Extracto
El receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) es un importante diana terapéutica en pacientes con cáncer colorrectal metastásico y los anticuerpos anti-EGFR cetuximab y panitumumab han sido aprobados para el tratamiento de tales pacientes. A pesar de estos avances, la duración de la respuesta en algunos pacientes puede ser limitado. Dado que, EGFR es capaz de formar heterodímeros con los otros miembros de la familia HER (receptor epidérmico humano), es importante investigar la co-expresión y significado pronóstico de todos los miembros de la familia HER en pacientes con cáncer colorrectal. La expresión de los miembros de su familia fueron determinados en muestras tumorales de 86 pacientes con Dukes C y D (metástasis) del cáncer de colon mediante inmunohistoquímica. Las secciones fueron calificadas por el porcentaje de células tumorales positivas y la intensidad de la tinción. Sus asociaciones con parámetros clínico y la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad se evaluó mediante el análisis univariante y multivariante. En general, 43%, 77%, 52% y 92% de los casos eran EGFR, HER-2, HER-3 y HER-4 positivos, respectivamente. Curiosamente, el 35%, 24%, 43% y 18% de los casos había co-expresión de EGFR /HER-2, EGFR /HER-3, EGFR /HER-4 y los cuatro miembros de la familia HER, respectivamente. De éstos, sólo la expresión de EGFR y co-expresión de EGFR /HER-4 se asociaron con la supervivencia libre de enfermedad más pobre tanto en el análisis univariante y multivariante. Co-expresión de todos los miembros de la familia HER en el cáncer de colon es compatible con la necesidad de realizar más investigaciones sobre su valor predictivo de la respuesta a la terapia con anticuerpos monoclonales anti-EGFR y si dicha subpoblación de pacientes pueden beneficiarse de la terapia con la nueva generación de la cacerola inhibidores -HER
Visto:. Khelwatty SA, Essapen S, Bagwan I, M verde, Seddon AM, Modjtahedi H (2014) co-expresión de los miembros de su familia en pacientes con cáncer de colon C y D de Dukes y sus repercusiones en el pronóstico del paciente y la supervivencia. PLoS ONE 9 (3): e91139. doi: 10.1371 /journal.pone.0091139
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: December 11, 2013; Aceptó 7 de febrero de 2014; Publicado: 7 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Khelwatty et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado por una beca de la caridad del cáncer BRILLANTE (Reino Unido). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal sigue siendo una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo. En 2013, el cáncer colorrectal se estima que es el cuarto cáncer más comúnmente diagnosticado (142.820), pero la segunda causa principal de muerte por cáncer (50830) después del cáncer de pulmón en los EE.UU. [1]. Actualmente, de los diversos fármacos desarrollados para la terapia dirigida de cánceres humanos, el receptor del factor de crecimiento anti-epidérmico (EGFR) anticuerpos monoclonales (mAbs), cetuximab y panitumumab, y el factor de anti-vascular de crecimiento endotelial (VEGF) mAb bevacizumab han sido incorporado en paradigmas de tratamiento para la mayoría de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico [2] - [5]. Si bien la inclusión de estos agentes ha mejorado la supervivencia de pacientes con cáncer colorrectal metastásico, la duración de la respuesta puede ser limitada. Además, no ha habido ningún marcador predictivo fiable para la respuesta a estas terapias dirigidas anti-EGFR [6] - [10]. El desarrollo y la identificación de tales marcadores no sólo podría ayudar en la selección de una subpoblación más específica de pacientes con cáncer colorrectal que tienen más probabilidades de beneficiarse de este tipo de terapias, pero también pueden reducir los tratamientos innecesarios y así el alto costo para el cuidado de la salud sistema [11].
