Extracto
Antecedentes
La caquexia afecta a la mayoría de los pacientes con cáncer avanzado y se asocia con una reducción en la tolerancia al tratamiento , la respuesta a la terapia, y la duración de la supervivencia. Uno de los impedimentos hacia el tratamiento efectivo de la caquexia es un sistema de clasificación validado.
Métodos
41 pacientes con trastornos gastrointestinales resecable (GI) superior o el cáncer de páncreas se sometió a la caracterización de la caquexia basado en la pérdida de peso (WL ) y /o baja la musculatura (LM). Cuatro criterios diagnósticos se utilizaron & gt; 5% PP, & gt; 10% PP, LM, y LM + & gt; 2% SPP. Todos los pacientes fueron sometidos a biopsia del músculo recto. El análisis incluyó la inmunohistoquímica para el tamaño de fibra y el tipo, la proteína y la concentración de ácido nucleico, transferencias de Western para marcadores de autofagia, la señalización de Smad, y la inflamación.
Hallazgos
En comparación con pacientes con cáncer no caquécticos, pacientes con LM o LM + & gt; 2% WL, diámetro medio de la fibra muscular se redujo en aproximadamente 25% (p = 0,02 y p = 0,001 respectivamente). No se observó ninguna diferencia significativa en el diámetro de la fibra si los pacientes tenían WL solo. Independientemente de la clasificación, no hubo diferencia en el número o la proporción de fibra Tipo de fibra a través de todas las isoformas de cadena pesada de miosina. La media de contenido de proteína muscular se redujo y la relación de RNA /DNA disminuye en pacientes con cualquiera de & gt; 5% WL o LM + & gt; 2% WL. En comparación con los pacientes no caquécticos, los niveles de proteína Smad3 se incrementaron en pacientes con & gt; 5% WL (p = 0,022) y con & gt; 10% WL, beclin (p = 0,05) y ATG5 (p = 0,01) se incrementaron los niveles de proteína . No hubo diferencias en los niveles de fosfo-STAT3 fosfo-NFkB oa través de cualquiera de los grupos.
Conclusión
tamaño de la fibra muscular, la composición bioquímica y fenotipo vía puede variar en función de si los criterios de diagnóstico para caquexia se basa en la pérdida de peso por sí solo, una medida de bajo musculatura solo o una combinación de los dos. Para los ensayos de intervención en el que el principal punto final es un cambio en la masa o la función muscular, el uso de criterios diagnósticos combinados puede permitir la identificación de una cohorte de pacientes más homogéneos, reducir el tamaño de muestra necesario y aumentar la escala de tiempo dentro del cual se pueden realizar ensayos.
Visto: Johns N, S Hatakeyama, Stephens NA, M Degen, Degen S, Frieauff W, et al. (2014) Clasificación clínica de cáncer de caquexia: fenotípicas correlatos en el músculo esquelético humano. PLoS ONE 9 (1): e83618. doi: 10.1371 /journal.pone.0083618
Editor: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Canada |
Recibido: 2 Octubre, 2013; Aceptado: 5 Noviembre 2013; Publicado: enero 3, 2014
Derechos de Autor © 2014 Johns et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores 'recibió una pequeña subvención del Real Colegio de Cirujanos: http://www.rcsed.ac.uk/fellows-members/awards-and-grants/grants/small-research-grants.aspx. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Shinji Hatakeyama, Martin Degen, Simone Degen, Wilfried Frieauff, Christian Lambert, Ronenn Roubenoff , David Glass y Carsten Jacobi son todos los empleados de Novartis. En cuanto a los empleados de Novartis, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La caquexia por cáncer se ha definido recientemente como un síndrome multifactorial que se caracteriza por una pérdida permanente de la masa muscular esquelética (con o sin pérdida de la masa grasa) que no puede ser completamente revertido por el apoyo nutricional convencional y conduce a deterioro funcional progresiva [1]. La caquexia afecta a la mayoría de los pacientes con cáncer avanzado y se asocia con una reducción en la tolerancia a tratamiento, la respuesta a la terapia, la calidad de vida y la duración de la supervivencia. la pérdida de músculo esquelético parece ser el evento más significativo en la caquexia por cáncer y se asocia con un mal resultado [1], [2]. El consenso internacional sobre la clasificación de la caquexia por cáncer sugiere que los criterios diagnósticos deberían tener en cuenta no sólo que la pérdida de peso es un acontecimiento que marcó el proceso caquéctico, pero que la reserva inicial del paciente también debe ser considerado (ya sea un IMC bajo o de bajo nivel de musculatura). A pesar de que este último concepto tiene alguna validación en términos de riesgo clínico [2], no ha habido una evaluación de los correlatos biológicos en términos de cambios dentro del propio músculo esquelético.
