Extracto
Antecedentes
Claudins son proteínas de unión estrecha que están implicados en la formación de uniones estrechas y función. Estudios anteriores han demostrado que claudin-7 es frecuentemente upregulated en el cáncer epitelial de ovario (EOC), junto con claudin-3 y claudin-4. Este sentido, investigar en detalle los patrones de expresión de claudina-7, así como sus posibles funciones en EOC.
Metodología /Principales conclusiones
Un total de 95 muestras de tejido de ovario (7 ovárica normal tejidos, 65 carcinomas serosos, 11 carcinomas de células claras, 8 carcinomas endometrioide y 4 carcinomas mucinosos) fueron estudiados durante la claudina-7 expresión. En tiempo real RT-PCR análisis, el gen de la claudina-7,
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, se encontró que se upregulated en todas las muestras de tejido tumoral estudiada. Del mismo modo, el análisis inmunohistoquímico y Western Blot mostró que la proteína claudin-7 se sobreexpresa significativamente en la gran mayoría de los EOC. Interferente pequeño knockdown RNA mediada de claudin-7 en células de cáncer de ovario condujo a cambios significativos en la expresión génica, medida por microarrays y validado por RT-PCR e inmunotransferencia. Los análisis de los genes expresados diferencialmente revelaron que los genes alterados en respuesta a claudin-7 desmontables se asociaron con vías implicadas en diversas funciones celulares y moleculares, tales como ciclo celular, el crecimiento celular y la proliferación, la muerte celular, el desarrollo, y el movimiento celular. A través de experimentos funcionales in vitro, se encontró que tanto la migración y la invasión fueron alterados en las células donde
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habían sido derribados o sobreexpresados. Curiosamente, la expresión de claudina-7 se asoció con un aumento neto de la invasión, sino también con una disminución de la migración.
Conclusión /Importancia
Nuestro trabajo demuestra que la claudina-7 es aumentada significativamente en EOC y que puede ser funcionalmente implicado en la invasión de carcinoma de ovario.
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por lo tanto, puede representar marcador potencial para la detección del cáncer de ovario y un objetivo para la terapia
Visto:. Dahiya N, Becker KG, Madera, WH III, Zhang Y, Morin PJ (2011) Claudín -7 frecuentes se sobreexpresa en el cáncer ovárico y promueve la invasión. PLoS ONE 6 (7): e22119. doi: 10.1371 /journal.pone.0022119
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de diciembre de 2010; Aceptado: June 16, 2011; Publicado: 15 Julio, 2011
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Esta investigación fue financiada en su totalidad por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la sexta causa principal de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo [1]. El cáncer de ovario suele ser diagnosticada como enfermedad avanzada cuando las opciones terapéuticas son limitadas y el pronóstico muy pobre. Los últimos años han sido testigos de una serie de avances en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la progresión del cáncer de ovario [2], [3], aunque gran parte de los detalles siguen siendo desconocidos. Entre los genes cuya expresión se altera frecuentemente en cáncer de ovario son los que codifican la familia claudin de las proteínas de unión estrecha [4] - [7]. Claudins forman la columna vertebral de TJs y son, por tanto, esencial en la compartimentación epitelial y en el control de la transferencia de solutos a través de monocapas de células [8] - [10]
En el cáncer, la función TJ normal y la estructura normalmente se alteran y los propios TJs. se desmontan con frecuencia [11], [12]. la expresión génica recientes estudios de perfiles han informado de la expresión alterada de un número de proteínas TJ en múltiples tipos de cáncer, incluyendo varias proteínas claudin [4], [6]. Por ejemplo, claudina-3 y claudin-4 se encuentra elevado en los cánceres de ovario, de próstata, uterino y de mama, mientras que la claudina-1 se reduce en los cánceres de mama y próstata.
