Extracto
Antecedentes
factores inmunosupresores tales como células T reguladoras (Treg) límite la eficacia de inmunoterapias. inhibidores de histona desacetilasa (HDAC) se han informado que tienen actividad antitumoral en diferentes tumores malignos y los efectos inmunomoduladores. Aquí, se presenta el efecto Treg-focalización y la inmunológica promotoras de una clase I inhibidor de HDAC específica, entinostat, en combinación con IL-2 en un modelo de carcinoma de células renales murino (RENCA) o una terapia con vacunas a base de survivina (SurVaxM) en un cáncer de próstata resistente a la castración (CR-Myc CaP) modelo.
Métodos y resultados
RENCA o tumores Myc-Cap CR se implantaron de forma ortotópica o subcutánea, respectivamente. ratones inoculados fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento: vehículo, entinostat, citoquinas o de vacuna, y de la combinación. Tregs en la sangre se evaluaron mediante análisis de FACS. PCR en tiempo real cuantitativa y análisis de transferencia Western de aislados subpoblaciones de células T de bazo se llevaron a cabo para determinar gen Foxp3 y expresión de proteínas. La función supresora de células T reguladoras se ensayó mediante el ensayo de proliferación de células T. Dosis baja (5 mg /kg) redujo los niveles de entinostat Foxp3 en Tregs y esto se asoció con la inhibición del crecimiento tumoral mejorado en combinación con IL-2 o una vacuna SurVaxM. Entinostat el regulado transcripcionalmente la expresión de Foxp3 Treg y bloqueó función supresora sin afectar a las células T efectoras (Teffs).
in vitro
entinostat dosis baja (0,5 M) inducida por acetilación STAT3 y un inhibidor específico de STAT3 parcialmente rescatado entinostat inducida por la baja regulación de Foxp3, lo que sugiere que la señalización de STAT3 está involucrado en Foxp3 baja regulación por entinostat.
Conclusiones
Estos resultados demuestran un nuevo efecto inmunomodulador de la inhibición de clase I de HDAC y proporcionan un fundamento para el ensayo clínico de entinostat para mejorar la inmunoterapia del cáncer
Visto:. Shen L, Ciesielski M, Ramakrishnan S, Miles KM, Ellis L, Sotomayor P, et al. (2012) Categoría I Inhibidor de histona deacetilasa entinostat Suprime las células T reguladoras y mejora en inmunoterapias renal y Modelos del cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (1): e30815. doi: 10.1371 /journal.pone.0030815
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: 10 Agosto, 2011; Aceptado 21 de diciembre de 2011; Publicado: 27 de enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por una beca de investigación por el Instituto Nacional del cáncer-23 R21CA137649. No se recibió financiación externa adicional para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el crecimiento del tumor representa un resultado de las células tumorales escapan la vigilancia inmune del huésped. A pesar de algunos éxitos, las intervenciones inmunoterapéuticas han demostrado un beneficio limitado. Una barrera importante está representada por la presencia de factores inmunosupresores que parecen ser predominantes en los pacientes con cáncer. Estos componentes inmunosupresores incluyen Tregs [1], [2], células mieloides derivados supresores (MDSCs), puestos de control inmunológicas mediadas por moléculas de superficie celular, tales como CTLA-4 [3] y PD-1 [4], y citoquinas circulantes, tales como TGF -β y IL-10 [5]. Los estudios han demostrado que estos mecanismos de tolerancia pueden ser inducidas por el tumor y las células del estroma circundante. Tregs normalmente mantienen la tolerancia a antígenos propios y prevenir respuestas autoinmunes [6], [7]. Por otro lado, las células T reguladoras se han identificado como uno de los principales actores de la tolerancia inmunológica del tumor. La evidencia que apoya la promoción incluye células T reguladoras en pacientes con cáncer de células T reguladoras y la expansión luego de la inmunoterapia [2], [8] - [11]. Otros informes clínicos sugieren que el agotamiento de las células T reguladoras puede potenciar una respuesta inmune antitumoral en pacientes con cáncer.
