Extracto
En un estudio anterior, se había desarrollado un sistema de administración magnética termosensible novela basada en liposomas. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia de este sistema para la co-administración de ambos fármacos y genes de la misma célula y sus efectos anti-tumorales en cáncer gástrico. La doxorrubicina (DOX) y vector SATB1 shRNA fueron cargados en el sistema de co-parto, y en la actividad de liberación termosensible vitro DOX, gen objetivo silenciar la eficiencia, la captación celular específica, se determinó la citotoxicidad in vitro, así como la actividad anti-tumor in vivo. Los resultados mostraron que este sistema de co-administración tuvo una eficacia deseable dirigida envío, liberación termosensible DOX y SATB1 silenciamiento génico. Además, la co-administración de DOX y SATB1 shRNA exhibieron mejorada actividad para inhibir el crecimiento de células de cáncer gástrico in vitro e in vivo, en comparación con la entrega individual. En conclusión, el novedoso sistema magnético y drogas gen co-administración termosensible tiene una aplicación prometedora en una combinación de quimioterapia y la terapia génica para el cáncer gástrico
Visto:. Peng Z, Wang C, Fang E, X Lu, Wang G, Tong Q (2014) Co-administración de doxorrubicina y SATB1 shRNA por termosensitiva magnética catiónicos Los liposomas para la terapia del cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10.1371 /journal.pone.0092924
Editor: Elena A. Rozhkova, Laboratorio Nacional de Argonne, Estados Unidos de América
Recibido: 4 de diciembre de 2013; Aceptado: February 26, 2014; Publicado: 27 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81172186). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto tipo de cáncer común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. En 2008, había aproximadamente 989.000 nuevos casos de cáncer gástrico y 738.000 muertes en el mundo que se ha producido principalmente en el Este, Sur y Asia Central; Europa central y oriental; y América del Sur [2], [3]. En China, el cáncer gástrico es el tercer tipo de cáncer común con un estimado de 380.000 nuevos casos y una tasa de mortalidad más alta sobre el 26,3 por 100.000 habitantes cada año [4], [5]. La resección quirúrgica es la opción curativa común, pero no es adecuado para la mayoría de pacientes que están en la fase crónica de cáncer gástrico. Otras terapias tales como la radioterapia y la quimioterapia muestran alguna eficacia, pero son a menudo insatisfactorios [4], [6]. Además, la administración sistémica de la quimioterapia causa efectos adversos [7], [8].
Debido al desarrollo de resistencia a los medicamentos a la quimioterapia, la quimioterapia tradicional también ha exhibido eficacia anti-tumor limitado [9]. Por lo tanto, el sistema de co-entrega multi-agente ha ganado más atención recientemente, ya que podría ofrecer diferentes tipos de agentes a las mismas células tumorales que a continuación, muestran efectos antitumorales sinérgicos. Por ejemplo, dos agentes químicos diferentes se pueden combinar o un agente químico se pueden combinar con pequeños ARN de interferencia (siRNA) en contra de un oncogén. Por otra parte, la administración dirigida y liberación controlada de fármacos pueden mejorar aún más los efectos anti-tumorales y reducir los efectos adversos.
especial rica en AT proteína de unión (SATB1) es un organizador de la cromatina global que regula la expresión génica y está implicado en la modulación de comportamientos biológicos malignos de cáncer [10]. La expresión aberrante de SATB1 se ha demostrado que el cáncer de mama promovido, cáncer de pulmón y linfoma [11] - [13]. Nuestros estudios previos han demostrado que SATB1 juega un papel importante en el cáncer gástrico, y puede ser un marcador pronóstico independiente para el cáncer gástrico [14], [15]. La supresión de la expresión de SATB1 mediante la entrega de siRNA o interferir plásmido codificación específica de ARN harpin corto (shRNA) contra SATB1 podría inhibir la proliferación y la invasión, y promover la apoptosis de las células tumorales [16], [17]. Estos resultados sugieren que SATB1 es una posible diana terapéutica para el cáncer gástrico.
