Extracto
Antecedentes
El cáncer de páncreas es una enfermedad altamente maligno con un muy mal pronóstico. inhibidores de histona desacetilasa (HDACIs) han mostrado prometedores actividades antitumorales contra modelos preclínicos de cáncer de páncreas, ya sea solos o en combinación con agentes quimioterapéuticos. En este estudio, hemos tratado de identificar las histonas desacetilasas clínicamente relevantes (HDAC) para guiar la selección de los inhibidores de HDAC (HDACIs) adaptado para el tratamiento del cáncer de páncreas.
Metodología
HDAC expresión de cada siete líneas celulares de cáncer de páncreas y células ductales pancreáticas humanas normales epiteliales se determinó por transferencia Western. interacciones entre antitumorales por clase I y II HDACIs selectivos clase se determinaron mediante ensayos de MTT y isobolograma estándar /software de análisis CompuSyn. Los efectos de HDACIs sobre la muerte celular, la apoptosis y la progresión del ciclo celular, y la histona H4, alfa-tubulina, p21, y los niveles de γH2AX se determinaron mediante ensayos de formación de colonias, análisis de citometría de flujo, y transferencia Western, respectivamente.
resultados
La mayoría de las clases I y II HDAC se detectaron en las líneas celulares de cáncer de páncreas, aunque a niveles variables. Los tratamientos con MGCD0103 (una clase I-selectiva HDACI) dieron lugar a la detención del crecimiento dependiente de la dosis, la muerte celular /apoptosis y la detención del ciclo celular en la fase G2 /M, acompañada por la inducción de p21 y de ADN de doble filamento se rompe (DSBs). Por el contrario, MC1568 (una clase IIa selectivo HDACI) o Tubastatin A (un inhibidor selectivo HDAC6-) mostraron efectos mínimos. Cuando se combina de forma simultánea, MC1568 mejora de forma significativa la detención MGCD0103 inducida por el crecimiento, la muerte celular /apoptosis y la detención del ciclo G2 /M de células, mientras que Tubastatin Un sólo mejorado de forma sinérgica la detención del crecimiento inducido por MGCD0103. Aunque MC1568 o Tubastatin Un solo no tuvo efectos evidentes en RBC de ADN y la expresión de p21, su combinación con MGCD0103 dado como resultado la inducción cooperativa de p21 en las células.
Conclusión
Nuestros resultados sugieren que las clases I y II HDACs son posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de cáncer de páncreas. En consecuencia, el tratamiento del cáncer de páncreas con pan-HDACIs puede ser más beneficioso que los inhibidores de clase o selectivos de isoformas
Visto:. Wang G, J Él, Zhao J, Yun W, Xie C, Taub JW, et al . (2012) Clase I y II de las histonas desacetilasas de clase pueden ser objetivos terapéuticos potenciales para el tratamiento del cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (12): e52095. doi: 10.1371 /journal.pone.0052095
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Abril, 2012; Aceptado: 9 de noviembre de 2012; Publicado: December 14, 2012
Derechos de Autor © 2012 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Universidad de Jilin, Changchun, China, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31071105), y en parte por un fondo inicial del Instituto de cáncer Barbara Ann Karmanos, Escuela de Medicina de la Universidad de Wayne State Detroit , MI. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una enfermedad altamente maligno con una incidencia cada vez mayor. A pesar de ser la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los EE.UU., poca mejora en el pronóstico se ha realizado en los últimos 20 años [1] - [3]. Debido a los retrasos en el diagnóstico clínico, el cáncer de páncreas a menudo se detecta en una etapa avanzada y el pronóstico es extremadamente pobre, con una supervivencia de 4 a 6 meses [2]. Gemcitabina (2 ', 2'-difluorodesoxicitidina, dFdC) es el fármaco estándar de primera línea para el tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas avanzado [4]. Sin embargo, con una supervivencia media de 5,7 meses y la tasa de supervivencia a 1 año de 18%, su eficacia sigue siendo baja [5], [6]. Por lo tanto, el cáncer de páncreas sigue siendo una enfermedad maligna altamente quimioresistente y necesita con urgencia nuevos enfoques terapéuticos.