en las últimas cuatro décadas, la expresión aberrante de los diferentes miembros de la familia HER y sus ligandos se ha informado en una variedad de cánceres humanos. En algunos estudios, estos se han asociado con la resistencia a las formas convencionales de terapia y un peor pronóstico [6], [12], [13]. Sin embargo, hay una amplia variación en la expresión informado de los miembros de la familia HER en pacientes con cáncer colorrectal [6], [14] - [16]. Además de la formación de homodímeros, los miembros de la familia HER tales como el EGFR son capaces de ser activados mediante la formación de heterodímeros con otros miembros de la familia HER [17] - [19]
Mientras que un número limitado de. los estudios han investigado la expresión y la importancia pronóstica de los miembros individuales de la familia HER en pacientes con cáncer colorrectal [20] - [23], sin embargo, a nuestro conocimiento, no se han realizado estudios exhaustivos sobre la co-expresión y significado pronóstico de la miembros completos de su familia en pacientes con cáncer colorrectal hasta la fecha [6]. Por lo tanto, en este estudio hemos investigado los niveles de expresión de todos los miembros de la familia HER, de forma individual, así como su co-expresión en las muestras tumorales de 86 pacientes con C y D del cáncer de colon de Duke. También se investigó ninguna asociación entre la expresión de los miembros de su familia y los parámetros clínico, la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global.
Materiales y Métodos
Información del paciente
La aprobación ética se obtuvo del Comité de Investigación y Desarrollo de la Royal Surrey County hospital para el examen de muestras de tumores de pacientes con cáncer de colon para su uso en este estudio retrospectivo. Como las muestras de tumor única archivados se incluyeron en este estudio, el comité de ética renunciado a la necesidad de registros de consentimiento del paciente y /información se analizaron de forma anónima. Ochenta y seis pacientes con C y D del cáncer de colon de Duke, que se sometieron a cirugía radical en el Royal Hospital del Condado de Surrey (Guildford, Reino Unido) entre abril de 2002 y noviembre de 2007, se incluyeron en este estudio retrospectivo. Aquellos que no tienen información de seguimiento, diagnóstico erróneo, incompleto e histología fueron excluidos. Los casos de muerte peri y post-operatorio también fueron excluidos de este estudio, al igual que aquellos con tumor bloques en una condición muy pobre para el uso de inmunohistoquímica. información clinicopatológica detallada, incluyendo la edad del paciente y el género estaba disponible para cada paciente.
La inmunohistoquímica
(FFPE) secciones incluidas en parafina fijadas con formalina de las muestras de tumor (3 m) se cortaron en secciones en serie y se tiñeron utilizando el siguiente ratón anticuerpos primarios anti-EGFR (01:10, Novacastra, Reino Unido), ratón anti-HER-2 (1:150, Insight biotecnología, Reino Unido), ratón anti-HER-3 (01:20, Novacastra , Reino Unido) y de conejo anti-HER-4 (1:20, Fisher Scientific, Reino Unido). Tras la recuperación de antígenos, las secciones del tumor se incubaron con anticuerpos primarios contra EGFR, HER-3 y HER-4 durante 60 minutos y HER-2 para 32 minutos. optimización de protocolos se realizó utilizando estableció su bolitas línea celular de cáncer positivos, a saber, el EGFR overexpressing línea celular de cáncer colorrectal humano DiFi, que fue proporcionado amablemente por el Dr. Z ventilador (Centro de Cáncer MD Anderson, EE.UU.), el HER-2 sobreexpresión de carcinoma de mama humano línea de células SKBR3 (HER-2), y el HER-3 y HER-4 línea celular humana positiva carcinoma de mama MCF-7 como se describe anteriormente [24]. La tinción se lleva a cabo en un sistema de tinción automática Benchmark XT Venatana con el kit ultraView DAB (Roche, Reino Unido). Por último, todas las diapositivas fueron rehidratados y de contraste con hematoxilina, montados y la cubierta se deslizaron.
Scoring System
En la literatura actual, los valores de corte para dar un resultado positivo HER inmunotinción de las secciones del tumor es variable . En este estudio, la inmunotinción de las secciones de tumor se anotó basa en el porcentaje de células tumorales que tenía su inmunotinción (es decir, & gt; 5%, & gt; 10% y & gt; 50%) y la intensidad de la inmunotinción (es decir, negativo 0, débil 1+ positivo, moderadamente positiva 2+ y 3+ fuertemente positiva) y si la tinción era predominantemente presente en la membrana, citoplasma o núcleo de las células [15]. De la inmunotinción SU, SU-4 tenían los niveles más altos de la tinción de fondo y por lo tanto inmunotinción por encima del nivel de fondo solamente se consideró [22]. Dos observadores independientes (incluyendo un anatomopatólogo consultor), sin conocimiento previo de los parámetros clínico, llevado a cabo el marcador y cualquier disparidad en la puntuación se resolvió de una nueva evaluación simultánea de la tinción por ambos observadores.