Especulamos que la combinación de la terapia génica y la quimioterapia podría mejorar significativamente la eficacia terapéutica contra el cáncer gástrico. En nuestro estudio anterior, hemos desarrollado un sistema de co-administración termosensible específicas basadas en liposomas catiónicos magnéticas termosensibles (TSMCL). Por ensayo de liberación de calceína, habíamos optimizado la formulación liposomal termosensible, y luego se mide la eficiencia propiedades magnéticas y la entrega de genes de TSMCL. En este estudio, cargamos doxorrubicina y vector SATB1-shRNA en este sistema para la combinación de la terapia génica y la quimioterapia, y evaluamos su efecto anti-tumor sinérgico contra el cáncer gástrico in vitro e in vivo.
Materiales y Métodos
Materiales
El colesterol, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), y 3β- [N- (N ', N'-dimetilaminoetano) carbamoil] colesterol (DC-Chol) se adquirieron de Avanti lípidos polares (USA). bromuro de dimetildioctadecilamonio (Doab) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (EE.UU.). Magnetic Fluid Fe
3O
4 se sintetizó mediante nanotecnología Galaxy (República Popular China). FAM etiquetados ARNsi y el plásmido pGFP-SATB1 shRNA fueron proporcionados por GenePharma (Shanghai, China). La doxorrubicina se adquirió de Hisun Farmacéutica (Zhejiang China). de suero fetal bovino (FBS), medios de cultivo, penicilina /estreptomicina (plagas) y tripsina fueron suministrados de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). anticuerpo monoclonal de conejo SATB1 era de Epitomics (Abcam, UK). Todos los otros productos químicos fueron de grado analítico comercial y se usaron sin purificación adicional.
Preparación de sistema de co-entrega
Este sistema co-entrega se basó en liposomas catiónicos termosensibles, que se prepararon con un termosensible formulación catiónica de DPPC, DC-colesterol, Doab y el colesterol en una proporción molar de 80:5:5:10 optimizado en nuestros experimentos preliminares. Los liposomas (TsCl) se prepararon por el método de hidratación de película delgada, seguido de extrusión [18]. El método de gradiente de sulfato de amonio se utiliza para cargar DOX en TSCL (TSCL-DOX). Para preparar liposomas magnéticos (TSMCL), fluido magnético Fe
3O se utilizó
4 como el núcleo y co-encapsulado con tampón de sulfato de amonio en los liposomas. Después de la formación de película delgada en el matraz de fondo redondo, se añadió un mililitro de suspensión de hierro y sulfato de amonio para hidratar la película, y después se extruye a través de los filtros de policarbonato y cargado con DOX (TSMCL-DOX) por el método de gradiente de sulfato de amonio . Por último, los productos de la filtración en gel se centrifugaron a 1000 g durante 15 min para eliminar no encapsulado Fe
3O
4.
pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) vector se incubó con diferentes liposomas en medio libre de suero a temperatura ambiente durante 30 minutos, para preparar TSCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 y TSMCL-DOX-shSATB1, respectivamente.
Determinación del potencial zeta, tamaño de partícula, y la polidispersidad
el tamaño medio de las partículas y la polidispersidad de la distribución de tamaño de partícula de los liposomas se determinaron a 25 ° C mediante dispersión de luz dinámica utilizando un instrumento ZetaPALS dimensionamiento de partículas (Brookhaven Instruments Corporation, EE.UU.). El potencial zeta de las dispersiones liposómicas se midió utilizando el mismo instrumento a 25 ° C por la movilidad electroforética.
Determinación de la doxorrubicina cargada eficiencia
concentración de DOX en los liposomas se midió mediante un fluorímetro ( Perkin Elmer, EE.UU.) con 485 nm de excitación y 590 nm de emisión filtros con una serie de diluciones de DOX libre como el estándar. eficiencia cargado DOX se calculó basándose en la concentración de DOX.
calorimetría diferencial de barrido (DSC)
DSC se realizó para evaluar la termosensibilidad de los liposomas mediante la determinación de la temperatura de transición de fase (Tm). Tm se evaluó utilizando un DSC nano (TA Instruments, EE.UU.) a una velocidad de calentamiento de 20 ° C /h con 20 mg /ml de fosfolípidos.