Las dosis altas de IL-2 es un tratamiento aprobado por la FDA para pacientes seleccionados con cáncer de células claras metastásico de células renales [12], [ ,,,0],13]. terapia con IL-2 induce respuestas objetivas en aproximadamente el 20% de los pacientes, con respuestas completas duraderas en una pequeña fracción. Dada la limitada eficacia de la terapia de alta dosis de IL-2, los esfuerzos adicionales se han dirigido a aumentar la eficacia de este enfoque inmunoterapéutico.
terapias de vacunas siguen siendo de beneficio limitado en tumores sólidos, aunque la terapia de vacuna Sipuleucel-T era recientemente aprobado para el tratamiento de cáncer de próstata resistente a la castración. Células T reguladoras son predominantes en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata avanzado [2]. Los estudios han demostrado que la presencia de factores inmunosupresores tales como células T reguladoras juegan un importante papel en la tolerancia inmune y baja eficacia en la terapia de vacuna [14], [15]. De acuerdo con ello, la combinación de vacunas con enfoque (es) para agotar o suprimir Tregs representa una estrategia racional en el tratamiento del cáncer de próstata.
HDACs han demostrado estar involucrados en la transformación oncogénica por mediación de la regulación transcripcional de genes que están involucrados en la progresión del ciclo celular, la proliferación y la apoptosis [16], [17]. inhibidores de HDAC se están desarrollando actualmente para el tratamiento del cáncer y han demostrado actividad antitumoral en diferentes tumores. HDAC se han caracterizado en cuatro clases diferentes con diferentes objetivos y localizaciones subcelulares. Además de las histonas, varias proteínas no histonas también son acetilados reversiblemente en los residuos de lisina y estas modificaciones post-traduccionales también pueden desempeñar un papel importante en los efectos antitumorales de los inhibidores de HDAC [18] - [20]. La benzamida sintético, entinostat, es un inhibidor selectivo de las HDAC de clase I. Entinostat tiene actividad antitumoral tanto
in vitro
y
in vivo
en varios modelos tumorales [21] - [24]. Además, nuestro grupo ha informado anteriormente de la actividad antitumoral sinérgica de entinostat en combinación con una alta dosis de IL-2 en el modelo RENCA [25].
Los estudios experimentales recientes han demostrado que los inhibidores de HDAC tienen actividad inmunomoduladora potencial tanto i
n vitro
y
in vivo y modelos de inflamación, autoinmunidad y trasplante. inhibidores de la HDAC pueden afectar a la respuesta inmune mediante la regulación de la producción de citoquinas. En un modelo murino de trasplante de médula alogénico de médula, el inhibidor de HDAC, vorinostat (SAHA), la reducción de la enfermedad aguda de injerto contra huésped por la supresión de citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-α, IL-1, y INF-γ [26 ]. El inhibidor de HDAC, LAQ824, se ha demostrado que altera la activación y la función de los macrófagos y las células dendríticas. LAQ824 también se ha encontrado para modular la función de células dendríticas para inhibir Th1, Th2, pero no la función efectora [27]. Además, los inhibidores de HDAC pueden regular la transcripción de mayor histocompatibilidad de clase I y II [28], o la activación de moléculas coestimuladoras [28], [29]. Más recientemente, se ha informado de que un inhibidor de HDAC pan, tricostatin A (TSA) puede aumentar la función de células T reguladoras y mejorar su efecto inmunosupresor
in vivo
[30]. Además, los resultados positivos de los ensayos clínicos en los linfomas de células T cutáneas (CTCL) sugieren que los inhibidores de HDAC pueden afectar a la respuesta inmune, ya que algunos de los mecanismos patológicos de CTCL están mediadas a través de la inflamación y un desequilibrio del sistema inmunológico. En conjunto, estas observaciones sugieren que la actividad antitumoral de los inhibidores de HDAC puede ser en parte debido a sus propiedades inmunomoduladoras.
En este estudio, tenemos resultados diferentes en nuestro sistema e informamos que el tratamiento con entinostat disminuye la expresión de Foxp3 en células T reguladoras e inhibe la función supresora de las células T reguladoras. Además, la señalización de STAT3 se demostró que se asocia con Foxp3 baja regulación por entinostat. Esta propiedad de entinostat puede mejorar la respuesta inmunitaria antitumoral de la IL-2 y la terapia con vacunas y proporciona una justificación para el uso entinostat en estrategias de combinación con inmunoterapias.
