Extracto
La inducción de poliploidía se considera el final de reproducción de las células, pero no hay evidencia de que las células cancerosas gigante poliploides (PGCCs) contribuyen a la repoblación celular durante la recidiva tumoral. Sin embargo, el papel de estas células en el desarrollo, la progresión y la respuesta a la terapia en el cáncer de colon permanece indefinido. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue investigar la generación de PGCCs en células de cáncer de colon y de identificar los mecanismos de formación. El tratamiento de células Caco-2 cáncer de colon con la hipoxia HCT-116 y imitan CoCl
2 indujo la formación de células con celda más grande y el tamaño nuclear (PGCCs), mientras que las células con morfología normal fueron eliminados selectivamente. Análisis de citometría mostró que CoCl
2 tratamiento G2 inducida por la detención del ciclo celular y la generación de una subpoblación de células poliploides con aumento del contenido de ADN celular. Poliploidía de PGCCs hipoxia inducida fue confirmada por análisis FISH. Además, CoCl
2 tratamiento indujo eficazmente la estabilización de HIF-1α, la expresión diferencial de una forma truncada de p53 (p47) y la disminución de los niveles de ciclina D1, indicando mecanismos moleculares asociados con la detención del ciclo celular en G2. Generación de PGCCs también contribuyó a la expansión de una subpoblación de células con células madre de cáncer características (CSC), como se indica por colonosphere ensayos de formación, y el aumento de la quimiorresistencia a 5-fluorouracilo y oxaliplatino. En conclusión, la inducción farmacológica de la hipoxia en las células de cáncer de colon causa la formación de PGCCs, la expansión de una subpoblación de células con características de CSC y quimiorresistencia. Los mecanismos moleculares implicados, incluyendo la estabilización de HIF-1 α, la implicación de p53 /p47 isoforma y la detención del ciclo celular en G2, sugieren nuevas dianas para prevenir la recaída del tumor y el fracaso del tratamiento en el cáncer de colon
Cita.: López-Sánchez LM, Jimenez C, Valverde A, Hernandez V, Peñarando J, Martínez A, et al. (2014) CoCl
2, un imitador de la hipoxia, induce la formación de células poliploides gigantes con características madre en cáncer de colon. PLoS ONE 9 (6): e99143. doi: 10.1371 /journal.pone.0099143
Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 31, 2014; Aceptado: 9 Mayo 2014; Publicado: 16 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 López-Sánchez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos se incluyen en el manuscrito
Financiación:. Con el apoyo de las subvenciones a A.R.-A. del Programa de Promoción de la Investigación en Salud del Ministerio de Economía y Competitividad, Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00428 y PI13 /00553) (http://www.isciii.es/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el segundo cáncer más común en todo el mundo con 1.234.000 casos en 2008 según GLOBOCAN [1]. CRC representa el 13% de todos los cánceres y casi 1000 nuevos casos de CCR fueron diagnosticados en 2012 en Europa [2], donde es el tercer cáncer más frecuente y después del cáncer de pulmón es la segunda causa más frecuente de muerte [3]. Aunque las tasas de mortalidad por CCR han disminuido ligeramente desde 1990 hasta la actualidad, ya pesar de los avances en la detección y el tratamiento quirúrgico, no existe una cura conocida para el CCR metastásico, y la tasa de supervivencia a 5 años de estos pacientes es decepcionantemente baja (alrededor del 8%) . La existencia de un relativamente raro que proliferan lentamente o descansando subpoblación de células, altamente resistente a los medicamentos, con propiedades similares a las células madre y conocidas como células madre del cáncer (CSC), se ha propuesto como una causa principal de la ineficiencia alarmante de las terapias estándar contra el cáncer [ ,,,0],4], [5]. Durante la última década, se ha demostrado que estas células madre cancerosas son capaces de proliferar y producir toda la masa tumoral. Esto ha llevado a proponer un modelo de células madre cancerosas, o modelo jerárquico tumor, en el que las células tumorales son heterogéneas, y sólo una pequeña población de células, que es en la parte superior de la pirámide jerárquica, es responsable de iniciar y mantener el crecimiento del tumor [5] . Sin embargo, estudios más recientes sugieren que stemness cáncer puede ser adquirida por el cambio de programas de expresión génica y por lo tanto la biología CSC debe pasar de una estructura jerárquica rígida a un modelo más flexible [6], [7]. Los CSC son mucho más resistentes que las células tumorales diferenciadas a las terapias que se utilizan en la clínica [4], [8] y, aunque el tratamiento es capaz de eliminar eficazmente la mayor parte de las células tumorales y el volumen del tumor disminuye, las CSC no se ven afectados y una vez la terapia se detiene que son capaces de reanudar el crecimiento del tumor y la diferenciación, explicando eventos como la recurrencia del tumor. Por lo tanto, se ha demostrado que el riesgo de recurrencia de la CRC es proporcional a la expresión en el tumor primario de genes específicos para las células madre intestinales que también identifican una población CSC en el tumor [9]. Además, células madre cancerosas parecen jugar un papel importante en el proceso de difusión, la latencia del tumor y la metástasis [10].