Claudín-7 se ha encontrado downregulated en varios cánceres incluyendo el cáncer de próstata [16] de esófago [13], [14], de cabeza y cuello [15] y. La pérdida de claudin-7 se correlacionó con la desdiferenciación en varios cánceres diferentes [16] - [19]. En el cáncer de mama, también se encontró claudin-7 expresión a ser disminuido e inversamente correlacionado con el grado del tumor y de la enfermedad metastásica [17], [18], aunque existe evidencia de que claudin-7 puede llegar a ser re-expresa en metástasis [20], [21]. Por lo tanto, se ha sugerido que la pérdida de claudin-7 se asocia con una pérdida de la adhesión celular y el aumento de metástasis [14], [17]. Sin embargo, claudin-7 también se ha demostrado ser elevados en varios tipos de cáncer. Por ejemplo, se conoce claudin-7 a ser elevados en el cáncer de ovario [22] - [27], así como otros tumores malignos [28], [29]. La razón de los diferentes patrones de los cambios observados en los diferentes tipos de cáncer es actualmente desconocida, pero puede estar relacionado con el papel exacto de la claudina-7 en diferentes tumores malignos, por lo que el esclarecimiento de estos papeles un objetivo importante.
En este informe , evaluamos primero claudin-7 niveles de expresión en muestras de tejido de ovario y líneas celulares utilizando el Western Blot, RT-PCR, y la inmunohistoquímica y encontramos que claudin-7 se expresa ampliamente en los tumores de ovario. El uso de microarrays, encontramos que muchos genes son expresados diferencialmente siguiente
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caída y el análisis de estos genes sugiere varias vías por las que
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puede funcionar en el cáncer de ovario. Se demuestra que
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cables desmontables a una disminución de la fosfo-Erk y un aumento en los niveles de Raf-1, lo que sugiere una posible vía para claudin-7 de señalización en el cáncer de ovario. Además, nos encontramos con que
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expresión se asocia con aumento de la invasión, pero la disminución de la migración en múltiples líneas celulares que proporciona un vínculo funcional a
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expresión en el carcinoma de ovario.
resultados
CLDN7 Versión taquigráfica y los niveles de proteína son elevados en tejidos de cáncer de ovario
Un trabajo reciente muestra que, además de la
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y
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genes,
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se eleva con frecuencia en el cáncer de ovario [22] - [26], [30]. Con el fin de definir claramente el
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patrones de expresión en el cáncer de ovario, tumores de ovario microdisecado de varios subtipos, así como líneas celulares fueron analizados por tiempo real RT-PCR.
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ARNm se encontró que era altamente regulados hasta en los cuatro principales subtipos de cáncer de ovario (es decir seroso, mucinoso, de células claras y endometrioide) en comparación con los tejidos ováricos normales (Figura 1A). El nivel de sobreexpresión varió enormemente y se encontró que era en cualquier lugar de 2 veces a 50.000 veces. De hecho, se observó aumento de 2 veces sobre la manguera-B en 2 de los controles normales de ovario mientras que la sobreexpresión de 50.000 veces se ha visto en 3 tejidos de cáncer de ovario seroso.
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se distribuye ampliamente en los tejidos humanos normales y su transcrito se encontró en niveles relativamente altos en el riñón, colon, pulmón, intestino delgado, testículo, placenta, glándula salival, tiroides, glándula adrenal, páncreas, próstata, hígado , estómago, ovario y piel (Figura 1B). Por otro lado, músculo, cerebro, corazón, bazo, útero, leucocitos de la sangre, la médula ósea, cerebro fetal, e hígado fetal expresan niveles más bajos de
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mRNA.
A. Los subtipos de carcinoma de ovario indicados se ensayaron para
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expresión por RT-PCR y los niveles se muestran en relación con las células TUBO-B (una línea de células epiteliales de la superficie del ovario inmortalizado con E6 y E7 [52]). B.