Dosis alta
Resultados
Entinostat mejora de IL-2 la terapia se asocia con la modulación de células t reguladoras en el tumor de ratones portadores de
Nuestro grupo ya se ha informado de que el inhibidor de HDAC de clase I, entinostat, tiene un efecto antitumoral en el modelo RENCA [25], [31]. Entinostat parece tener un efecto inmunomodulador que conduce a un efecto antitumoral sinérgico en combinación con IL-2. tratamiento con IL-2 promueve la proliferación y activación de células T efectoras (Teffs), sino que también induce Tregs inmunosupresores con expresión estable del receptor de IL-2 CD25. Por lo tanto, en el presente estudio, nos centramos en el efecto de entinostat de células T reguladoras. Hemos probado el efecto de entinostat como agente único y en combinación con IL-2 en células T reguladoras en el modelo RENCA. células RENCA fueron inoculados ortotópicamente en ratones BALB /c. Tres días después de la inoculación, los animales recibieron tratamiento con vehículo, IL-2, entinostat (5 mg /kg), o su combinación. Después de 5 días de tratamiento, se recogió sangre periférica de cada ratón, teñidas para marcadores de superficie celular y proteínas Foxp3 intracelular, y se somete a fluorescencia celular asociada análisis de clasificación (FACS). No se observaron diferencias significativas en el número de CD4
+ Foxp3
+ células T reguladoras (Fig. 1A y B). Sin embargo, los niveles de proteína Foxp3 en CD4
+ Foxp3
+ células, tal como se representa como intensidad media de fluorescencia (MFI), disminuyeron con el tratamiento entinostat (Fig. 1A y B). Un aumento en los niveles de Foxp3 se observó con el tratamiento con IL-2 solo, lo que confirma la idea de que la IL-2 promueve Tregs mientras que el apoyo proliferación de células T. En el tratamiento de combinación, entinostat todavía rescató niveles de Foxp3 de nuevo a los niveles de control (Fig. 1A y B). Western blot análisis mostró que
in vivo
entinostat tratamiento aumentó el nivel de acetilación de la histona H3 en esplenocitos (Fig. 1F). efectos antitumorales de los tratamientos se evaluaron mediante la evaluación de pesos de los tumores después de dos semanas. No se observaron cambios significativos en el peso corporal con tratamientos. tratamiento con IL-2 inducida por una modesta reducción de peso del tumor (& lt; 10%). la administración del agente solo Entinostat a 5 mg /kg dio lugar a una reducción significativa del peso del tumor en comparación con el grupo control (reducción de ~ 40%, Fig. 1C). La combinación de entinostat con IL-2 tenía un mucho mayor efecto inhibidor sobre el crecimiento del tumor (reducción de ~ 80%, Fig. 1C). Para determinar si la reducción de la expresión de Foxp3 y la inhibición del crecimiento tumoral inducida por entinostat se asoció con un aumento de la respuesta inmune, se analizó la inducción de IFN-γ. IFN-γ se indujo ligeramente en las células CD8 en los animales tratados con IL-2, mientras que las células CD8 en los animales tratados con la combinación tuvieron mucho mayor de IFN-γ de inducción (Fig. 1D). En conjunto, estas observaciones sugieren que entinostat mejora de células CD8 respuesta inmune inducida por IL-2, mientras que la reducción de nivel de Foxp3 en Tregs.
Los ratones con inoculación ortotópico de células RENCA fueron tratados durante 5 días. Se extrajo sangre de los ratones en el quinto día y se tiñe para anticuerpos específicos para CD4, CD25 y Foxp3. pesos de los tumores se midieron al final de dos semanas de tratamiento. A y B, Efecto de entinostat en Tregs en ratones portadores de tumores. A, Efectos de vehículo, IL-2, entinostat, o tratamiento de combinación sobre la expresión de Foxp3 Treg. Las células se tiñeron y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Los gráficos de puntos fueron cerrada de CD4
+ células. El área rectangular encierra los CD4
+ Foxp3
+ células, los números en la parte superior representan el porcentaje de Foxp3
+ células. Los números en la parte inferior de la zona representan la intensidad media de fluorescencia (MFI) de Foxp3 PE tinción de las células CD4
+ Foxp3
+ células. B, La cuantificación del porcentaje de células T reguladoras en la población CD4 (panel izquierdo) y los niveles de Foxp3 (IMF) en células T reguladoras (panel derecho) por análisis FACS. Los valores son medias y las barras de error representan S.D. durante 5-7 muestras por grupo. En el panel derecho,
p = 0,0011
para IL-2 vs. vehículo;
p = 0.000009
para el vehículo entinostat vs. Los resultados son representativos de tres experimentos distintos. C, las mediciones de peso del tumor. Columnas, gramos medios de tumor; Bares, S. D. n = 5-7.