in vitro termosensibles ensayo de liberación de DOX
20 l liposomas cargados DOX se incubaron en 1 ml de PBS y PBS con suero de 50% de bovino fetal (FBS) que imita el entorno en vivo por separado en tubos Eppendorf. Las muestras se calentaron en baño de agua a 37 ° C y 42 ° C durante 1 h, respectivamente. A continuación, la intensidad de fluorescencia de DOX se midió en un fluorímetro (Perkin Elmer, EE.UU.), utilizando 485 nm de excitación y 590 nm de emisión filtros. Para publicación 100%, las muestras se incubaron en 1 ml de PBS con 1% de Triton X-100 durante 1 min. Los porcentajes de liberación de DOX se calcularon como sigue: donde
s era F la fluorescencia de las muestras después del calentamiento, F
0 se llegó al fluorescencia inicial de las muestras antes del calentamiento, y F
100 fue la fluorescencia de las muestras tratadas con Triton X-100.
cultivo de células
adenocarcinoma gástrico MKN-28 línea celular humana se adquirió de keygen Biotech (Nanjing, china) y se cultivaron en DMEM de alta glucosa suplementado con 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C.
in vitro de transfección celular
MKN-28 células se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 4 × 10
5 células /pocillo y se cultivan durante la noche a aproximadamente el 80% de confluencia. Al día siguiente, las células se lavaron dos veces con PBS precalentado, a continuación, TSCL-shSATB1 y TSMCL-shSATB1 se añadieron en cada pocillo y se incubaron durante 6 h. Las células incubadas con TSMCL-shSATB1 se colocaron en 12 pocillos placa magnética durante los primeros 30 min para ofrecer un campo magnético. A continuación, el medio de incubación se sustituyó por DMEM suplementado con 10% de FBS y se incubaron las células durante 24 h. nivel de expresión de GFP se evaluó con un microscopio de fluorescencia (Nikon 80i) y el citómetro de flujo (BD FACS Canto II).
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
El ARN total se extrajo de MKN-28 células por medio de TRIzol regente (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante, y cDNA fue sintetizado utilizando PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian). PCR se realizó utilizando SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara, Dalian) en un sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems, EE.UU.). Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: SATB1 sentido 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', y antisentido 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' GADPH sentido 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', y antisentido 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. SATB1 nivel de ARNm se normalizó a la de GAPDH.
se cosecharon y se lisaron en tampón RIPA análisis de transferencia de Western
MKN-28 células. Los sobrenadantes se recogieron después de centrifugación a 10.000 g durante 10 min. La concentración de proteína del sobrenadante se determinó usando un Kit de ensayo de proteínas BCA. A continuación, 40 g de las muestras se realizaron en un SDS-PAGE al 15% y las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF. A continuación, las membranas se incubaron en la leche no grasa 5% durante 1 h para bloquear la unión no específica y después se incubaron durante la noche a 4 ° C con SATB1 o anticuerpo β-actina (1:500 dilución). Las membranas fueron sondadas con anticuerpo de cabra conjugado con HRP anti-conejo anticuerpo secundario durante 30 min. Por último, las membranas se visualizaron con un sistema de quimioluminiscencia (ECL, Pierce) y se expusieron a película de rayos X.
Evaluación in vitro de la captación celular
Para evaluar la localización intracelular de DOX entregado y pGFP-SATB1 shRNA y la penetración mejorada de los liposomas en las células de cáncer gástrico por magnética específica, un FAM marcada siRNA (fluorescencia verde) se utilizó para imitar pGFP-SATB1 shRNA, y DOX por sí misma posee una fluorescencia roja instinto para monitorizar la captación celular . células MKN-28 se sembraron en placas de 12 pocillos a 4 x 10
5 células /pocillo y se cultivaron durante la noche. A continuación, las células se incubaron con siRNA libre, TSCL-siRNA, TSMCL-siRNA, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-siRNA o TSMCL-DOX-siRNA durante 6 h. Para los liposomas magnéticos, las placas se colocaron en una placa magnética de 12 pocillos durante la primera hora de incubación. Las células se visualizaron bajo microscopio de fluorescencia para localizar las etiquetas fluorescentes de DOX y siRNA. Los núcleos se tiñeron con DAPI (fluorescencia azul).