músculo esquelético humano está compuesto de fibras musculares que se encuentran clasificadas en función de su velocidad de contracción y el tipo predominante de metabolismo de la energía. Las fibras musculares se pueden clasificar como de tipo I (contracción lenta) y tipo II (fibras de contracción rápida) en función de su contenido de miosina isoforma predominante de la cadena pesada (-MyHC). Generalmente, las fibras IIa Tipo I y Tipo utilizan la fosforilación oxidativa, mientras que las fibras de tipo IIx y IIb aprovechar el metabolismo anaeróbico principalmente para generar ATP. Tanto el porcentaje y la morfología estructural del tipo de fibra determinarán la capacidad fenotípica y el rendimiento funcional de cualquier músculo determinado. Los factores ambientales en la salud y la enfermedad tienen un impacto directo que producen cambios en el tipo de fibra /morfología y funcionalidad consecuente; tales procesos incluyen el envejecimiento, el ejercicio, la enfermedad crónica, y la caquexia [3] - [7]. El cambio, la conservación o la pérdida de fibras pueden influir en los síntomas clínicos y hay cierta evidencia de que todos los tipos de -MyHC se dirige selectivamente en la caquexia por cáncer [8]. la pérdida permanente de la proteína en el tejido muscular puede conducir a la contracción de las fibras musculares y una reducción del área de la sección transversal (CSA). Igualmente, la pérdida de CSA fibra muscular puede conducir a la pérdida de la capacidad aeróbica (VO
2 máx) en sujetos sanos, así como los pacientes con cáncer [5], [9].
A pesar de que la inflamación sistémica generalmente se piensa ser un importante mediador de aguas arriba de la caquexia del cáncer [10], los mecanismos moleculares precisos que median los cambios en la síntesis de proteínas y la degradación que finalmente conducen a la atrofia de las fibras musculares en la caquexia por cáncer en los seres humanos no son conocidos. Para cada modelo animal que se ha estudiado, diferentes vías han sido implicados. A partir de tales modelos animales hay una impresión predominante que el aumento de la degradación a través de la activación de la vía de la ubiquitina proteasoma (UPP) es importante [10]. Por el contrario, los datos humano es muy limitado. La activación de la degradación de proteínas a través de la UPP no ha sido un hallazgo consistente [11] [12]. Esto ha llevado a sugerir que la autofagia puede ser importante o que las vías que pueden influir tanto en la síntesis y la degradación puede ser importante (por ejemplo, la señalización de TGF-β /Smad) [13].
En el presente estudio se optó por evaluar la relación entre las diferentes definiciones caquexia, inflamación sistémica (proteína C reactiva) y las posibles vías de señalización inflamatorias dentro del músculo (fosfo-STAT3 y fosfo-NFkB). También se examinaron las asociaciones potenciales entre las diversas definiciones caquexia y la activación de las vías de señalización o la autofagia /Smad TGF-β.
El objetivo de este estudio fue investigar los cambios en la biología de las fibras musculares con respecto a la estructura morfológica y composición, para estudiar la alteración en las diversas vías que pueden dar cuenta de tamaño de la fibra alterada y relacionar estos cambios a los diferentes criterios diagnósticos que se han propuesto como parte de la reciente consenso internacional sobre la clasificación de la caquexia por cáncer [1].
Materiales y Métodos
el reclutamiento de pacientes, identificación, Consentimiento y Ética
los pacientes con enfermedad resecable y se identificaron adecuado para el estudio a través del cáncer gastrointestinal equipo multidisciplinario superior (MDT) en el Royal Infirmary, Edimburgo, Reino Unido. consentimiento por escrito se le dio antes de la entrada en el estudio. Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de ética de investigación local de NHS Lothian. El estudio se ajusta a las normas establecidas por la Declaración de Helsinki.