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expresión en tejidos normales. Se analizaron los siguientes tejidos: 1, Músculo; 2, cerebro; 3, del corazón; 4, del riñón; 5, bazo; 6, hígado; 7, de colon; 8, de pulmón; 9, el intestino delgado; 10, de estómago; 11, Testículos; 12, Placenta; 13, salival; 14, de la tiroides; 15, la glándula suprarrenal, 16, Páncreas; 17, Útero; 18, ovario; 19, Próstata; 20, piel; 21, plasma leucocitos de la sangre; 22, Médula ósea; 23, cerebro fetal; 24, de hígado fetal. Los niveles se muestran en relación con el músculo y los tejidos con mayores niveles de 4 veces se indican en el gráfico. C. El análisis por inmunotransferencia de claudin-7 expresión en tejidos normales 2 ováricos (N1 y N2), 7 serosa (S1, S2, S3, S4, S5, S6, y S7), uno de células claras (C1) y una endometrioide (E1 carcinomas de ovario). Un total de 29 muestras fueron analizadas por inmunotransferencia y se muestran ejemplos representativos. D. La inmunohistoquímica de carcinomas de ovario seroso. se muestran los carcinomas de ovario seleccionados (S3, S4, S5, S6) y una muestra de ovario normal (N). muestras de cáncer de ovario teñidas con anticuerpos claudin-7 (Cl-7) tienen una fuerte tinción en comparación con los controles negativos que carecen de tinción de anticuerpo primario (-).
Con el fin de investigar la claudina-7 niveles de proteína en el cáncer de ovario , un panel de 29 muestras primarias de cáncer de ovario, así como 4 tejidos ováricos normales se estudió mediante inmunotransferencia (Figura 1C, el cuadro S1). Claudin-7 estaba ausente en todos los tejidos ováricos normales, pero se encuentra en altos niveles /moderados en 66% (19/29) de las muestras de cáncer. Se encontró claudina-7 se expresa en niveles bajos en el 24% (7/29) de los casos, y no era detectable en el 10% (3/29).
La inmunohistoquímica (IHC) experimentos confirmaron que la claudina-7 se expresó a niveles elevados en el cáncer de ovario (Figura 1D). El estudio demostró que la IHC claudin-7 sobreexpresión estaba restringida a las células cancerosas y no implican el estroma. Además, mientras que ciertos tumores mostraron tinción de membrana significativa (S3 y S4), otros demostraron una reducción de la tinción en la membrana y altos niveles de tinción citoplásmica.
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es elevada en líneas celulares de cáncer de ovario y puede ser localizado en la membrana o en el citoplasma
a fin de evaluar
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expresión en líneas celulares, 7 líneas de células se evaluó mediante RT-PCR e inmunotransferencia (Figura 2A, B) . El
CLDN7 Versión taquigráfica no se detectó en la línea de no maligno epitelio superficial MANGUERA-B, pero se encontró en todas las líneas celulares de cáncer de ovario, excepto UCI101 y OVCA432 (Figura 2A). Del mismo modo, la proteína claudin-7 no se detectó en la manguera-B, pero estaba presente en líneas celulares de cáncer de ovario más (pero no en HEY y UCI101) (Figura 2B). Curiosamente, las células HEY mostraron niveles
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ARNm alto, pero bajos niveles de proteína, mientras que OVCA432 exhibió muy baja
CLDN7 Versión taquigráfica niveles, pero de alta claudina-7 expresión de la proteína. Estos datos muestran que mientras claudin-7 transcripción se retiene en las líneas celulares, claudin-7 niveles de proteína pueden ser regulados a través de mecanismos de post-transcripcional.
A. Claudina-7 inmunotransferencia revela altos niveles de expresión en las líneas celulares de cáncer de ovario indicados. B. Análisis de RT-PCR de
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ARNm en las líneas celulares. C. Inmunofluorescencia de líneas celulares de cáncer seleccionados muestra una fuerte expresión claudin-7 en la unión de células en BG-1, OVCA433, OVCA420 y OVCA432, así como punctuate tinción citoplásmica en BG-1 y OVCA420. se detectó claudin-7 con un anticuerpo anti-claudin-7 y se visualizó con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor. Los núcleos de las células se counterstained con DAPI. Las imágenes se fusionaron para determinar la localización correcta.