MTT ensayo
células MKN-28 se sembraron a una densidad de 2 × 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos y crecido durante la noche. Las células fueron incubadas con diferentes liposomas a 37 ° C durante 2 h en CO
2 incubadora. Para los liposomas magnéticos, las placas se colocaron bajo una placa magnética de 96 pocillos durante los primeros 1 h de incubación. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron durante 46 h en medio fresco. Posteriormente, la viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. El medio de cada pocillo fue sustituido por 20 l solución de MTT (Sigma-Aldrich, EE.UU.) y se incubó durante 4 horas a 37 ° C, a continuación, los sobrenadantes se desecharon y los cristales de formazán se disolvieron con 200 l de DMSO. Las placas se midió a 490 nm en un lector de microplacas, y se calculó la viabilidad celular de acuerdo con la siguiente fórmula:
Citometría de flujo
La apoptosis se detectó usando un kit de Anexina V-FITC de detección de apoptosis (eBioscience, EE.UU.). MKN-28 células fueron sembradas en placas de 12 pocillos y se trataron como se describe anteriormente. Después de 24 h, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS y se suspendieron en 500 l de tampón de unión. A continuación, las células se tiñeron con doble Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI). Las células en la etapa temprana de la apoptosis con Anexina V teñidas con FITC, pero no teñidas con PI se cuantificaron por citometría de flujo.
modelo de xenoinjerto de ratón
cinco a seis semanas de edad BALB /c ratones desnudos fueron proporcionado por el Centro de Experimentación Animal de Tongji Medical College. Cada ratón se inoculó por vía subcutánea en el flanco derecho con 5 × 10
6 MKN-28 células. Varias semanas después de la inoculación del tumor, 36 ratones portadores de tumores se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 6). Los ratones fueron inyectados a través de la vena de la cola con libre de DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 o solución salina normal como control. La dosis de DOX era 2,5 mg /kg y el de pGFP-SATB1 shRNA era 10 g por ratón. El tratamiento se administra una vez cada tamaño de 3 días y tumor se midió a través de un calipering y luego el volumen del tumor se podría calcular por la siguiente fórmula: volumen = (D
Min)
2 × D
Max /2, donde D
Max fue el diámetro del tumor más larga y D
Min era la más corta. Para TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 y TSMCL-DOX-shSATB1, la orientación magnética se logró utilizando un campo magnético externo continuado de 5000 Gauss durante 30 minutos centrándose en el tumor después de la administración del fármaco. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética del Colegio Médico de Tongji y todos los animales fueron tratados con humanidad según las directrices de Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar (DAKOTA DEL SUR). La significación estadística entre los diferentes grupos se evaluó con la prueba t de Student y el análisis de un factor de la prueba de varianza (ANOVA). Para el tiempo de supervivencia de los animales, se establecieron y prueba de log rank las curvas de Kaplan-Meier de cada grupo se realizó para comparar la tasa de supervivencia. p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Caracterización de liposomas
Como se muestra en la Tabla 1, el diámetro de TSCL fue 83,6 ± 5,7 nm, mientras que la de TSCL. -DOX se aumentó a 118,5 ± 7,9 nm debido a la encapsulación de DOX. Mientras tanto, los diámetros de TSCL-shSATB1 y TSCL-DOX-shSATB1 se aumentaron significativamente a 161,1 ± 11,8 nm y 238,1 ± 20,6 nm, respectivamente, debido a la adhesión y de la fusión del ADN del plásmido a los liposomas. Para los liposomas magnéticos, los tamaños de partícula de TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 y TSMCL-DOX-shSATB1 fueron 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm y 319,4 ± 20,1 nm, respectivamente, significativamente mayor que la de TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 y TSCL-DOX-shSATB1 debido al atrapamiento de las nanopartículas magnéticas. Además, el tamaño de TSMCL-shSATB1 y TSMCL-DOX-shSATB1 fue significativamente mayor que la de TSMCL y TSMCL-DOX, respectivamente (p & lt; 0,05). Todos los liposomas tenían estrecha distribución de tamaño debido a que sus polidispersidades eran no más de 0,3.
Los potenciales zeta de TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 y TSCL-DOX-shSATB1 fueron 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV y 26,7 ± 4,5 mV, respectivamente. Después de la incubación con pGFP-SATB1- shRNA, las cargas superficiales disminuyeron significativamente (p & lt; 0,05), debido a la interacción electrostática entre los lípidos catiónicos y ADN de plásmido. Sin embargo, el atrapamiento de nanopartículas magnéticas no resultó en una disminución significativa del potencial Zeta en liposomas magnéticos.