Análisis estadístico
La asociación entre las puntuaciones de inmunohistoquímica y los datos clínico-patológicas de los pacientes se evaluó mediante la prueba de Chi-cuadrado (Pearson Chi-cuadrado) y la prueba exacta de Fisher. gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier se utilizaron para llevar a cabo el análisis univariado y las diferencias entre grupos se evaluó mediante la realización de log rank test. Para el análisis multivariante, se utilizó el modelo de regresión múltiple de Cox y P £ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando los PASW Statistics 21 (SPPS Inc.).
Resultados
Características clinicopatológicas
características clínico-patológicas de los pacientes se resumen en la Tabla 1. La mediana de los pacientes El tiempo de seguimiento fue de 6 años. Ninguno de los pacientes había recibido radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Cincuenta y dos pacientes recibieron quimioterapia adyuvante post-operatorio, que era predominantemente 5-fluorouracilo base con algunos pacientes que reciben terapias basadas oxaliplatino e irinotecán. Una peor supervivencia global se observó en pacientes con D de Dukes en comparación con Dukes C (3,2 ± 0,6 frente a 6,2 ± 0,4 años, el
P = 0,005
), y los que tienen más de 3 ganglios linfáticos positivos (4,3 ± 0,4 frente a 6,7 ± 0,5
P = 0,008
). No se encontró asociación significativa entre los resultados del paciente y de los otros parámetros clínico (Tabla 1).
Expresión inmunohistoquímica de los miembros de su familia
Al valor de corte de ≥5%, tumor especimenes de 43%, 77%, 52% y 92% de los casos eran EGFR, HER-2, HER-3 y HER-4 positivos, respectivamente (Tabla 2). En contraste con el EGFR, que tenía tinción predominantemente membranosa, la localización predominante de HER-2, HER-3 y HER-4 inmunotinción se citoplásmica (Tabla 2 & amp; Figura 1). En este estudio, hemos investigado la co-expresión de todos los miembros de la familia HER en pacientes con cáncer de colon y los resultados se presentan en la Tabla 3. La co-expresión de EGFR con HER-2, HER-3, HER-4, y HER-2 /HER-4 estaban presentes en 35%, 24%, 43% y 76% de los casos examinados (Tabla 3). Curiosamente, el 18% de los pacientes de este estudio se encontraron para co-expresar los cuatro miembros de la familia HER (Tabla 3 & amp; Figura 2).
La inmunotinción de EGFR 3+, HER-2 3+, HER-2 + 3, y HER-4 3+ en secciones de tumores incluidas en parafina fijadas con formalina teñidos inmunohistoquímicamente, tal como se describe en la sección métodos y pacientes. Ampliación:. × 200
Co-expresión de EGFR, HER-2, HER-3 y HER-4 en un tumor secciones incluidas en parafina fijadas con formalina teñidos inmunohistoquímicamente como se describe en la sección Métodos y pacientes. Ampliación:. × 200
El porcentaje de sus casos de cáncer de colon positiva fue también evaluada cuando inmunotinción se presente en más than10% y el 50% de las células tumorales (Tabla 2). Utilizando los valores de corte de por encima del 10% y el 50%, el porcentaje de casos con tumores EGFR positivos eran el 30% y el 4%, HER-2 positivo tumores were12% y el 8% y el HER-3 tumores positivos fueron del 45% y el 22 %, respectivamente (Tabla 2). El número de HER-4 tumores positivos siendo el mismo, independientemente de los valores de corte del porcentaje de células tumorales positivas, ya que todos los pacientes tenían HER-4 inmunotinción en más de 50% de las células tumorales en este estudio (Tabla 2) .
expresión y Co-expresión de los miembros de su familia se asocia con parámetros clínico-
la asociación entre las características clínico-patológicos y la expresión de los miembros de la familia HER se determinó mediante la prueba de Chi-cuadrado. Todas las subcategorías (es decir, células porcentuales positivos, intensidad y localización de la inmunotinción), que se encontró que tenían una asociación estadísticamente significativa con parámetros clínico se resumen en la Tabla 4.