Uso de inmunofluorescencia, se encontró claudin-7 tinción localizada predominantemente en la membrana celular, con tinción punteada en el citoplasma de líneas celulares de cáncer de ovario BG-1, y OVCA420 OVCA433 (Figura 2C). En OVCA432, también se observó tinción de membrana, pero poca expresión en el citoplasma.
cambios de expresión génica después de
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caída en las células de cáncer de ovario
Para investigar las posibles funciones de
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en cáncer de ovario, se examinaron los cambios de expresión génica siguientes
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caída. Estos desmontables experimentos se realizaron en líneas de células OVCAR-2 y OVCA420, ambos de los cuales presentan niveles endógenos moderadas de claudin-7 expresión (Figura 3A).
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tratamiento siRNA dado lugar a una reducción significativa de la proteína claudin-7 72 horas después de la transfección (Figura 3A) y este punto de tiempo fue elegido para el análisis de microarrays. En las células OVCAR-2, que forman TJs en cultivo,
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cables desmontables a una disminución de la resistencia transepitelial (TER, una medida de la estanqueidad TJ) y un aumento concomitante de la permeabilidad a través de la monocapa (Figura 3B). Esto demuestra que
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caída tiene un efecto funcional sobre TJ en estas células. En OVCA420 células, que no forman TJ en la cultura, TER era extremadamente baja y no se vio afectado por
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desmontables (Figura 3B). En consonancia con este hallazgo, la permeabilidad también se vio afectada por
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caída.
A. El análisis por inmunotransferencia de OVCAR-2 y OVCA420 células después de
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caída durante 72 horas. B. Efectos de
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caída sobre el TJ y permeabilidad. la resistencia transepitelial (TER) se midió en varios puntos de tiempo después de
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caída. La permeabilidad se midió mediante la evaluación de la capacidad de isotiocianato de fluoresceína-dextrano (40 kDa) para cruzar la monocapa. Las medidas de fluorescencia reflejan la permeabilidad monocapa y los resultados reflejan las mediciones TER. Los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se muestran como media +/- S.E.M. Un asterisco (*) indica un valor de p & lt; 0,05, y un asterisco doble (**), un valor de p & lt; 0,01. C. análisis de agrupación jerárquica de la expresión génica después de
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caída en ambas líneas celulares. El color verde representa la regulación a la baja, mientras que el rojo representa la regulación. Se identificaron un total de 20 grupos de genes que muestran patrones distintos.
Se utilizó el análisis de microarrays para investigar los efectos de
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caída en la expresión génica, tanto en OVCAR-2 y células OVCA420 líneas. La agrupación de análisis demostró varios patrones de cambios siguientes
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desmontables y estos patrones fueron representados por 20 diferentes grupos de genes identificados por el agrupamiento no supervisado patrón utilizando el software JMP (Figura 3C).
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era el único gen en el grupo 3 y, como era de esperar, fue altamente regulados a la baja en ambas líneas celulares. De los 1327 genes expresados diferencialmente en las dos líneas (Tabla S2), 297 (200 upregulated y downregulated 97) fueron compartidos por OVCAR-2 y OVCA420 (Figura 4). Esto representa un solapamiento de 23% de todos los genes expresados diferencialmente, una cifra mucho más alta que la esperada por azar (p & lt; 0,001). En OVCAR-2, un total de 553 genes se upregulated y 415 se downregulated y en OVCA420, se upregulated 404 genes y 252 se downregulated. Los 20 genes regulados y las reguladas en cada línea celular (así como en ambos a la vez) se enumeran en la Figura 4.
En el diagrama de Venn, los números en rojo representan genes regulados y los números en verde representan los genes regulados negativamente. Los 20 genes en cada categoría se indican en la tabla a continuación el diagrama de Venn.
Para validar y ampliar los datos de microarrays, 15 genes que se han alterado significativamente por
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caída en líneas de uno o ambos de células, se eligieron para la validación mediante análisis de RT-PCR (Figura 5). Mientras que la expresión veces parecía estar subestimado por el análisis de microarrays, PCR en tiempo real confirmó las tendencias para todos los genes analizados (Figura 5A, B). Además, los niveles de proteína para varios de estos genes (
CA12
,
RRAS2
,
PRSS8
,
APOE
,
AGT
,
SPRR3
, y
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) se pusieron a prueba en diferentes puntos de tiempo tras la
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desmontables (Figura 5C). Los resultados de estos experimentos fueron consistentes con los cambios observados mediante RT-PCR. En general, nuestros datos muestran una excelente correlación entre los cambios detectados por microarrays y los correspondientes niveles de expresión de proteínas.