p = 0,0209 para
entinostat vs vehículo;
p = 0,0077
para la combinación vs vehículo;
p = 0,0272
para la combinación frente a entinostat. Los resultados son representativos de tres experimentos distintos. D, Entinostat mejorada IFN-γ tipo de respuesta inmune inducida por el tratamiento con IL-2. Los esplenocitos (1 × 10
6 células) fueron cosechadas y estimuladas con PMA (20 ng /ml) e ionomicina (1 mg /ml) durante 5 horas en presencia de Brefeldina A. Después las células se tiñeron para los marcadores de superficie e intracelulares IFN-γ. Los histogramas muestran el porcentaje de IFN-γ que expresan las células de la población CD8.
p = 0,01
para la combinación frente a IL-2. E, Entinostat reduce la infiltración tumoral de células T reguladoras. Tumor secciones se tiñeron con anticuerpo anti-Foxp3 para mostrar la infiltración de células T reguladoras. Histograma muestra el número promedio de células T reguladoras manchadas en al azar 20 campos brillantes × resolución (número de células T reguladoras en cada campo se obtuvo mediante el recuento ciego). tratamiento F, Entinostat inducida H3 acetilación de histonas en esplenocitos. ratones BALB /c fueron tratados con vehículo (0,5% de METHOCEL) o 5 mg /kg /día entinostat por sonda durante 5 días. Las células se recogieron a partir de bazos y se sometieron a análisis de Western blot para la histona H3 acetilada-.
Hemos examinado si el tratamiento entinostat afectó a las células T reguladoras que se estaban infiltrando en los tumores. Tinción inmunohistoquímica de las secciones de tumor demostró que el tratamiento entinostat reduce la infiltración de células T reguladoras (Fig. 1E y Fig. S1).
También probamos el anticuerpo anti-ratón CD25, PC61, para agotar Tregs [32] en el modelo RENCA. tratamiento PC61 a 500 mg /ratón /sem era suficiente para agotar CD25
+ células (Fig. 2A), reducido drásticamente CD4
+ Foxp3
+ número de células Treg (Fig. 2A), y tenía un parecido efecto antitumoral como se observa con entinostat (Fig. 2B). Además, la adición de un tratamiento PC61 no tenía una actividad antitumoral adicional sobre el tratamiento entinostat (Fig. 2B), lo que sugiere que entinostat y PC61 pueden tener un mecanismo redundante de la actividad
.
A, gráficos muestran el efecto del vehículo, PC61, el tratamiento entinostat o su combinación sobre los niveles de CD25 y Foxp3. Cuantificación del porcentaje de células T reguladoras, Foxp3 expresión por análisis FACS se muestra como histogramas. Los valores son medias y las barras de error representan S.D. para 6-7 muestras por grupo. B, las mediciones de peso del tumor del experimento agotamiento PC61. Columnas, gramos medios de tumor; Bares, S.D. .. n = 6-7. * Representa
p Hotel & lt; 0,05 para punto marcado vs vehículo; ** Representa
p
. & Lt; 0,01 para el punto marcado vs vehículo
Entinostat sinergia con la terapia con vacunas de péptidos en un modelo de cáncer de próstata resistente a la castración
Además a una terapia con citocinas, también a prueba entinostat en combinación con otro enfoque inmunoterapéutico, una terapia de vacuna de péptido, en un cáncer de próstata resistente a la castración (CR Myc-CaP) modelo. Se utilizó una modificación novedosa vacuna de péptido de survivina SVN53-67 /M57-KLH (SurVaxM) [33]. La survivina es un antígeno asociado a un tumor intracelular expresada en tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata. El nivel de expresión de survivina se asocia con la progresión del tumor y la agresividad [34], y representa una diana adecuada para la terapia con vacunas. Un cáncer de próstata resistente a la castración transplantable modelo (CR Myc-CaP) se ha desarrollado en nuestro laboratorio [35]. células Myc-Cap, derivadas de la próstata modelo de ratón transgénico de cáncer Hi-myc [36], se inyectaron (1 × 10
6 células /ratón) por vía subcutánea en ratones FVB masculinos. animales portadores de tumores fueron castrados quirúrgicamente el tumor establecimiento de correos y los consiguientes tumores se hicieron pasar a través de 5 rondas adicionales de ratones FVB castrados quirúrgicamente. survivin expresión se confirmó en los tumores Myc-Cap por inmunohistoquímica. CR tumor Myc-CaP ratones portadores se asignaron al azar en cuatro grupos y se trataron con vehículo, entinostat (5 días /semana, 5 mg /kg), SurVaxM (1 dosis /semana) o su combinación. Después de tres semanas de tratamiento, o tratamiento entinostat sola SurVaxM muestra efecto antitumoral modesto (10 a 25% de reducción) (Fig. 3A y B). Sin embargo, la combinación de entinostat y SurVaxM reduce drásticamente el peso del tumor (reducción de ~ 80%,
p
= 0,002) en comparación con cualquiera de los dos grupos de tratamiento individuales o vehículo (Fig. 3A y B). la tinción de células de sangre periférica mostró que el tratamiento con entinostat solo y en combinación con SurVaxM reducido nivel de Foxp3 en Tregs de ratones portadores de tumor (Fig. 3C), pero no tuvo efecto sobre el número de células T reguladoras (datos no mostrados).