Cuando inmunotinción se presente en mayor que 5% de las células tumorales, se encontró una asociación significativa entre la expresión de EGFR y la edad (
P = 0,022
), y el sitio del tumor (
P = 0,022
), con un significativamente mayor número de pacientes mayores de 70 años que tienen tumores EGFR positivos en el colon izquierdo (Tabla 4). Además, se encontró un número significativamente mayor de tumores C de Dukes que expresan HER-4 (
P = 0,011
) (Tabla 4). Al igual que la expresión de EGFR, la co-expresión de EGFR /HER-4 también se asoció significativamente con los pacientes mayores de 70 años (
P = 0,031
) y los tumores que presentan en el colon izquierdo (
) en este estudio. Además, se encontró un número significativamente mayor de los tumores en el colon izquierdo a EGFR co-express /HER-2 /HER-4 (
P = 0,036
) (Tabla 4).
en el valor de corte de encima del 10%, la expresión de HER-2 se asoció con la participación de más de 3 ganglios linfáticos positivos (
P = 0,047
) (Tabla 4). Además, un número significativamente mayor de los tumores que expresan HER-3 (
P = 0,037
), o co-expresión de EGFR /HER-3 (
P = 0,035
), o HER-3 /No se encontraron HER-4 (
P = 0,026
) en tumores & lt; estadio pT4 en este estudio (Tabla 4). Cuando se analizaron en base a la intensidad de su coloración, se encontró una asociación significativa entre HER-4 inmunotinción intensidad de 1+ y 2+ y un mayor número de tumores G3 (Tabla 4).
La supervivencia libre de enfermedad es significativamente asociado con la expresión y co-expresión de los miembros de su familia
la asociación entre la expresión de individuales, dos, tres, o los cuatro miembros de la supervivencia de su familia y libre de enfermedad se investigó el uso de Kaplan-Meier curvas y log rank test. Se encontró supervivencia libre de enfermedad a ser significativamente más pobre en pacientes con expresión de EGFR en valores de corte de ambos por encima de 5% (
P = 0,019
) y 50% (
P = 0,005
), expresión membranosa del EGFR (p = 0,004) y EGFR inmunoticción intensidad de 1+ (
P = 0,041
) (Figura 3 & amp; Tabla 5). Además, hubo una asociación significativa entre la co-expresión de EGFR y HER-4 por encima de 5% o por encima de 10% de las células tumorales y la supervivencia libre de enfermedad pobres (
P = 0,019
) (Tabla 5 ). La co-expresión de HER-2 /HER-3 también se encontró que se asociaron significativamente con una peor supervivencia libre de enfermedad (
P = 0,031
) (Tabla 5).
de Kaplan-Meier curvas de supervivencia que muestran el impacto sobre la supervivencia libre de enfermedad de los pacientes con la expresión de EGFR (a), la expresión de EGFR membranosa (B), EGFR 1+ inmunotinción (C) y EGFR /HER-4 co-expresión (D). Un valor de la prueba de log-rank de
P £ 0,05
se consideró significación estadística.
Por último, en el análisis multivariante, la expresión de EGFR en los valores de corte de ambas above5 % (
P = 0,027
) y 50% (
P = 0,015
), la expresión de EGFR membranosa (
P = 0,007
) y EGFR 1+ inmunotinción (
P = 0,048
) se encontraron para permanecer factores pronósticos independientes para pobres supervivencia libre de enfermedad. En cuanto a la co-expresión de los receptores, solamente EGFR /HER-4 inmunotinción por encima del 5% de las células tumorales se mantuvo como un factor pronóstico independiente de mal supervivencia libre de enfermedad en este estudio (Tabla 5). No se encontró asociación significativa entre su expresión y la supervivencia global en este estudio.
