK.
citosólica Hsp60 afecta a la expresión del gen diana y la célula de supervivencia NF-kappa B
Para determinar la importancia de la regulación mediada por Hsp60 citosólico de la vía IKK /NF-kB, hemos examinado la expresión de NF-kB genes diana en las células transfectadas con ODN. Cuando la expresión de genes anti-apoptóticos se proyectó mediante un ensayo de protección de RNasa [44], la expresión de TRAF1, c-IAP1, y c-IAP2 no se vieron afectados por AS-ODN transfección (Fig. 8A). Esto fue inesperado, pero nos llevó a postular la posibilidad de que algunos genes diana selectos relacionados con la protección mitocondrial pueden ser afectados. Para probar esto, nos fijamos en la inducción de varios genes diana, incluyendo las proteínas antioxidantes (cadena pesada de ferritina y MnSOD) y Bcl-2 miembros (Bcl-2, Bcl-X
L, Bfl-1 /A1). Curiosamente, el AS-ODN disminuyó significativamente la inducción de solamente MnSOD y Bfl-1 de expresión /A1 en respuesta a TNF-α (Fig. 8B). El anticuerpo Hsp60N también redujo significativamente la inducción de estos genes (Fig. 8C). Se confirmó de nuevo que la inducción de la expresión de c-IAP2 no se vio afectado en ambos casos. Por lo tanto, los resultados indican que la regulación de la activación de IKK por Hsp60 citosólico influye en la expresión de genes diana seleccione NF-kB.
A. RNasa protección de ensayo para la inducción de genes anti-apoptóticos en las células transfectadas con ODN. El autorradiograma mostrado es un representante de tres experimentos independientes. B y C. QPCR para la inducción de genes diana endógenos NF-kB en las células transfectadas con ODN (B) y células transfectadas con anticuerpos (C) (
n
= 3, *
P & lt
; 0,01, **
P Hotel & lt; 0,001). D. TNF-α mediada por la producción de ROS celular en células transfectadas con ODN. Se muestran las imágenes representativas. Los datos son medias ± S. D. de veces de incremento en comparación con las células no tratadas simuladas de la fluorescencia DCF relativa (
n
= 4, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,001). E. JNK y la activación de p38 MAPK en las células transfectadas con ODN. se muestran transferencias representativas. Los datos en los gráficos son medias ± S. D. de las intensidades de fosfo-JNK (p46) o bandas fosfo-p38 que había sido normalizados por los correspondientes no fosfo-bandas (
n
= 3, *
P
& lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,001). F. ASK-1 de activación en las células transfectadas con ODN. La actividad de la quinasa (KA) se promedió con los valores de dos experimentos independientes, y presentado como un aumento de veces de la actividad en comparación con las células no estimuladas y transfectadas de manera simulada (carril 1). G. TNF-α-indujo la muerte celular en simulada o transfectadas con ODN HeLa. Los datos son medias ± S. D. (
n
= 3, *
P Hotel & lt; 0,01). H. TNF-α-indujo la muerte celular de las células de carcinoma de colon transfectadas con ODN. Se muestra el nivel de Hsp60 en las fracciones subcelulares (
Alta
). Los datos en el gráfico son medias ± S. D. (
n
= 3, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01). La muerte celular se analizó mediante FACS después de la tinción con anexina V-isotiocianato de fluoresceína y yoduro de propidio.
A continuación se pregunta si dicha regulación de los genes diana de selección tiene un impacto en la supervivencia celular. Puesto que hay una posibilidad de que MnSOD y la función Bfl-1 /A1 para suprimir la especie mitocondriales derivados reactivas de oxígeno (ROS) [2], [45], el nivel de ROS celular se examinó en las células transfectadas con ODN usando una oxidación colorante fluorescente sensible, CM-H
2DCFDA. La transfección AS-ODN indujo un marcado aumento de ROS celulares en respuesta al tratamiento TNF-α en una manera dependiente del tiempo, en comparación con (Fig. 8D) mock o transfección S-ODN. Puesto que el nivel de ROS está vinculada a la muerte celular a través de la activación sostenida de JNK [46], la activación sostenida de las proteínas quinasas activadas por estrés, JNK y p38 MAPK, se examinó. Inesperadamente, se encontró que la activación de ambos JNK y p38 MAPK ser claramente sostenida en las células transfectadas con AS-ODN (Fig. 8E). El MAP3K ASK-1 es conocido por ser responsable de la activación sostenida de JNK y p38 en la muerte celular mediada por ROS [47]. Como se muestra en la Fig.