A. Doblar los cambios de los diversos genes indicados en OVCA420 y células OVCAR-2 siguientes
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caída. validación B. RT-PCR de los genes que se muestran en (A). C. Análisis de inmunotransferencia de los candidatos seleccionados en varios puntos de tiempo tras la
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caída. control de GAPDH se incluye para confirmar carga similar en todos los carriles.
Pathway análisis
El uso de Ingenuity Pathway Analysis (IPA), se analizaron las vías y las posibles funciones asociadas con los cambios de expresión génica después de
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caída. Muchos de los mejores redes identificadas cáncer implicado, el crecimiento y la proliferación celular, pero que no estaban claramente conservadas entre las líneas celulares (Tabla S3). Curiosamente, "integrina señalización" fue encontrado en dos líneas celulares entre las vías canónicas más significativos identificados (Tabla S3). Las principales funciones biológicas incluyen una variedad de funciones tales como el crecimiento celular y la muerte celular, y de manera interesante, el movimiento celular. Los sistemas fisiológicos identificados incluyeron respuesta hematológica e inmune, así como el desarrollo de tejido conectivo (Tabla S3). el análisis de genes ontología de genes alterados identificados categorías significativas tales como "actividad estructural molécula", "actividad transductor de señales", "regulador de la actividad de transcripción", "regulador de la actividad de traducción" y "la actividad de transporte" (Tabla S4).
las posibles relaciones funcionales entre los diferentes genes expresados diferencialmente se determinaron luego usando una variedad de enfoques. Los 5 KEGG vías comunes más significativos (según lo determinado por Webgestalt) eran "regulación del citoesqueleto de actina", "adhesión focal", "vía de señalización MAPK", y "vía de señalización de insulina". Tabla S5 lista de todas las vías identificadas. Los genes superiores de las 5 vías más importantes mencionados anteriormente se utilizaron para buscar la base de datos Camino Estudio de conocidas las interacciones proteína-proteína (Figura 6A). Tabla S6 se enumeran los detalles de interacción proteína-proteína y sus referencias correspondientes. Curiosamente una de las vías más importantes identificados a través de este enfoque fue la vía RAS-RAF-MAPK (Figura 6A). Luego estudió esta vía en OVCA420 células mediante el examen de Erk y Raf-1 de expresión y la fosforilación en estas células (Figura 6B). Claudin-7 desmontables condujo a un aumento en fosforilados Raf-1 (Ser-338) que se refleja por un aumento en total Raf-1 en cada punto de tiempo, lo que sugiere que, efectivamente, esta vía podría verse afectada por claudin-7. /2 niveles de ERK1 no fueron afectados por la claudina-7 desmontables, pero fosforilada Erk mostraron una ligera disminución, especialmente en puntos de tiempo posteriores.
A. análisis de vías de estudio. se muestran las interacciones directas de 33 upregulated significativamente (flecha hacia arriba) o roja (flechas hacia abajo verde) los genes regulados negativamente. La leyenda de los diferentes tipos de interacciones A continuación se muestra el mapa. B. Análisis de inmunotransferencia de ERK1 /2, fosfato ERK1 /2 (p-ERK) y Raf-1 y fosfo-Raf (Ser-338) en OVCA420 en los puntos de tiempo indicados después de
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caída.
Claudín-7 expresión de la proteína se asocia con la invasión de células, pero inversamente correlacionada con la migración
Debido a que nuestro análisis del gen anterior revela el movimiento celular como una función posiblemente afectados por
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, decidimos probar las posibles funciones de
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en la migración celular y la invasión de cáncer de ovario. Se realizó primero transitoria knockdown siRNA mediada de
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expresión en dos líneas celulares de cáncer de ovario (OVCAR-2 y OVCA420) y la migración a prueba usando el ensayo de migración de células Oris.