Para la eficiencia cargado DOX, la tasa de encapsulación de DOX era 89 ± 3% y 78 ± 8% (n = 3) para TSCL-DOX y TSMCL-DOX, respectivamente, y fue 85 ± 7% y 73 ± 9% (n = 3) para TSCL-DOX-shSATB1 y TSMCL-DOX-shSATB1, respectivamente. Estos datos indican que la interacción entre los liposomas y el plásmido no dio lugar a fugas de DOX.
La termosensibilidad de los liposomas
calorimetría diferencial de barrido se realizó para determinar la temperatura de transición de fase de TSCL. Como se muestra en la Fig. 1, TSCL compuesto de DPPC, DC-colesterol, Doab y el colesterol en una proporción molar de 80:5:5:10 tenían una Tm de 40,8 ° C con un pico de transición relativamente amplio que puede ser el pico de transición de fusión de DPPC y Doab .
termosensible vitro de liberación de los liposomas
Como se muestra en la Fig en DOX. 2, la tasa de liberación de DOX de TSCL-DOX y TSMCL-DOX fue sólo 12% y 16% después de la incubación con PBS a 37 ° C, y aumentó a 20% y 19% después de la incubación con 50% de FBS, respectivamente. Para TSCL-DOX-shSATB1 y TSMCL-DOX-shSATB1, la velocidad de liberación de DOX era 12% y 15% después de la incubación con PBS a 37 ° C, y era a la vez 16% después de la incubación con 50% de FBS, lo que indica que la incorporación del plásmido tenía ningún efecto significativo sobre la estabilidad de los liposomas (p & gt; 0,05).
la liberación de DOX a partir de diferentes liposomas a 37 ° C (a) y 42 ° C (B) después de la incubación con PBS o 50% de FBS. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n = 3).
velocidad de liberación de DOX TSCL-DOX y TSMCL-DOX se aumentó a 37% después de la incubación con PBS a 42 ° C, y el aumento a 45% y 49% después de la incubación con 50% de FBS, respectivamente. Para TSCL-DOX-shSATB1 y TSMCL-DOX-shSATB1, la velocidad de liberación de DOX era 35% y 43% después de la incubación con PBS y FBS a 42 ° C, respectivamente, ambos significativamente más alto que a 37 ° C (p & lt; 0,05). Estos resultados indican que TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-shSATB1 y TSMCL-DOX-shSATB1 tienen termosensibilidad deseable, y podrían utilizarse para la hipertermia desencadenan la liberación de control de DOX.
silenciamiento de la expresión en SATB1 MKN-28 células transfectadas con liposomas
a continuación se evaluó la eficacia de los liposomas para entregar vector shSATB1 en MNK-28 células. imágenes de fluorescencia típicas de las células transfectadas con TSCL-shSATB1 y TSMCL-shSATB1 se muestran en la Fig. 3A. Citometría de flujo análisis mostró que la eficiencia de transfección de TSCL-shSATB1 fue sólo 15,4 ± 0,15%. Sin embargo, después de la aplicación de la orientación del campo magnético, la eficiencia de transfección de TSMCL-shSATB1 era 34,3 ± 0,93%, significativamente mayor que la de TSCL-shSATB1 (Fig. 3B)
.
(A) de formación de imágenes fluorescentes de MKN -28 células transfectadas por TSCL-shSATB1 y TSMCL-shSATB1. (B) Análisis cuantitativo de la eficacia de transfección de TSCL-shSATB1 y TSMCL-shSATB1 por FACS. (C) Análisis de transferencia Western de nivel de proteína SATB1 en células MKN-28 transfectadas por TSCL-shSATB1 y TSMCL-shSATB1. (D) El análisis de PCR en tiempo real del nivel de ARNm SATB1 en células MKN-28 transfectadas por TSCL-shSATB1 y TSMCL-shSATB1. Los valores se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 comparado con el control simulado;#P. & Lt; 0,05 en comparación con TSCL-shSATB1
Para determinar si el vector shSATB1 entregado podría mediar en el silenciamiento de la expresión SATB1 en MKN-28 células, se realizó PCR en tiempo real cuantitativa y Western blot. Los resultados mostraron que ambos ARNm y los niveles de proteína SATB1 disminuyeron en células transfectadas con TSCL-shSATB1 y TSMCL-shSATB1, en comparación con las células control. Por otra parte, TSMCL-shSATB1 con la ayuda del campo magnético era más potente que TSCL-shSATB1 para inhibir la expresión SATB1 en MKN-28 células (Fig. 3C, D).