A y B, Entinostat potencia el efecto antitumoral de la vacuna survivin, SurVaxM. ratones FVB fueron castrados y subcutánea inocularon con trozos de tumor resistente pequeña de castración. Aproximadamente 7 días después de la inoculación, cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 50 mm
2, los ratones se trataron tres semanas con vehículo, entinostat (5 mg /kg, 1 dosis /día, 5 días /semana), survivin SurVaxM vacuna (100 g /dosis, 1 dosis /semana), o su combinación. A, líneas individuales gráfico del crecimiento del tumor se generaron mediante mediciones de la pinza de serie. B, Los tumores fueron cosechadas al final del tratamiento y se pesa (combinación frente a la vacuna survivina,
p
= 0,003). C, el tratamiento Entinostat redujo los niveles de Foxp3 en células T reguladoras de ratones portadores de tumores CR Myc-Cap. Después de 5 días de tratamiento, se recogieron las células de sangre periférica de los ratones, se tiñeron para CD4 y Foxp3, y se sometieron a análisis FACS. La cuantificación de Foxp3 intensidad de fluorescencia media (MFI Foxp3) (vehículo vs. entinostat,
p = 0,0002
; combinación vs survivina,
p = 0,0004
).
tratamiento vacuna survivina induce a las células CD8 específicas de antígeno y entinostat sinergiza con la vacuna para inducir la respuesta inmune IFN-γ
a fin de evaluar la presencia de células T específicas de antígeno de survivina que se pueden generar en respuesta a la vacunación, hicimos una clase de péptido-MHC-I vacuna específica survivina tetrámero ensayo de unión. El tetrámero es específico de un epítopo de péptido de survivina [33]. Los esplenocitos se aislaron de los ratones que recibieron diferentes tratamientos como se hizo en el experimento de terapia y se sometió a tetrámero-survivin específica y la tinción de marcadores de superficie. Sólo los esplenocitos de ratones tratados con la vacuna de la survivina (vacuna tratamiento único y combinación) mostraron la inducción de células CD8 específicas de antígeno (Fig. 4A). Curiosamente, la tinción intracelular de citoquinas sugiere la inducción sustancial de CD8
+ IFN-γ
+ células sobre el nivel del vehículo en el grupo de combinación, que coincide con su actividad antitumoral mejorada (Fig. 4B).
. análisis de tetrámeros de los esplenocitos obtenidos de ratones inmunizados con SurVaxM. Los esplenocitos se tiñeron con anticuerpos anti-CD8 y tetrámeros-survivina específico para el análisis de citometría de flujo. Los resultados se basan en gating de las células T CD8 + e indican el porcentaje de células marcadas dobles (CD8 + /Tetrámero +) con respecto a tetrámero específico. B, el tratamiento combinado produjo CD8
+ IFN γ-
+ células inducción. Los ratones fueron tratados como se indica. Los esplenocitos se estimularon e intracelular tinción de IFN-γ se realizó como se describe en la Figura 1D.
p
. & Lt; 0,01 para la combinación vs vehículo
Entinostat suprime la expresión del gen Foxp3 Treg en las células e inhibe la función de las células T reguladoras
Para investigar más a fondo el efecto inmunológico promoviendo de entinostat, se trataron ratones BALB /c tratados previamente con vehículo o entinostat (5 mg /kg o 20 mg /kg) durante 5 días. Se recogieron los esplenocitos y células de nódulos linfáticos. El número de expresión Tregs y Foxp3 se accede por análisis FACS.