desacetilasas de histonas (HDAC) juegan un papel crítico en la regulación epigenética de la expresión génica por catalizar la eliminación de los grupos acetilo, estimular la condensación de la cromatina y la promoción represión transcripcional [7], [8]. HDACs comprenden un gran grupo de proteínas dividida en cuatro clases basadas en sus homologías con las HDAC de levadura, su localización subcelular y sus actividades enzimáticas [8] - [10]. Clase I comprende HDAC1, 2, 3 y 8, que son todos los homólogos de la proteína de levadura Rpd3. Se expresan de forma ubicua y localizan principalmente en el núcleo [8] - [10]. enzimas de la clase II incluyen HDAC4, 5, 6, 7, 9 y 10, que son homólogos de la proteína de levadura hda1. Estas enzimas generalmente exhiben expresión específica de tejido y de transporte entre el citoplasma y el núcleo en respuesta a las señales celulares [8], [11]. Desde HDACs 6 y 10 contienen dos sitios catalíticos, estas enzimas se designan a veces más como una subclase separada (Class IIb) a partir de las HDAC 4, 5, 7, y 9 (Clase IIa) [8], [12]. Clase III comprende los siete sirtuinas, SIRT1-7, homólogos de la proteína de levadura SIR2 [8], [13]. HDAC11 contiene residuos conservados que son compartidos por tanto de clase I y clase II enzimas y representa una clase separada de HDAC (Clase IV) [8], [10], [14].
cambios epigenéticos aberrantes son un sello distintivo de los cánceres humanos [15]. La expresión de alto HDAC1 se ha encontrado que se correlaciona con la etapa de pulmón avanzado y cáncer de páncreas [16] - [18]. Por lo tanto, las HDAC puede representar objetivos prometedores para la intervención farmacológica de cáncer. Numerosos pequeños HDACIs molécula se han desarrollado durante la década pasada [19], [20], que han mostrado prometedores actividades antitumorales contra modelos preclínicos de cáncer de páncreas, ya sea solo o en combinación con agentes quimioterapéuticos o dirigidos [16], [21] - [24]. Sin embargo, las isoformas de HDAC clínicamente relevantes en el cáncer de páncreas no se han determinado completamente. Knockout y desmontables experimentos siRNA han sugerido que la clase I HDACs son esenciales para la proliferación de células cancerosas y la supervivencia en contraste con la clase II HDACs 4 y 7 [25], [26]. Sin embargo, la inhibición de la clase IIb HDAC6 conduce a la acetilación y la interrupción de la función de chaperón de choque térmico 90 (Hsp90) en células de leucemia [27]. Aunque algunos HDACIs se considera que son pan-HDACIs (por ejemplo, LBH-589, PXD-101, y SAHA), un estudio reciente demostró que las enzimas de clase IIa no son el objetivo de la mayoría de HDACIs (por ejemplo, FK-228, LBH-589 , MGCD0103, MS-275, PXD-101, y SAHA) a concentraciones farmacológicamente relevantes [28]. Por lo tanto, aunque cada vez es más evidente que la clase I enzimas HDAC son clínicamente relevantes para el cáncer [25], [26], esto es menos establecidos para la clase II enzimas especialmente en el contexto de las HDAC de clase I.
en este estudio, hemos examinado la expresión de las clases I y II HDAC en siete líneas celulares de cáncer de páncreas y células epiteliales ductales pancreáticas humanas y determinamos sus funciones terapéuticas en las células de cáncer de páncreas mediante el uso de clases, subclass-, y HDACIs selectivos de isoformas. Nuestros resultados demuestran, por primera vez,
in vitro
sinérgicos interacciones entre antitumorales en la clase I y II HDACIs en células de cáncer de páncreas, pero no en las células ductales pancreáticas humanas epiteliales normales de clase. Aunque hay una necesidad de estudios de seguimiento en
in vivo y modelos, nuestros resultados sugieren que tanto la clase I y clase II HDAC son potenciales dianas terapéuticas para el tratamiento del cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
HDACIs
la nueva clase I-selectiva HDACI MGCD0103 (Mocetinostat) [29], y la clase IIa selectivo HDACI MC1568 [30] - [32] fueron adquiridos de Selleck Químicos LLC ( Houston, TX). El nuevo inhibidor selectivo HDAC6- Tubastatin A [33] se adquirió de Biovision Inc. (Mountain View, CA). Todos los HDACIs se disolvieron en DMSO y se almacenaron a -80 ° C, según lo recomendado por los proveedores.