Cálculo de la pérdida de peso
Peso antes del mórbida fue llamado por el paciente y verifica si es posible a partir de los informes médicos. Aunque puede haber sesgos de memoria los datos que apoyan la fiabilidad de una percepción de peso y la historia de peso [14], [15] está bien documentada. pérdida de peso individual se calcula y se expresa como porcentaje del peso corporal pre-mórbida perdido
Clasificación de cáncer caquexia
La pérdida de peso & gt;. 5% durante los últimos 6 meses (en ausencia de hambre sencilla) (WL & gt; 5%)
la pérdida de peso & gt; 10% en los últimos 6 meses (en ausencia de sencilla inanición) (WL & gt; 10%)
ajustado Estatura índice de músculo esquelético consistente con baja musculatura (LM) (ver "análisis CT-imagen 'para cortes)
Estatura ajustado índice de músculo esquelético consistente con baja musculatura y cualquier grado de pérdida de peso & gt; 2% (LM + & gt; 2% WL)
músculo recto abdominal Biopsia y almacenamiento de Bioquímica Análisis
Todas las biopsias fueron tomadas en el inicio de la cirugía abdominal abierta bajo anestesia general. Los pacientes habían ayunado durante la noche antes de la cirugía. El borde del músculo recto del abdomen y se expuso a 1 cm
3 muestra extraída mediante disección aguda. La biopsia se limpió la sangre de contaminación grave. tejido obvia grasa /fibrosa se retiró antes de la colocación en un tubo criogénico y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C.
músculo recto abdominal Preparación de muestras para Cryo-Sección
0,1-0,5 cm
3 fue cortada sección del músculo. El nitrógeno líquido se usa para enfriar el disolvente isopentano en un tubo a una temperatura de ~-190 ° C. La sección del músculo se cose sobre un segmento de corcho. solución de OCT se colocó en la unión entre la base de corcho y el músculo. Después, esto se redujo con la más superior de corcho (es decir, músculo primero) en el disolvente enfriado y se mantuvo durante aproximadamente 5 minutos (hasta que el músculo fue congelado). Las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta su uso.
Análisis de Imágenes CT
Las tomografías computarizadas se utilizan para el análisis fueron realizados exclusivamente para el tratamiento del cáncer de rutina. Una imagen de TC transversal de la tercera vértebra lumbar (L3) se evaluó para cada fecha de exploración y volúmenes de tejido estimado [16]. Todas las imágenes de TC fueron analizados por un solo observador entrenado. área de sección transversal de los músculos y el tejido adiposo se normalizó para la estatura (cm
2 /m
2).
Las estimaciones de las tiendas de todo el cuerpo se generaron a partir de los datos en bruto (cm
2 ) utilizando las ecuaciones de regresión por Mourtzakis et al. [17], que muestran una estrecha correlación entre las zonas musculares y de grasa en las imágenes de TC en la tercera vértebra lumbar y compartimentos de todo el cuerpo de masa libre de grasa (FFM) y la masa grasa (FM) respectivamente.El índices respectivos para la misión y FM ( kg /m
2) se calcularon.
Los puntos de corte para la musculatura baja se basaron en un estudio de la obesidad sarcopénica con TC de pacientes con cáncer por Prado et al. (Es decir, L3 índice de músculo esquelético: ≤38.5 cm
2 /m
2 para las mujeres y ≤52.4 cm
2 /m
2 para los hombres). [18]
Las tomografías computarizadas utilizadas fueron las exploraciones de TC puesta en escena de diagnóstico de rutina que se lleva a cabo dentro de los 30 días de un diagnóstico de cáncer y todos estaban en tratamiento de pacientes naive. La mediana de tiempo para tomar una biopsia después de que el TC fue de 18 días.
La inmunohistoquímica
Las secciones congeladas musculares fueron co-tinción para laminina (L9393, Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y la miosina pesada tipo I o II bis cadena de distinguir cada tipo de fibra (BA-D5 para el tipo I, SC-71 de tipo IIa). Las secciones de parafina se tiñeron para fosfo-STAT3 (D3A7, Tecnologías de Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.) con un XT descubrimiento Ventana (grupo Roche, Tucson, EE.UU.). Las imágenes de la sección de tejido entero fueron adquiridas mediante un escáner de diapositivas VS120 (Olympus Corporation, Tokio, Japón). La distribución de los tipos de fibras de miosina de cadena pesada, el área de sección transversal de las fibras individuales en la sección, y los núcleos positivos y tinción densidad de fosfo-STAT3 fueron analizados utilizando el ASTORIA plataforma de análisis de imagen propietario (Automated Análisis de imagen almacenado) desarrollado por Novartis /Datos preclínicos sobre seguridad.