In vivo
tratamiento con entinostat no tuvo ningún efecto significativo en el número de células T reguladoras (CD4
+ Foxp3
+ células T) en las células CD4 población
+ células T de cualquiera de los ganglios linfáticos o el bazo. Sin embargo, en comparación con ratones tratados con vehículo, Tregs de ratones tratados tenían una disminución dependiente de la dosis en los niveles de Foxp3 (Fig. 5A). El efecto de entinostat sobre la expresión de Foxp3 también se ensayó mediante la medición de los niveles de ARNm de Foxp3 en poblaciones celulares aisladas por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Células T reguladoras (CD4
+ CD25
+) y no células T reguladoras (CD4
+ CD25
-) se purificaron células CD4 T de ratones tratados con vehículo entinostat- y mediante el uso de perlas magnéticas. tratamiento
In vivo
entinostat disminuyó significativamente Foxp3 ARN mensajero en células T reguladoras, en comparación con células T reguladoras de los ratones tratados con vehículo (Fig. 5B). La expresión de la proteína Foxp3 reducido en Tregs tratado también fue confirmada por análisis de transferencia Western (Fig. 5C).
ratones BALB /c fueron tratados con vehículo (0,5% de METHOCEL) o 5 mg /kg /día o 20 mg /kg /día de entinostat por sonda durante 5 días. Las células se recogieron a partir de bazos y los ganglios linfáticos. A,
En vivo
entinostat tratamiento disminuyó el nivel de expresión de Foxp3 en las células CD4 +
+ Foxp3
(Treg). Las células se tiñeron con anticuerpos de fluorescencia conjugado específicos para CD4, CD25, y Foxp3 y sometidos a análisis de citometría de flujo. Los gráficos de puntos fueron cerrada de CD4
+ células. El área rectangular encierra los CD4
+ Foxp3
+ células, los números en la parte superior representan el porcentaje de Foxp3
+ células. Los números en la parte inferior de la zona representan la intensidad de fluorescencia media de Foxp3 PE tinción de las células CD4
+ Foxp3
+ células. Los paneles de la derecha representan la cuantificación de células T reguladoras porcentaje (superior) y la expresión de Foxp3 (abajo) en el análisis FACS. El gráfico muestra los medios, barras de error representan las desviaciones estándar de 6 muestras en cada grupo.
p = 0,00078
de 5 mg /kg entinostat vs vehículo;
p = 0.000004
de 20 mg /kg entinostat vs vehículo;
p = 0,0038
de 20 mg /kg entinostat frente a 5 mg /kg entinostat. α = 0,05. Los resultados son representativos de tres experimentos distintos. B,
En vivo
entinostat tratamiento redujo los niveles de ARNm de Foxp3 Treg aisladas en. ARN totales se extrajeron de los aislados de CD4
+ CD25
+ células T (células T reguladoras) y CD4
+ CD25
- células T (Teffs) y se analizaron para Foxp3 mRNA por el tiempo real de RT-PCR. los niveles de ARNm de Foxp3 se normalizaron a GAPDH ARNm (o ribosomal RPL13A ARN) y valores representan medios para tres muestras (tres ratones por muestra) por grupo y tienen unidades relativas.
p = 0,0157
de células T reguladoras tratados con entinostat vs células T reguladoras tratados con vehículo. Los resultados son representativos de tres experimentos distintos. C,
En vivo
entinostat tratamiento redujo el nivel de proteína en células T reguladoras Foxp3. proteína celular total se extrajo de células T reguladoras aislado y Teffs y se analizó para la proteína Foxp3 por Western blot. D, los efectos del inhibidor de HDAC, entinostat, en función supresora células T reguladoras y la proliferación Teffs. Tregs ensayos de supresión: 2 × 10
5 CFSE marcado Teffs se estimularon con 0,5 g /ml de anticuerpo anti-CD3ε y 4 × 10
5 irradiado células presentadoras de antígenos (los esplenocitos CD4 células-agotado) y co-cultivadas con células T reguladoras en diferentes proporciones a Teffs de 62-80 hrs. Los porcentajes de Teffs divididas se calcularon en todos los puntos de relación para cada tratamiento. Porcentaje de supresión de Teffs divisoria se calculó para cada punto mediante la comparación de célula que se divide en cada relación de la división celular en ausencia de células T reguladoras (0:1). Panel izquierdo: Efecto del tratamiento entinostat en función de las células T reguladoras. Panel derecho: Efecto del tratamiento sobre la proliferación de entinostat Teffs. Histograma muestra el porcentaje de células T reguladoras Teffs divididas y sin. Los datos son representativos de tres experimentos separados. Los valores son medias de mediciones por triplicado. * Representa