magnética dirigida in vitro la captación celular
Para comparar las penetraciones en las células entre liposomas no magnéticos y magnéticos con la aplicación de la orientación dirigida magnética, así como la ubicación intracelular de entregado DOX y shSATB1, un ARNsi marcado con FAM se utilizó como indicador. La ausencia de fluorescencia verde en células tratadas con libre siRNA indicó que no podía penetrar en las células (datos no presentados). Hemos observado que las células tratadas con más TSMCL-siRNA exhiben fluorescencia verde de las células tratadas con TSCL-siRNA (Fig. 4A). Por otra parte, más células tratadas con TSMCL-DOX mostraron fluorescencia roja que las células tratadas con TSCL-DOX (Fig. 4B). En las células tratadas con TSMCL-DOX-siRNA, se observó una alta intensidad de fluorescencia, y las células apareció de color rosa debido a la fusión del color azul, rojo y verde (Fig. 4C). Estas observaciones sugieren que TSMCL es más potente en la entrega de siRNA y DOX en las células que TSCL, después de la aplicación del campo magnético.
(A) Formación de imágenes de células después del tratamiento con TSCL-siRNA y TSMCL-siRNA. (B) Obtención de imágenes de células después del tratamiento con TSCL-DOX y TSMCL-DOX. (C) Obtención de imágenes de células después del tratamiento con TSCL-DOX-siRNA y TSMCL-DOX-siRNA. (D) la imagen detallada típico de la localización de DOX y siRNA en las células después del tratamiento con TSMCL-DOX-siRNA.
Además, se analizó la localización intracelular de DOX entregado y siRNA. se observó fluorescencia roja en ambos los núcleos y el citoplasma, lo que indica que entregado DOX se encuentra tanto en los núcleos y el citoplasma. En contraste, la fluorescencia verde apareció principalmente en el citoplasma, lo que sugiere que los siRNAs se dieron en el citoplasma (Fig. 4D). La fusión de rojo y verde amarillo apareció en el citoplasma, y la fusión de azul y rojo apareció lavanda en los núcleos. Tomados en conjunto, estos datos indican que tanto TSCL y TSMCL pueden penetrar en células de cáncer gástrico y entregar su contenido en el citoplasma (DOX y siRNA) y los núcleos (DOX).
efectos anti-tumorales in vitro de la liposomas
Se evaluaron los efectos anti-tumorales in vitro de este sistema de co-administración de la actividad de inducción de citotoxicidad y apoptosis. La citotoxicidad de los liposomas se evaluó mediante el ensayo de MTT. Para determinar los efectos de las concentraciones de DOX y el plásmido sobre la citotoxicidad de los liposomas, se examinaron liposomas cargados con varias concentraciones de DOX y diferentes cantidades de SATB1 shRNA. Con el aumento de la concentración de DOX, la citotoxicidad de los liposomas se incrementó (Fig. 5A). Sin embargo, la adición de la concentración SATB1 shRNA no dio como resultado un aumento de la citotoxicidad, y no se aumenta sólo ligeramente de la citotoxicidad cuando la concentración de SATB1 shRNA fue de aproximadamente 4 g (Fig. 5B). Por lo tanto hemos utilizado 25 DOX M y 4 mg SATB1 shRNA para comparar la citotoxicidad entre DOX libre, libre de shRNA, TSCL, TSMCL, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 y TSMCL- DOX-shSATB1.
(A) La viabilidad de las células después del tratamiento con liposomas cargados con diferentes concentraciones de DOX. (B) La viabilidad de las células después del tratamiento con liposomas cargados con diferentes concentraciones de shSATB1. (C) La viabilidad de las células después del tratamiento con liposomas tal como se indica. Los valores se expresan como media ± desviación estándar (n = 3). (D) La apoptosis de las células después del tratamiento con liposomas tal como se indica.