Discusión
La expresión aberrante de los miembros de su familia y, en particular, el EGFR se ha informado en una amplia gama de cánceres humanos y se ha asociado con la metástasis y mal pronóstico [6], [25], [26]. Como resultado, ha habido un desarrollo sustancial de terapias moleculares dirigidas a EGFR y la posterior aprobación de mAbs anti-EGFR, como cetuximab y panitumumab, para el tratamiento de pacientes con cáncer metastásico de colon [2], [27]. Sin embargo, a pesar de extensos estudios, actualmente no existen marcadores fiables para predecir la respuesta al tratamiento con estos inhibidores de EGFR [6], [28]. En varios estudios,
KRAS
mutaciones en pacientes con cáncer colorrectal están asociadas con resistencia a la terapia con anticuerpos anti-EGFR y es el único biomarcador para predecir la evolución del paciente durante el tratamiento con anti-HER-específicas terapias en cáncer colorrectal [ ,,,0],29]. Sin embargo, a pesar de estos avances, es evidente que no todos los pacientes con cáncer colorrectal con KRAS no mutado podrían obtener beneficios de anticuerpos monoclonales anti-EGFR y respuestas objetivas también han sido reportados en pacientes con tumores KRAS mutados [30]. Una razón para esto podría ser que KRAS no tiene interacción directa con la unión del anticuerpo en el sitio de antígeno y por lo tanto, es prudente para investigar la expresión de otros miembros de la familia HER, que se ha demostrado para activar las vías aguas abajo, a través de la heterodimerización y la cruz -Habla, e impulsar la génesis de tumores de cáncer colorrectal en estos pacientes [17] - [19]
Varios otros estudios han investigado la expresión de los miembros individuales de la familia HER como indicador pronóstico, sin embargo, hay una clara. asociaciones se han encontrado entre la expresión de sus proteínas y el pronóstico en pacientes con cáncer de colon [31] - [37]. La expresión informado de EGFR oscila entre 8 a 100%, HER-2 de 1% a 89%, HER-3 16-89%, y HER-4 11-81% en pacientes con cáncer colorrectal [6], [14 ] - [16], [20] - [22], [38]. La amplia variación en la expresión informado de las proteínas de la familia HER mediante técnicas de inmunohistoquímica en el cáncer colorrectal puede haber contribuido a los datos contradictorios sobre su importancia pronóstica en el cáncer colorrectal [6]. De hecho, los factores tales como el uso de diferentes anticuerpos, diferencias en las técnicas de recuperación de antígeno, los sistemas de puntuación, diferentes poblaciones de pacientes, los tamaños de muestra [por ejemplo, microarrays de tejidos (TMA)], y diferentes números de muestras podrían contribuir a la amplia variación en la expresión informado de los miembros de su familia en la literatura [6], [28].
En este estudio, se determinó la expresión de todos los miembros de la familia HER en 86 pacientes con C y D del cáncer de colon de Duke. Dado que las inconsistencias en el sistema de puntuación tales como el uso de diferentes valores de corte para HER inmunotinción es un factor importante que contribuye a la amplia variación en su expresión reportado en la literatura, en este inmunotinción estudio fue evaluado y valorado según los tres valores de corte de diferentes & gt; 5%, & gt; 10% y & gt; 50% (Tabla 2). De los 86 casos examinados, se encontró un 43%, 77%, 52% y 92% de los casos tener EGFR, HER-2, HER-3 y HER-4 inmunotinción presente en & gt; 5% de las células tumorales, respectivamente ( Figura 1). En este documento, mientras que no se encontró ninguna asociación entre la expresión de los miembros de su familia y la supervivencia global, esto es, en concordancia con otros estudios en la literatura [6]. A diferencia de la supervivencia global, en este estudio la expresión del EGFR y co-expresión de EGFR /HER-4 se asocia con una supervivencia libre de enfermedad, tanto en el análisis univariante y multivariante (Figura 3 & amp; Tabla 5). La expresión del EGFR se ha asociado significativamente con un mal supervivencia libre de enfermedad y la recaída de la enfermedad en otros dos estudios. En un estudio, Galizia et al. [34] investigaron la expresión de EGFR en muestras de tumores de 154 pacientes con cáncer