p Hotel & lt; 0,05 para punto marcado vs vehículo; ** Representa
p
. & Lt; 0,01 para el punto marcado vs vehículo
Para determinar si la disminución de la expresión de Foxp3 Treg en entinostat tratada conduce a la alteración de la función supresora de las células T reguladoras, CFSE marcado purificada CD4
+ CD25
- células T (Teffs) fueron cultivadas con células presentadoras de anti-CD3e antígenos y anticuerpos. Tregs A continuación se añadieron a la cultura con diferentes proporciones de Treg vs. teff (Fig. 5D). ratones BALB /c fueron tratados con vehículo o diferentes dosis de entinostat
in vivo
como se indica. Tregs fueron aisladas de esplenocitos de ratones tratados diferencialmente y se cultivaron con Teffs aisladas de ratones tratados con vehículo para poner a prueba el efecto del tratamiento sobre Tregs actividades de supresión (Fig. 5D, panel izquierdo). Además, Teffs aislado a partir de esplenocitos de ratones tratados diferencialmente se estimularon para probar los efectos de diferentes tratamientos sobre la capacidad de proliferación de Teffs (Fig. 5D, panel derecho). Entinostat (5 mg /kg) tratados Tregs fueron dos o tres veces (por ejemplo, en Tregs:Teff = 01:04, 25% frente a 63% de supresión) menos eficaz en la supresión de la proliferación de Teffs tratado con vehículo Tregs (Fig. 5D , panel izquierdo). dosis más alta entinostat (20 mg /kg) inhibió la función adicional de supresión Treg con hasta siete veces (Tregs:Teffs = 01:02) reducción (Fig. 5D, panel izquierdo). Curiosamente,
in vivo
baja dosis de tratamiento entinostat (5 mg /kg) mostraron una inhibición mínima de la capacidad de proliferación de Teffs, mientras que dosis más alta (20 mg /kg) inhibió de manera significativa la capacidad de proliferación de Teffs, en comparación con vehículo Teffs tratadas (Fig. 5D, panel derecho). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que
in vivo
tratamiento con dosis baja citotóxica, no de entinostat [25] inhibe las células T reguladoras función supresora con influencia mínima sobre la proliferación Teffs capacidad.
STAT3 es acetilada por entinostat tratamiento y se asocia con Foxp3 baja regulación
a continuación examinó posibles mediadores de señalización responsables de Foxp3 baja regulación inducida por entinostat. señalización STAT3 se activa por acetilación y ha sido implicado en la modulación de Foxp3 [37], [38]. Para probar si STAT3 es uno de los objetivos de entinostat, las células HepG2, una línea celular de hepatoma con la señalización de STAT3 inducible utilizado para la señalización STAT3 estudios [38], fueron tratados durante 6 horas. El tratamiento con 0,5 M entinostat era suficiente para inducir la acetilación de STAT3 (Fig. 6A) sin cambiar significativamente los niveles totales de proteína STAT3 (Fig. 6A). Además, hemos probado la acetilación de STAT3 en esplenocitos. Una vez más, el tratamiento entinostat aumenta la acetilación de STAT3 en esplenocitos (Fig. 6B). Para promover la prueba si STAT3 está mediando la baja regulación de Foxp3 por entinostat, se utilizó una, permeable a las células péptido inhibidor altamente específico de STAT3 [39]. tratamiento Entinostat redujo los niveles de Foxp3 en Tregs, mientras que la presencia del inhibidor específico STAT3 parcialmente, pero neutraliza significativamente el efecto inhibidor de entinostat sobre la expresión de Foxp3 en Tregs (~ 50% de neutralización) tanto en ausencia y en presencia de IL-2 (Fig. 6C y 6D, respectivamente). En todas las condiciones, no hubo diferencia significativa en el número de células T reguladoras. Este resultado sugiere que STAT3 es en parte involucrada en entinostat baja regulación de la expresión de Foxp3 en células T reguladoras.