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caída condujo a un aumento reproducible en la migración celular en ambas líneas celulares en cada punto de tiempo de prueba (Figura 7A). a continuación, se evaluó la invasión de células usando un ensayo de cámara de Boyden y, como se muestra en la figura 7B, la inhibición de claudin-7 expresión en OVCAR-2 y OVCA420 células redujo significativamente el potencial invasivo de estas células. Para confirmar aún más el papel de claudin-7 en la invasión, claudin-7 se sobreexpresa en OV-90 células (que carecen de endógeno expresión claudin-7) y se encontró que la sobreexpresión estable de esta proteína condujo a un aumento de invasión en comparación con las células transfectadas de manera simulada o parental OV-90 células (Figura 7C).
A. ensayos de migración de células OVCAR-2 y OVCA420. La migración de las células con
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derribado (barras oscuras) o células de control (barras blancas) se midió a diferentes puntos de tiempo después del comienzo del ensayo. B. Boyden cámara de ensayo de invasión de OVCAR-2 y OVCA420 células con y sin
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caída. El número de células invasoras se midió cada hora durante 6 horas. C. ensayos de invasión en un modelo de
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sobreexpresión. Dos líneas estables, OV90-CLDN7 y OV90-CINEO, así como las células parentales no transfectadas OV90 se utilizaron para probar cambios en la invasión siguientes
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sobreexpresión. Para todos los resultados que se muestran en esta figura, los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se muestran como media +/- S.E.M. Un asterisco (*) indica un valor de p & lt; 0,05, y un asterisco doble (**), un valor de p. & Lt; 0,01
Discusión
Nuestros datos muestran que
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es elevado, tanto en los niveles de proteína ARNm y en la mayoría de los tejidos de cáncer de ovario y líneas celulares. Por el oeste de análisis, los tejidos tumorales de ovario primarios mostraron una expresión variable de claudina-7 que va desde moderada a alta expresión en el 66%, bajo en el 24%, e indetectable en muestras de tejido tumoral de 10%. La razón de esta variabilidad es clara, ya que sigue siendo en gran parte desconocida la regulación transcripcional de
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. Curiosamente, la hipermetilación ha estar implicado en la regulación a la baja de
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expresión en el cáncer de mama [17] y dos factores de transcripción, Tcf-4 y Sox9, se ha demostrado que cooperar en
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represión en células de colon [31]. Se desconoce si estos mecanismos están implicados en
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regulación en el cáncer de ovario, pero estas posibilidades están actualmente bajo investigación.
Nos encontramos con que
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es elevado en todos los principales subtipos de cáncer de ovario: seroso, endometrioide, de células claras y mucinoso. Estos resultados son consistentes con los datos anteriores de microarrays [22], [26] y los experimentos de IHC [27], [30] que muestran que CLDN7 típicamente se sobreexpresa en el cáncer de ovario epitelial. De hecho, un estudio inicial mostró que claudin-7 se sobreexpresa en todos los subtipos de cáncer epitelial de ovario, pero no se overexpresssed en los cordones sexuales y tumores del estroma [23]. Por otra parte, un análisis detallado por Tassi et al. [24] ha demostrado que
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es universalmente hasta reguladas en el cáncer epitelial de ovario, tanto a nivel de ARNm y proteínas. Nuestro estudio también demuestra sobreexpresión en los subtipos de cáncer de ovario epitelial más comunes (serosa, de células claras, endometrioide y mucinoso) tanto en el mRNA y los niveles de proteína utilizando QRT-PCR, IHC, e inmunotransferencia. El uso de inmunotransferencia y QRT-PCR nos permite demostrar que los niveles de ARNm y los niveles de proteína no siempre se correlacionan, lo que sugiere la regulación post-traduccional de claudin-7 en el cáncer de ovario.