colorrectal A-D de Dukes y conocer la expresión del EGFR membranosa que se asociaron significativamente con una pobre supervivencia libre de enfermedad, tanto en el análisis univariante y multivariante. En otro estudio que incluyó a 102 pacientes con cáncer colorrectal avanzado, se encontró que el 75,5% de los casos de expresar EGFR, que se asoció significativamente con la recaída de la enfermedad [39]. Por el contrario, Leung et al. [23] en su estudio de 127 pacientes con cáncer de colon utilizando TMA secciones, no encontraron ninguna asociación significativa entre la expresión de EGFR, y los resultados del paciente, pero encontró su expresión-3 para ser un predictor significativo de los resultados de supervivencia. Como se explicó anteriormente, las diferencias tales como el uso de TMA secciones en lugar de bloques de tejido enteros, la heterogeneidad de los tumores, y el uso de diferentes valores de corte podrían ser algunos de los factores que contribuyen a los datos contradictorios sobre la expresión y significado pronóstico de HER proteínas en el cáncer colorrectal. Además, tal como se determinó la importancia pronóstica de los miembros de su familia en tan sólo 86 pacientes en este estudio, esto requeriría una mayor validación en el grupo más grande de pacientes con cáncer colorrectal.
Varios estudios sugieren que la heterodimerización de la familia HER miembros desempeña un papel crucial en la génesis tumoral y, en particular también pueden desempeñar un papel importante en el desarrollo de resistencia a la terapia en pacientes con cáncer de colon [17] - [19]. Sin embargo, hasta la fecha sólo 4 estudios han determinado la expresión de todos los miembros individuales de la familia HER, pero los niveles de co-expresión de todos los miembros de la familia HER no se ha informado anteriormente en el cáncer colorrectal [20] - [23]. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que informa tanto de la expresión individual y co-expresión de todos los miembros de su familia en muestras tumorales de pacientes con C y D del cáncer de colon de Duke. Curiosamente, teniendo en cuenta los valores de corte de 5% y las células tumorales positivas 10%, encontramos la co-expresión de EGFR /HER-4 que se asociaron significativamente con la supervivencia libre de enfermedad en pacientes con C de Dukes y el cáncer de colon D en este estudio (Tabla 5). Mientras que algunos estudios informan de las asociaciones entre la co-expresión de HER-2 /HER-4 o HER-3 /HER-4 y tumorales finales de etapas [21], [22], a nuestro entender la significativa co-expresión de EGFR /HER-4 con la supervivencia libre de enfermedad más pobre en pacientes con cáncer de colon no se ha informado anteriormente. Nuestros resultados sugieren que la formación de heterodímeros de EGFR y HER-4 pueden desempeñar un papel importante en la génesis de tumores de cáncer de colon y contribuir a la recaída de la enfermedad más rápida en estos pacientes. Curiosamente, encontramos la co-expresión de los cuatro miembros de la familia HER en el 18% de los casos examinados y el 35%, 24% y 43% de los casos tenían co-expresión de EGFR con HER-2, HER-3 y HER-4, respectivamente. En consecuencia, es esencial investigar si la co-expresión de otros miembros de la familia HER de los cánceres de EGFR positivos puede contribuir a la resistencia, o una mala respuesta a la terapia con el cetuximab anti-EGFR mAb y panitumumab en pacientes con cáncer colorrectal [ ,,,0],6].
en conclusión, la co-expresión de todos los miembros de la familia HER en un porcentaje considerable de pacientes con pacientes con cáncer de colon metastásico informó aquí, junto con la importancia de la heterodimerización entre los miembros de la familia HER en el la activación de vías de señalización HER, apoya la necesidad de realizar más estudios sobre su co-expresión, significado pronóstico y valor predictivo de la respuesta al tratamiento con inhibidores de HER, en una población mayor de pacientes con cáncer colorrectal. En particular, dichos estudios deben desentrañar si esta subpoblación de pacientes pueden beneficiarse de la terapia con la nueva generación de pan HER-inhibidores [40], [41].