A y B, el tratamiento Entinostat induce acetilación STAT3. Las células HepG2 o esplenocitos fueron tratados durante 6 horas, se recogieron y se lisaron por inmunotransferencia Western o inmunoprecipitación. A, Entinostat inducida acetilación STAT3 en células HepG2. Panel superior: Los lisados celulares se analizaron y se transfirieron directamente con anti-STAT3 y actina. Panel inferior, lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-STAT3 y luego se transfirió con el anticuerpo anti-STAT3 y con el anticuerpo anti-acetilado lisina. B, Entinostat induce acetilación STAT3 en esplenocitos. IP e inmunotransferencia de tipo Western se realizaron como se describe en A. C y D, Down-regulación de Foxp3 se inhibe mediante el bloqueo de la señalización STAT3. Los esplenocitos se recogieron de ratones BALB /c y pusieron en cultivo. Los cultivos se trataron con vehículo o inhibidor de péptido STAT3 específico 0,5 mM durante una hora, seguido de vehículo o 0,5 M entinostat tratamiento durante 23 horas. Las células se recogieron y se analizaron por citometría de flujo usando anticuerpos de fluorescencia conjugado específicos para CD4 y Foxp3. tinte vivo /muerto corregible se utiliza para teñir las células y fueron cerrada células vivas. Cultivo de células era en ausencia (panel C) o en presencia (panel D) de IL-2. En cada condición, histogramas muestran la cuantificación de la expresión de Foxp3 en células T reguladoras por análisis FACS. El gráfico muestra los medios, barras de error representan desviaciones estándar. En C,
p = 0,0002 para
entinostat vs. STAT3 inhibidor + entinostat. En D,
p = 0,00015
para entinostat vs. STAT3 inhibidor + entinostat. Los resultados son representativos de tres experimentos separados.
Clase I, II, pero no la inhibición de HDAC clase suprime la expresión de Foxp3 Treg en
in vitro
Los estudios anteriores han informado de que la inhibición de las HDAC aumenta el número células T reguladoras, y promueve la función de las células T reguladoras y la supresión de la respuesta inmune asociada [30], [40]. Por lo tanto, hemos investigado si la inhibición de diferentes clases de HDAC pueden tener efectos diferenciales en las células T reguladoras. Hemos probado otros inhibidores de HDAC, incluyendo la clase I selectivo inhibidor, MGCD0103, el inhibidor de pan, panobinostat, y dos inhibidores de clase II selectivo, MC1568 y MC1575 [41]. Los esplenocitos aislados de ratones BALB /c se cultivaron con diferentes tratamientos durante 24 horas. Las dosis de los inhibidores fueron elegidos en base a estudios anteriores [41], [42]. Se recogieron las células, se tiñeron para los marcadores de superficie y Foxp3, y se sometieron a análisis FACS. Tanto los inhibidores de HDAC de clase I, entinostat y Foxp3 MGCD0103, las reguladas en células T reguladoras (Fig. 7A). Tanto entinostat y panobinostat reducen los niveles de proteína Foxp3 en la población Tregs en una forma dependiente de la dosis. selectivos inhibidores de HDAC de clase II no tienen un efecto significativo en las células T reguladoras (Fig. 7B). Estos resultados sugieren que la inhibición de la clase I, clase II HDAC no conduce a la baja regulación de Foxp3.
Se aislaron esplenocitos de ratones BALB /c y poner en cultivo con diferentes condiciones de tratamiento, como se indica por 24 horas. Se recogieron las células, se tiñeron para los marcadores de superficie y Foxp3 intracelular, y se sometieron a análisis FACS. gating trama y la indicación de parámetros se describen en la Figura 1. Los histogramas muestran la cuantificación de los niveles de Foxp3 en células T reguladoras. Una, dos inhibidores de HDAC de clase I, entinostat y MGCD0103, inhiben la expresión de Foxp3 en células T reguladoras. Al comparar con entinostat MGCD0103, se utilizó PE anticuerpo anti-Foxp3 conjugado. B, inhibidor de HDAC de clase I, entinostat, y un inhibidor de pan, panobinostat, pero no de clase II inhibidores de HDAC, MC1568 y MC1575, inhibir la expresión de Foxp3 en Tregs. Al comparar entinostat con inhibidores de HDAC de clase II y el inhibidor de pan, panobinostat, se utilizó el anticuerpo anti-Foxp3 conjugado Alexa 700 desde otros canales fluorocromo son interferidos por la autofluorescencia de los inhibidores de HDAC de clase II. ** Representa
p
. & Lt; 0,01 para el tratamiento marcada vs vehículo
Discusión
En nuestro estudio, se proporcionan pruebas de que el inhibidor de HDAC de clase I, entinostat, inhibe Tregs y potencia el efecto antitumoral de dos inmunoterapias diferentes. En el entinostat y estrategia de combinación de IL-2, tratamiento con IL-2 activa y la proliferación de Teffs promovido, sino también activado Tregs (Fig. 1).