Curiosamente, mientras que se encontró que la mayoría claudin -7 tinción se localiza en la membrana, varias muestras de cáncer de ovario exhibieron una fuerte tinción citoplásmica (Figura 1D). El hecho de que las proteínas claudin se pueden encontrar en el citoplasma se ha informado y, en particular, tinción citoplásmica punteada de claudin-7 se ha observado en el cáncer de ovario [24]. Los mecanismos y las causas de la claudina localización citoplasmática siguen sin estar claros, pero varias líneas de evidencia sugieren que la fosforilación de claudinas puede afectar a su localización. Por ejemplo, la mutación de un sitio de fosforilación PKA en claudin-3 se ha demostrado que conducen a un aumento de la localización citoplasmática en el cáncer de ovario [32]. Del mismo modo, se encontró claudin-4 para ser fosforilado por la proteína quinasa C y se encontró que esta fosforilación para dar lugar a la translocación de claudin-4 desde la membrana hasta el citoplasma y una disminución de la función TJ [32]. también se conocen proteínas claudin ser regulada por palmitoylation, como claudin-14 palmitoylation ha demostrado ser crucial para su correcta localización [33]. Actualmente no está claro si la claudina-7 puede ser modificado y si las modificaciones pueden afectar a su localización.
La sobreexpresión de claudinas en el cáncer sugiere que claudinas podrían tener papeles funcionales en la tumorigénesis. Varios grupos han estudiado las posibles funciones de la claudina-7 en el cáncer. Claudin-7 se ha sugerido que participan en la regulación de antígeno específico de la próstata (PSA) [34], posiblemente a través de la interacción con la molécula de adhesión de la unión A (JAM-A) [35]. Claudin-7 también se ha descrito la formación de un complejo con EpCAM-tetraspanin que interfiere con las propiedades de adhesión celular mediada por EpCAM y aumenta la resistencia a la apoptosis [36] - [38]. De hecho, en el carcinoma colorrectal, EpCAM y claudina-7 se encuentran en asociación con el tetraspanins CD9 y /o CO-029 y promueven la formación de metástasis [37]. Además, EpCAM-
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complejo se sugiere tener papel en la migración, proliferación, la resistencia a la apoptosis, metástasis y la tumorigenicidad [37], [39].
Al tratar de reunir pistas adicionales con respecto
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función en el cáncer de ovario, que investigó los cambios de expresión génica siguientes
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caída. La hipótesis de que la regulación por disminución de
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puede afectar las vías descendentes afectadas por esta proteína y en última instancia conducir a cambios en la expresión de los genes regulados por estas vías. Entre las dos líneas celulares de cáncer de ovario estudiados, se identificaron un total de 1296 genes que se han alterado significativamente después de
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caída. Entre estos genes, 297 al mismo tiempo se encontraron expresados diferencialmente en ambas líneas. El análisis de estos genes utilizando Ingenuity Pathway Analysis, condujo a la identificación de varias redes de genes que contienen los genes relacionados con las categorías funcionales "cáncer", "muerte celular", "ciclo celular", "tráfico de ARN", "desarrollo celular", "célula señalización "," el crecimiento celular y la proliferación ", y" movimiento celular ". De la Enciclopedia de Kyoto de genes y el análisis de la vía Genomas (KEGG), se seleccionaron los 5 mejores vías que se han alterado en ambas líneas celulares OVCAR-2 y OVCA420 y generó un mapa de la red de interacción proteína-proteína de estas vías. El uso de la vía de estudio, encontramos interacciones directas entre 33 genes regulados positivamente o regulación a la baja de manera significativa (Tabla S6). La red de interacción mostró un número de genes que tienen funciones supresoras oncogénicos o tumorales. Por ejemplo, RRAS2, que codifican una GTPasa relacionadas con Ras con la transformación de potencial similar a H-, K- y N-Ras, es un oncogén conocido y ha sido implicado en la patogénesis del cáncer humano. Las vías que median la tumorigénesis inducida por RRAS2 no están bien establecidos, pero phosphoinositide 3-quinasa, p38 MAPK, y mTOR vías han sido implicados [40]. De particular interés, RRAS2 y RRAS se ha demostrado que promover la invasión a través de la señalización de la integrina en las células epiteliales de mama [41].