Cell Cultura y
El HPAC, MIAPaCa-2, BxPC-3, PANC-1 ( derivado de tumor primario [34]), AsPC-1, CFPAC-1, y Capan-1 (derivadas de metástasis [34]) líneas celulares de cáncer de páncreas humano se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Las células normales humanos de páncreas ductal epiteliales (HPDE) se obtuvieron a partir de M. D. Anderson Cancer Center. Las líneas celulares se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS; Laboratorios Hyclone, Logan, UT) más penicilina 100 U /ml y 100 mg /ml de estreptomicina en una atmósfera humidificada 37 ° C que contiene 5% de CO
2/95% de aire.
In vitro Ensayos de citotoxicidad
in vitro citotoxicidades
HDACI de líneas celulares de cáncer de páncreas y las células HPDE se midieron mediante el uso de MTT (3- [4,5-dimetil-tiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolio bromuro, Sigma-Aldrich, St Louis , MO) reactivo, como se describe anteriormente [35], [36]. En pocas palabras, AsPC-1, BxPC-3, las células PANC-1 (ampliamente modelos de línea celular utilizada para la investigación del cáncer de páncreas), o HPDE se cultivaron en 100 l de DMEM /FBS al 10% en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron a 37 ° C en presencia de 5 concentraciones variables de MGCD0103 (0-4 M), MC1568 (0-10 mM), o Tubastatin A (0-8 M). Después de 96 h, se añadió MTT a una concentración final de 1 mM. Después de 4,5 horas, los cristales de formazán se disolvieron mediante la adición de 100 l de SDS al 10% en HCl 10 mM. Las densidades ópticas se midieron con un lector de microplacas visible a 590 nm. IC
50 valores fueron calculados como las concentraciones de fármaco necesaria para inhibir el crecimiento de 50% en comparación con células control sin tratar. Los datos para las líneas de células se presentan como medias ± error estándar de al menos 3 experimentos independientes. El grado y la dirección de MGCD0103 y MC1568 o Tubastatin A interacciones antitumorales se evaluaron mediante análisis de isobolograma estándar como se describe anteriormente [35], [37], [38], y mediante el uso del software CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ) . En pocas palabras, las interacciones medicamentosas se cuantificaron mediante la determinación del índice de combinación (IC), donde CI & lt; 1, CI = 1, y CI & gt; 1 indican, aditivos y sinérgicos efectos antagónicos, respectivamente. Los datos se presentan como medias ± error estándar de al menos 3 experimentos independientes.
ensayos de formación de colonias
Un día antes de los tratamientos HDACI, 300 PANC-1 o 500 BxPC-3 células fueron sembradas en 100 mm platos en DMEM completo o RPMI160. Las células se trataron entonces con concentraciones variables de MGCD0103 (0-1,0 M), MC1568 (0-10 mM), Tubastatin A (0-4 M), MGCD0103 más MC1568 (0,5 M 5 M), o MGCD0103 más Tubastatin A (0,5 M 2 M) durante 96 h. Después, las células se lavaron dos veces con DMEM libre de drogas o RPMI1640 y se cultivaron en DMEM completo o RPMI1640 para un máximo de 3 semanas. Las colonias se visualizaron por tinción con azul de Coomassie y se contaron. Los resultados se presentan como porcentajes medios ± errores estándar relativos a las células de control no tratados de tres experimentos independientes. Extensión y dirección de las interacciones entre MGCD0103 antitumorales y MC1568 o Tubastatin A se determinaron utilizando el software CompuSyn (ComboSyn, Inc.).
shRNA derribo de las HDAC en células PANC-1