Como se muestra en la Fig. 5C, libre shRNA, TSCL y TSMCL tenían poca citotoxicidad. La viabilidad celular fue 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% y 51,3 ± 4,5% para DOX libre, TSCL-DOX y TSMCL-DOX, respectivamente, lo que sugiere que la citotoxicidad de TSMCL-DOX fue mayor que TSCL-DOX, pero inferior a libre DOX . La viabilidad celular fue 79,2 ± 6,9% y 71,6 ± 4,7% para TSCL-shSATB1 y TSMCL-shSATB1, respectivamente, sin mostrar significación estadística (p & gt; 0,05). Para medicamentos y genes co-suministro, la viabilidad celular fue sólo 35,0 ± 3,2% y 22,3 ± 3,4% para TSCL-DOX-shRNA y TSMCL-DOX-shRNA, respectivamente, significativamente inferior a la de libre de DOX, TSCL-DOX, TSMCL- DOX y SATB1shRNA liposomas cargados (p & lt; 0,05). Además, la viabilidad celular de TSMCL-DOX-shRNA fue significativamente menor que la de TSCL-DOX-shRNA (p & lt; 0,05). Estos resultados sugieren que un efecto sinérgico de citotoxicidad se consigue mediante co-entrega de DOX y SATB1 shRNA. Por otra parte, con la aplicación de magnética específica, una citotoxicidad mejora adicionalmente se puede obtener.
Para determinar el mecanismo antitumoral adicional, además de la citotoxicidad del sistema de co-administración, se analizó la tasa de apoptosis de MKN-28 las células tratadas con DOX libre, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 y TSMCL-DOX-shSATB1 por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 5D, la tasa de apoptosis fue 22,3% en las células tratadas con libre de DOX, fue 8,9% en las células tratadas con TSCL-DOX, pero aumentó a 13,4% en las células tratadas con TSMCL-DOX y el campo magnético. Del mismo modo, la tasa de apoptosis fue del 9,4% en las células tratadas con TSCL-shSATB1, pero aumentó a 17,4% en las células tratadas con TSMCL-shSATB1 y el campo magnético. En contraste, la tasa de apoptosis fue 27,7% en las células tratadas con TSCL-DOX-shSATB1, mayor que en las células tratadas con TSCL cargados de DOX o shSATB1 solo. La tasa de apoptosis fue del 32,4% en las células tratadas con TSMCL-DOX-shSATB1, la más alta entre todos los grupos. Estos resultados demuestran que la entrega de co-DOX y SATB1 shRNA conduce a efectos combinados de la inducción de la apoptosis. En una palabra, este sistema de co-entrega exhibe fuertes efectos anti-tumorales in vitro.
In vivo la actividad anti-tumor de los liposomas
Con el fin de determinar la actividad anti-tumor in vivo del sistema de co-administración, establecimos MKN-28 modelos murinos xenoinjertos y se inyecta libre de DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 o TSMCL-DOX-shSATB1 en los ratones a través de la vena de la cola. El tratamiento se administra una vez cada 3 días, y los tumores se diseccionaron (Fig. 6A). En el día 15, el volumen del tumor fue de 0,44 ± 0,05 cm
3 en ratones tratados con TSMCL-DOX-shSATB1, significativamente más bajo que en el grupo de solución salina (2.14 ± 0.23 cm
3), el grupo libre de DOX (1,08 ± 0,13 cm
3), grupo TSMCL-DOX (0,68 ± 0,10 cm
3), grupo TSCML-shSATB1 (1,43 ± 0,21 cm
3), y el grupo TSCL-DOX-shSATB1 (0,77 ± 0,12 cm
3) (Fig. 6B).
(A) de imagen típica de tumores xenoinjerto. (B) El tamaño del tumor después del tratamiento con DOX libre, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, o TSMCL- DOX-shSATB1, se utilizó el tratamiento con solución salina normal como control. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (n = 6). curvas (C) supervivencia de los ratones portadores de tumor tratados con DOX libre, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, o TSMCL- DOX-shSATB1, el tratamiento con solución salina normal se utilizó como control.