Preparación de tejidos para ADN, ARN y proteínas Extracciones
tejido muscular esquelético se troceó y se muele en hielo seco. Las alícuotas se pesaron utilizando una balanza analítica (Mettler Toledo) y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso.
ADN y ARN La extracción y la linealidad del método de extracción
ADN y ARN a partir de músculo esquelético humano tejido se extrajo y se purificó con el sistema automatizado de Maxwell 16 (Promega, Duebendorf, Suiza). Para determinar la linealidad de los métodos de extracción utilizando el Maxwell 16 sistema, el ADN y el ARN se extrajo a partir de 4 mg, 6 mg, 8 mg, y 10 mg de músculo, respectivamente. Cálculo del contenido de ADN y ARN total por peso húmedo (que en un sistema de extracción lineal debe ser igual para todas las partes alícuotas), nos permitió definir el rango lineal del sistema de extracción de Maxwell 16. Con base en estos estudios preliminares, se utilizaron partes alícuotas de 4-8 mg de tejido de músculo esquelético humano para todas las extracciones de ADN y ARN posteriores. El uso de más material de partida reducido drásticamente el contenido total de ADN y ARN por peso húmedo (datos no mostrados).
Para la extracción del ADN, se utilizó el Maxwell 16 LEV Kit DNA Blood (Promega) con un protocolo adaptado ligeramente en comparación con las instrucciones del manual. Brevemente, se añadieron 300 l de tampón de lisis de la cola del Sistema kit Miniprep (Promega) ReliaPrep ADNg de tejidos de picada y el tejido muscular esquelético humano terreno en Precellys 24 tubos de lisis del kit. El tejido se homogeneizó adicionalmente usando el homogeneizador de alto rendimiento Precellys 24, durante 10 s. Después de enfriar en hielo durante 5 minutos, 30 l de la proteína K y 5 l de la solución 1-Thiolglycerol se han añadido. Esta mezcla se incubó a 56 ° C durante 2 horas. Después, el lisado se transfirió a bien 1 del cartucho de DNA LEV Sangre, y se diluye con 300 l de agua libre de nucleasa. Para la elución, se añadieron 50 l de tampón de elución en tubos de elución. El instrumento Maxwell 16 se comenzó a usar el programa de sangre de ADN.
Para la extracción de RNA, se utilizó el LEV simplyRNA Tissue Kit Maxwell 16 (Promega), siguiendo las instrucciones del manual. Brevemente, picada y tejido humano músculo triturado se incubó en 200 l de solución de 1-Tioglicerol /homogeneización enfriado y más homogeneizada utilizando el sistema de Precellys 24 (ver ADN). Después, las muestras se calentaron a 70 ° C durante 2 min, a continuación, se dejó que las lisados se enfríe. se añadieron 200 l de tampón de lisis para el homogeneizado-down enfriado, mezclado vigorosamente, seguido de la transferencia del total de 400 l en el pozo 1 del cartucho de LEV Maxwell 16. Se añadieron 5 l de ADNasa a bien 4 del cartucho y, se añadió 50 l de agua libre de ARNasa a 0,5 ml de elución tubos y se inició el programa de extracción de ARN en el instrumento Maxwell 16.
DNA extraído y RNA se midieron espectrofotométricamente usando un instrumento DropSense Trinean (Trinean, Gentbrugge, Bélgica) para la cantidad y la calidad.
Extracciones de proteínas
para extraer las proteínas, 300 l de reactivo de extracción PhosphoSafe (Millipore) a una cantidad específica (entre 8 y 18 mg) de tejido muscular esquelético humano homogeneizado. Para homogeneizar aún más las muestras, se utilizó el sistema Precellys 24 (ver sección anterior). Después de la incubación en hielo durante 5 min, los lisados se centrifugaron a 800 xg durante 5 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos y se centrifugaron para otro 12 min a 1600 × g a 4 ° C. Los sobrenadantes se recogieron y se midieron las concentraciones de proteína usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce) con BSA como estándar. Después, se añadió cóctel inhibidor de fosfatasa (Roche) y las muestras se almacenaron a -80 ° C hasta su uso posterior.