Hemos demostrado previamente que las células epiteliales de ovario que expresan la claudina-3 y -4 muestran un aumento de invasión
in vitro
[42], que fue mediado a través de la sobreexpresión de MMP-2. Del mismo modo, en las células de carcinoma hepatocelular, claudina-10 expresión promueve la supervivencia celular, la motilidad y la invasión, mientras que las metaloproteinasas de matriz 2 (MMP-2) fue hasta reguladas [43]. Sin embargo claudins También se ha demostrado para reducir la invasión como claudin-4 expresión se asoció con una reducción en la capacidad de invasión en las células de cáncer de páncreas [44]. La reducción de expresión de claudin-7 se ha correlacionado con la invasión tumoral y metástasis en el carcinoma de células escamosas del esófago y en el cáncer de colon [13], [45]. En este estudio se encontró que
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caída dio lugar a cambios en la expresión de genes asociados con diversas funciones, como la migración /invasión. En particular, el seguimiento de los resultados del análisis de la vía, hemos demostrado que Raf-1, un gen previamente implicado en la migración celular [46], [47], es regulada hasta después de
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desmontables (Figura 6) . Erk-1 no se halló significativamente elevado en estas condiciones, lo que sugiere que la Raf-1 puede ser una señal a través de otras vías descendentes en respuesta a
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caída.
En base a los datos de expresión, que luego investigó las posibles funciones de
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y encontraron efectos sobre la invasión y la migración
in vitro
. De hecho, la capacidad de invasión se redujo significativamente después de
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desmontables y, por el contrario, se encontró aumentado después de la sobreexpresión de
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. Curiosamente, se encontró que la migración a incrementarse después de
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desmontables (posiblemente debido a un aumento de la Raf-1), y estos resultados aparentemente contradictorios (vs la invasión de migración) puede explicar las observaciones anteriores en el campo. De hecho, el papel exacto de la claudina sobre la invasión han mantenido controvertido, ya que algunos investigadores observan efectos positivos de claudinas sobre la invasión y otros han encontrado lo contrario. Dado que las proteínas claudin se sabe que activar MMP [42], [48], sino que también tienen un papel en la adhesión célula-célula [9] y en la migración (como se muestra aquí), el efecto neto observado puede representar el resultado de estos efectos opuestos sobre el invasión. Nuestros datos sugieren que mientras que
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sobreexpresión puede disminuir la migración, el aumento de la invasión debido a otros factores (como el aumento de la activación de MMP) es dominante y conduce a un efecto neto positivo sobre la invasión de células en nuestro sistema. Los mecanismos exactos de
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papeles en la migración celular y la invasión están bajo investigación, pero nuestros datos pueden explicar algunas de las discrepancias en la literatura.
En resumen, nos encontramos con que
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es elevada en la gran mayoría de los cánceres de ovario. Se realizó el análisis de microarrays para identificar los cambios en la expresión de genes asociados con
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caída en el cáncer de ovario. Curiosamente, se encontró que muchos genes y las vías afectadas por
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expresión están implicados en la supervivencia de células de cáncer, el crecimiento, y la invasión. ensayos de invasión y migración demostraron efectos claros de la claudina-7 sobre el comportamiento invasivo de las células de cáncer de ovario. Nuestro análisis de microarrays ofrece varios mecanismos posibles por los cuales claudina-7 puede afectar a la migración celular y la invasión, y se están investigando actualmente estos mecanismos diferentes. Además de su función de unión estrecha, claudin-7 puede jugar un papel importante en un número de vías de señalización implicados en el cáncer, el crecimiento celular, la proliferación, y el ciclo celular. Dado su importante papel en la carcinogénesis de ovario,
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pueden tener un potencial significativo en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todo humana los tejidos se recogieron a través de un protocolo aprobado IRB (MedStar Research Institute IRB#2003-103). Los tejidos se recogieron de forma anónima y este protocolo fue exentos del requisito de consentimiento.
Líneas celulares y muestras de tejidos
líneas de cáncer de ovario utilizados en este estudio, BG-1, UCI-101, HEY, OV90, OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR-2, OVCAR-3, OVCAR-5 y se han publicado [49] - [51]. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.