Además, como se muestra en la Fig. 6 (C), el tiempo medio para que el volumen del tumor para llegar a 2 cm
3 fue de 30 días en el grupo TSMCL-DOX-shSATB1,, grupo libre de DOX, grupo TSMCL-DOX, grupo TSCML-shSATB1 ya que en el grupo de solución salina y el grupo TSCL-DOX-shSATB1 (Fig. 6C). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la co-DOX y la entrega de shSATB1 por TSMCL exhibe efecto antitumoral sinérgico in vivo.
Discusión
A pesar de reciente desarrollo en la cirugía, la radioterapia y la terapia de apuntar, la quimioterapia es siendo uno de los enfoques importantes para la terapia del cáncer gástrico. Sin embargo, los efectos terapéuticos de la quimioterapia son a menudo insatisfecho y no podrían mejorar significativamente el pronóstico de los pacientes con cáncer [19]. Una razón principal es la tumorigénesis y progresión del cáncer gástrico implica una variedad de diferentes mecanismos; el mecanismo de tumor contra unitaria de la quimioterapia tradicional ha limitado sus efectos terapéuticos, por tanto, la combinación de quimioterapia con la terapia génica puede mejorar los efectos anti-tumorales. Otro obstáculo de la quimioterapia es que la administración sistémica del fármaco conduce a la concentración de fármaco limitada en los sitios del tumor mientras que causan muchos efectos adversos [8]. La clave para resolver estos problemas se basa en nuevos modos de administración de fármacos, por lo tanto, en desarrollo específicos, multi-agentes sistema de entrega que puede ser guiado directamente al sitio del tumor con liberación controlada puede superar estos problemas y mejorar los efectos terapéuticos [20] - [25] .
Entre los diversos sistemas de administración de fármacos, los liposomas son más prometedor para los buenos biocompatibilities que causan poco o ningún antigénica, alérgica y reacciones tóxicas, y fácilmente se someten a la biodegradación. Como ambos portadores de fármacos y genes, los liposomas no sólo pueden proteger al huésped de los efectos indeseables del fármaco encapsulado, sino también evitar que los contenidos atrapados de inactivación prematura por el medio fisiológico [26]. Además, los liposomas es un sistema de administración de fármacos potencialmente dirigida, si se consigue mediante aumento de la permeabilidad y el efecto de retención (EPR) (pasiva dirigida), o por la dirección del campo magnético y la conexión inmune (Active dirigida) [27]. Además, algunos liposomas poseen características controladas desencadenan la liberación del fármaco, tales como termo sensibilidad, sensibilidad al pH y la sensibilidad de microondas.
Recientemente hemos desarrollado un novedoso sistema magnético dirigido termosensible de medicamentos y genes co-parto (TSMCL). Sobre la base de una formulación termosensible electroneutral (DPPC:Cholesterol = 80:20), que habíamos añadido diferentes componentes catiónicos y optimizado la termosensibilidad de liposomas mediante el ensayo de liberación de calceína. Los resultados indicaron que podíamos conseguir un termosensibilidad deseable mediante la sustitución de 10 partes en moles de colesterol de 5 partes molares DC-colesterol y 5 partes molares Doab (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10), y liberación de calceína de los liposomas será inferior a 37 ° C, pero significativamente mayor a 42 ° C en esta formulación. A continuación, el fluido magnético Fe
3O
4 había sido utilizado como el núcleo y funcionó como la orientación magnética y fuente de calor de TSMCL. Vibrando magnetómetro de muestra (VSM) de medición había indicado que el fluido magnético Fe
3O
4 habían sido superparamagnético, por lo tanto TSMCL tendría buenos efectos magnéticos dirigidos. Mientras tanto, la curva de calentamiento dependiente del tiempo también se había demostrado que tanto el fluido magnético Fe
3O
4 y TSMCL podría ser calentada de 25 ° C a 42 ° C dentro de 20 min. Con la ayuda de fluido magnético Fe
3O
4, tanto la orientación magnética y la temperatura desencadena la liberación del fármaco de TSMCL podría realizarse. Por último, tanto TSCL y TSMCL habían exhibido morfologías típicas de liposomas y buenas distribuciones bajo TEM. Sobre la base de la construcción exitosa de TSMCL, en este estudio hemos cargado DOX y SATB1 shRNA vector en TSMCL para hacer TSMCL-DOX-shSATB1 y evaluamos los efectos antitumorales contra las células de cáncer gástrico in vitro e in vivo.