transferencias Western
20 g de extractos de proteína de músculo esquelético humano (véase más arriba) en tampón de muestra reductor Laemmli SDS se hirvieron durante 5 min a 95 ° C y luego se separó por SDS-PAGE en geles de gradiente de 4-20% (Bio-Rad, Cressier, Suiza), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) utilizando la Trans-Blot Sistema de Transferencia de Turbo (Bio-Rad), se bloquearon durante 1 h en leche desnatada al 5% en Tris tamponada con solución salina + 0,05% de Tween-20, se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario, se enjuaga, y se incubaron durante 1 h con peroxidasa de cabra conjugado con IgG anti-conejo (1:5000) (Santa Cruz, Heidelberg, Alemania) a temperatura ambiente. Las transferencias se desarrollaron usando ECL (Roche, Rotkreuz, Suiza) o sustrato SuperSignal West Femto (Thermo Scientific, Wohlen, Suiza) y se expusieron a una película Kodak (Kodak, Rochester, NY, EE.UU.).
anticuerpos monoclonales de conejo utilizado fueron: Beclin-1 (clon D40C5), ATG5 (D1G9 clon), ATG7 (D12B11 clon), Atg12 (D88H11 clon), SMAD3 (clon C67H9), fosfo-NF
κ Francia B p65 (Ser536) ( clon 93H1) y α-tubulina (clon 11h10) (todos de Tecnologías de señalización Celular, Danvers, MA, USA), fosfo-SMAD3 (Ser423 /Ser425, clon EP823Y) (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Anticuerpos policlonales de conejo utilizados fueron:. gelsolina (Tecnologías de Señalización Celular)
Las transferencias Western se analizaron utilizando el software ImageJ densitométrica versión 1.45 (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.; http://rsbweb.nih.gov/ij) . la intensidad de banda de cada muestra se normalizó a la de α-tubulina
C -. La proteína C reactiva (CRP)
concentración de CRP en suero se midió con un ensayo automatizado immunoturbidimetric por el departamento de química clínica, enfermería Real Edimburgo, el uso de recogida de sangre de los pacientes en el momento de la contratación y antes de cualquier intervención terapéutica.
Análisis estadístico
los resultados se expresan como media (± SEM). Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante pruebas t de Student no pareada, mientras que las posibles relaciones se evaluaron utilizando correlaciones de Pearson. Los resultados se consideraron significativos los valores de p fueron menos de 0,05. El programa SPSS (versión 20, SPSS, Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó para todas las pruebas estadísticas.
Resultados
demográficos del paciente
Un total de 41 pacientes con cáncer con UGI resecable o el cáncer de páncreas fueron reclutados. En general, los pacientes eran mayores de 65 años de edad, predominantemente masculinos y habían mantenido, en promedio, 5% de pérdida de peso en comparación con los niveles previos a la enfermedad (Tabla 1). Los pacientes se agruparon en base a los conceptos del Marco Internacional de Clasificación [1] de acuerdo con la pérdida de peso o pérdida de peso en asociación con baja musculatura. Los fenotipos específicos considerados fueron la pérdida de peso & gt; 5% (WL & gt; 5%), pérdida de peso & gt; 10% (WL & gt; 10%), bajo la musculatura (LM), y LM con la pérdida de peso & gt; 2% (LM + & gt ; 2% PP). Aunque el IMC se redujo en todos los grupos clasificados como caquexia, sólo el LM y LM + & gt;. 2% de grupos WL tuvieron un índice significativamente menor masa libre de grasa (Tabla 1)
Fibra muscular tamaño, número y el tipo
Si los pacientes fueron clasificados como caquexia por LM o LM + & gt; 2% PP, tamaño de la fibra se redujo significativamente (todos los tipos de fibra miosina de cadena pesada) en comparación con los pacientes y los controles no caquécticos ( Figura 1A). La asociación de la caquexia con tamaño de fibra reducida no se observó si los pacientes se clasificaron según WL solo. secciones inmunohistoquímico representativos que demuestran diferencias en el diámetro de la fibra entre un control sano y un individuo en el grupo II frente al Grupo IV se muestran en la Figura 1B. Inmunohistología para el tipo I y IIa dio lugar a tinción complementaria en general, mientras que el tipo de fibra IIb dio lugar a muy baja intensidad de tinción según ha informado en otras partes [19]; por lo tanto, el análisis cuantitativo se realiza sólo con el tipo I y IIa, pero no con el tipo IIb (Tabla 2). Como era de esperar a partir de una disminución en el tamaño de la fibra, hubo una tendencia en todos los grupos de densidad de fibras para aumentar en los pacientes con caquexia. Sin embargo, debido a la gran variabilidad, esto no fue estadísticamente significativa. No hubo evidencia de atrofia de las fibras selectiva a través de cualquiera de los grupos de clasificación (Tabla 2).
(A) media (± SEM) de tamaño de la fibra tanto para MyHC1 y MyHCIIa. Se hace una comparación entre los pacientes con caquexia la definición propuesta ausente (gris oscuro) y los que tienen la definición propuesta caquexia presente (gris claro) para las cuatro definiciones que figuran en Métodos (I-IV). (*, P & lt; 0,05 y **, P & lt; 0,01, por test t de Student). (B) secciones inmunohistológicos de músculo para un control sano, pacientes con pérdida de peso solo (10,1%) (Grupo II), y paciente con bajo musculatura y & gt; 2% de pérdida de peso (Grupo IV). La laminina se muestra en verde, MyHC1 se muestra en rojo, y MyHCIIa se muestra en azul.
Contenido de proteínas
Los resultados para el contenido de proteína del músculo esquelético se muestran en la Figura 2 (UN). En comparación con los pacientes no caquécticos, el contenido de proteína muscular se redujo significativamente (aproximadamente 13%) en pacientes con cualquiera de & gt; 5% WL o LM + & gt; 2% WL (Figura 2A y tabla 3). Sin embargo, si se aplicaron los criterios LM solo se observó ninguna diferencia en el contenido de proteína. Además, los pacientes con & gt; 10% PP mostró una reducción del 10% en el contenido de proteína en comparación con los pacientes no caquécticos pero esta diferencia no alcanzó significación estadística (Figura 2 y la tabla 3)
Una comparación es. los ancianos con relación a la definición propuesta caquexia ausente (gris oscuro) y los que tienen la definición propuesta caquexia presente (gris claro) para las cuatro definiciones que figuran en los métodos (I-IV). (A) La media (± SEM) contenido en proteínas de peso húmedo. el contenido de ARN (B) media (± SEM). (C) La media (± SEM) el contenido de ADN. /Relación de ADN (C) media (± SEM) de ARN. (*, P & lt; 0,05 mediante la prueba t de Student)
ARN, ADN y ARN /ADN Relación
Los resultados de ADN del músculo esquelético y el contenido de ARN son también. se muestra en la Figura 2 (B, C, y D) y la tabla 3. contenido de ARN no fue significativamente diferente en pacientes caquécticos, en comparación con los pacientes no caquécticos, según cualquiera de los criterios de diagnóstico (Figura 2B y tabla 3). Por el contrario, el contenido de ADN se incrementó en un 50% con & gt; 5% WL pero disminuyó en ~ 40% en pacientes con LM (Figura 2C). La proporción de ARN /ADN se redujo (aproximadamente 30%) en pacientes con & gt; 5% PP y LM + & gt;. 2% WL (Figura 2D)
La autofagia Rutas
En los pacientes con & gt; 10% WL, Beclin y los niveles de proteína ATG5 se incrementaron significativamente en pacientes caquécticos, en comparación con los pacientes no caquécticos (Figura 3). ATG7 niveles y 12 no fueron diferentes en los pacientes caquécticos, en comparación con los no - pacientes caquécticos de acuerdo con cualquiera de los criterios de diagnóstico (Tabla 3) guía
Western blot con anticuerpos indicados, se utilizó α-tubulina como una carga. controlar. El gráfico muestra el nivel medio (± SEM) proteína representada en unidades arbitrarias (A.U). (*, P & lt; 0,05 y **, P & lt; 0,01, mediante la prueba t de Student).
SMAD Señalización:
En los pacientes con & gt; 5% los niveles de proteína WL, eran Smad3 aumentado de manera significativa en comparación con los pacientes no caquécticos (Figura 4). No hubo diferencias significativas en la fosfo-SMAD3 /SMAD3 a través de cualquiera de los grupos (Figura 4).
análisis de transferencia Western con anticuerpos indicados, se utilizó α-tubulina como control de carga. El gráfico muestra el nivel medio (± SEM) proteína representada en unidades arbitrarias (A.U). (*, P & lt; 0,05 mediante la prueba t de Student).
inflamatoria Rutas
La inflamación sistémica se estimó utilizando los niveles de CRP en suero de los pacientes (Tabla 1). Los pacientes fueron clasificados con la inflamación sistémica si su CRP fue ≥10 mg /L. No hubo diferencias en la proporción de pacientes con o sin inflamación sistémica de acuerdo con la definición de la caquexia. Los niveles de fosfo-NFkB y fosfo-STAT3 no fueron significativamente diferentes en los pacientes con o sin caquexia (utilizando cualquiera de las definiciones: tabla 4). O con o sin inflamación sistémica (Figura 5)
(A) Western el análisis de transferencia en presencia o ausencia de inflamación sistémica con anticuerpos indicados, α-tubulina se utilizó como control de carga. (B) El gráfico muestra la media (± SEM) de nivel de proteína fosfo-NF-kappa B, representada en unidades arbitrarias (A.U). (C) inmunohistoquímica Representante y el recuento de los núcleos de fosfo-STAT3 (área que se muestra es representativa de campo) de un paciente con o sin inflamación sistémica. (D) Gráfico que muestra la densidad de tinción de los núcleos fosfo-STAT3 (AU) (± SEM) en presencia o ausencia de inflamación sistémica.
Discusión
Fibra Tamaño
El criterio diagnóstico de la caquexia por cáncer mucho tiempo se ha basado en la pérdida de peso por sí sola [1] y puede reflejar la pérdida, ya sea grasa o compartimentos de tejido magro. Dado que la pérdida de tejido clave en la caquexia por cáncer se considera que es el músculo esquelético, un proceso de consenso reciente sugiere que los criterios de diagnóstico para la caquexia también deben tener en cuenta los bajos niveles de referencia de la musculatura [1]. En el presente estudio, cuando los pacientes fueron clasificados como caquéctico o no de acuerdo con la pérdida de peso ≥5% no hubo diferencia significativa en la musculatura de todo el cuerpo (FFMI) o CSA fibra muscular. Por el contrario, cuando los pacientes fueron clasificados de acuerdo a la baja la musculatura y la pérdida de peso ≥2%, FFMI se redujo y transversal de la fibra área de la sección también se redujo significativamente (Figura 1). Tales resultados demuestran que la heterogeneidad en relación con la musculatura baja y atrofia de las fibras puede ser reducido de acuerdo con la definición clínica de la caquexia. Este hallazgo puede ser importante, especialmente cuando se consideran los criterios de inclusión para los ensayos clínicos que tienen como objetivo poner a prueba la eficacia de los fármacos dirigidos a la reversión de pérdida de masa muscular en pacientes con cáncer. La reducción del tamaño de la fibra en todas las isoformas MyHC observada en el presente estudio es consistente con el animal anterior [20] y los estudios humanos de la caquexia por cáncer [4] - [7]. El músculo recto de los pacientes con caquexia por cáncer oesophago-gástrico se ha demostrado que perder todo el contenido MyHC tipo, así como someterse a una reducción en el tamaño de la fibra [4]. Igualmente, en los pacientes con cáncer de páncreas con caquexia, ambos niveles de proteína II MyHC tipo I y tipo se redujeron en un 45% en comparación con los controles [6].
Tipo de fibra
Con el fin de estudiar las diferencias en la morfología de la fibra muscular y la composición dentro de las diferentes categorías caquexia, se realizó un análisis inmunohistoquímico de muestras de músculo humano. Por eso, lo primero que estableció y validó los métodos de tinción de los anticuerpos de cadena pesada de miosina específicas para los diferentes tipos de fibras (I, IIa, IIb) y. La tinción para el tipo I y IIa fibras resultó en fuerte especificidad tinción específica, sin embargo sólo se observó tinción débil contra el tipo IIb MyHC, este hallazgo también se ha informado en otras partes [19]. Los tipos predominantes de fibra MyHC en rectus abdominis muscular son I y IIa y sólo & lt; 8% de fibras tipo IIB positivos han sido previamente descrito [21]. De las isoformas esqueléticos adultos, cada uno se expresan en diversos grados en el ratón y el músculo esquelético humano. Sin embargo, aunque MyHCIIb es altamente expresado tanto en el ARN mensajero (ARNm) y el nivel de proteína en el músculo esquelético murino, la evidencia hasta la fecha sugiere que esta isoforma está efectivamente sólo se expresa en el nivel de ARNm en un subconjunto muy pequeño de los músculos especializados en el ser humano adulto [22]. Como se mencionó anteriormente, la expresión MyHCIIb se asocia típicamente con altas fuerzas de contracción combinadas con características de rápida contráctiles y se ha sugerido que las características contráctiles de MyHCIIb pueden ser incompatibles con las restricciones biomecánicas de músculos más grandes [23], lo que puede explicar la falta de especificidad que se encuentra en el músculo recto anterior de nuestra población de pacientes.
en la caquexia hay pruebas contradictorias acerca de si hay una pérdida selectiva de los tipos de fibras. No hubo evidencia de la pérdida selectiva de tipo de fibra en el presente estudio (Tabla 2). La evidencia de modelos animales sugieren que las fibras tipo II se dirigen selectivamente [24], con la preservación relativa de las fibras de tipo I en ayunas [25], la exposición a los glucocorticoides [26], la sepsis [27] y en el músculo gemelo del modelo C26 de caquexia del cáncer [28], [29]. Modelos de caquexia cardiaca, sin embargo han sugerido una tendencia a la pérdida selectiva de las fibras de tipo I y un aumento de fibra de tipo II [30]. Además, no todos los grupos han demostrado Tipo I y II diferencias de fibra incluso en animales. De hecho, en un estudio reciente del modelo de ratón caquéctico C26, ambas fibras glucolíticas y oxidativas de (extensor largo de los dedos) EDL muscular fue sometida perder [20], mientras que en un estudio anterior utilizando el mismo modelo de ratón hubo un aumento significativo en la cantidad de MyHCIIb y una disminución significativa en la cantidad de tipo 1 MyHC en el músculo sóleo [31]. En la actualidad, sin embargo, no está del todo claro qué tipo de fibras se ven afectadas en la caquexia por cáncer humano, en pacientes con oesophago-caquexia por cáncer gástrico pérdida temprana de todas las isoformas MyHC ha informado [4].
Los patrones de actividad de un músculo también son clave en la determinación del fenotipo. Si las células musculares son reclutadas con poca frecuencia que se conviertan en unidades rápidas /glucolíticas mientras que si se reclutan más a menudo, forman unidades lentas /oxidativos. En el modelo de ratón C26 de la caquexia por cáncer, ha habido informes de conmutación de las isoformas de miosina en el músculo sóleo de ratones caquexia [31]. En pacientes con cáncer de páncreas con caquexia, no hay diferencia en la proporción de isoforma de miosina rápida /lenta se demostró en comparación con los controles [6].
ARN del músculo, ADN y proteínas contenido
En el presente estudio, en comparación con los pacientes no caquécticos, el contenido de proteína muscular se redujo significativamente (aproximadamente 13%) si los pacientes fueron clasificados como caquéctico por cualquiera de & gt; 5% WL (p = 0,015) o LM + & gt; 2% WL (p = 0,035), y en un 10% en pacientes con & gt; 10% SPP. El contenido de proteína se expresa en relación a mojar peso de músculo se ha demostrado que disminuye progresivamente (en exceso de 50%) en el músculo gastrocnemio de ratones portadores de la MAC-16 de tumor [32]. Esto sugiere que no sólo no hay pérdida de diámetro de la fibra, pero que la calidad de la fibra se altera con la pérdida de cualquiera de las proteínas sarcoplásmico o miofibrilar. Tales cambios en la composición de fibra pueden contribuir a la calidad reducida del músculo mecánico (fuerza por unidad de área de sección transversal) observada en la caquexia por cáncer humano [33].
una reducción tanto en el contenido de ARN y la actividad en el músculo esquelético ha sido atribuido a una depresión de la síntesis de proteínas en ratones que llevan el tumor MAC16 [32]. En el presente estudio, el contenido de ARN no fue modificado en pacientes caquécticos (clasificadas ya sea con & gt; 5% WL o LM + & gt; 2% PP) en comparación con los pacientes no caquécticos. Una reducción en el contenido de ARN en el músculo de los ratones que llevan el tumor ascítico de Ehrlich También se ha informado, pero esto ocurrió más tarde de la depresión observada en la tasa de síntesis de proteínas [34]. Ya sea que la síntesis de proteínas del músculo se presiona en la caquexia del cáncer humano que queda por resolver [10].
En un modelo murino de contenido de ADN caquexia por cáncer del músculo gastrocnemio se ha demostrado que permanecer relativamente constante, a pesar de la constatación de una disminución de la proteína y el contenido de RNA [32].