La hipoxia es una de las características patológicas más importantes de los tumores sólidos, ya que es el resultado de un desequilibrio entre la proliferación de las células tumorales y el suministro de oxígeno [11]. La hipoxia tumoral no sólo representa un problema importante que afecta a los esfuerzos terapéuticos, pero no hay evidencia experimental de que constituye una presión selectiva fisiológica promoción de la agresividad del tumor [12]. Es importante destacar que la hipoxia está asociada con el mantenimiento y la formación de células madre cancerosas [11], [13], la promoción de su fenotipo y la tumorigénesis [14]. Muchas de las respuestas celulares a la hipoxia están mediados por cambios en la expresión de genes regulados por el factor inducible por hipoxia (HIF-1α), que se ha convertido en un destino muy atractivo para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer [11]. En condiciones de normoxia proteína HIF-1α se degrada continuamente después de la hidroxilación por prolil hidroxilasas de dos residuos de prolina claves en su dominio degradación dependiente de oxígeno [15]. Sin embargo, bajo condiciones de hipoxia se estabiliza HIF-1α, se transloca al núcleo y, tras la unión a la subunidad HIF-1β, forma un factor de transcripción activo capaz de activar la expresión de genes objetivo facilitar la adaptación a la hipoxia celular [13]. cloruro de cobalto (CoCl
2) es un agente mimético utiliza
in vitro
para inducir respuestas celulares mediadas por la hipoxia. Se cree que CoCl
2 estabiliza HIF-1α mediante la inhibición de enzimas prolil hidroxilasa [16].
Se ha sugerido que, de manera similar a las células madre normales, el microambiente local es fundamental para mantener la supervivencia de células madre cancerosas en su "nicho" donde la recepción de las señales moleculares específicas regulan su proliferación y diferenciación [17]. Sorprendentemente, aunque varios estudios han demostrado recientemente un papel importante de las células endoteliales (EC) y nicho perivascular en la regulación de células y células madre cancerosas madre normales, otros estudios indican que la hipoxia también juega un papel clave [17]. La importancia de un nicho perivascular en la regulación de células madre cancerosas por un lado y el papel de la hipoxia en el otro puede parecer a primera vista paradójica. Sin embargo, ECs en el microambiente tumoral puede sufrir alteraciones funcionales que conducen a la generación de un microambiente hipóxico. Por lo tanto, las CSC de glioblastoma se encuentran en contacto íntimo con la vasculatura del tumor aberrantes [18]. Recientemente se informó de que la hipoxia puede seleccionar células poliploides cáncer gigante, (PGCCs) que contribuyen activamente al crecimiento del tumor por células madre cancerosas generando [19]. De hecho, la mayoría de los tumores humanos son celular heterogénea [20], y durante más de un siglo, los patólogos han observado tumores de células gigantes, significativamente más a menudo después de alguna forma de intervención terapéutica [19]. Estas células contribuyen a la heterogeneidad del tumor, pero la mayor parte de sus funciones aún no están definidos. Aunque la inducción de poliploidía se ha considerado tradicionalmente el extremo reproductiva de las células, hay evidencia de que las células gigantes contribuyen a repoblación celular durante la recurrencia del tumor [21], [22].
Aunque existen datos sobre la generación de PGCCs en el cáncer de ovario y de mama, el papel de estas células en el desarrollo, la progresión y la respuesta al tratamiento en CRC todavía permanece indefinido. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue investigar la
in vitro
generación PGCCs en células de cáncer de colon y de identificar mecanismos de formación.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y colonosphere ensayo de formación de
células Caco-2 (ECACC, Salisbury, Reino Unido) se cultivaron en MEM con sales de Earle (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) que contenía suero bovino fetal al 15%. Células HCT-116 (DSMZ, Braunschweig, Alemania) se hicieron crecer en medio 5A de McCoy (BioWest, Nuaillé, Francia) que contenía suero bovino fetal al 10% (PAA Laboratories). Los medios de cultivo se suplementaron con glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 mg /ml) y anfotericina B (2,5 mg /ml). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada a 37 ° C y 5% de CO
2. Una solución fresca stock 0,4 M de cloruro de cobalto (CoCl
2) se preparó en agua y se añade al medio para obtener las concentraciones finales deseadas.
Para el ensayo de formación de colonosphere, después del tratamiento con diferentes dosis de CoCl
2 durante 48 h, se tripsinizan las células, se contaron y se re-sembraron a una densidad clonal (1 célula /l) en placas de 96 pocillos con superficie de fijación ultra bajo (Costar, Corning, Nueva York, EE.UU.) con suero libre de MEM de Dulbecco mezcla Nutriente F + 12 medio jamón suplementado con 10 ng /factor de crecimiento de fibroblastos básico ml, 20 factor de ng /ml de crecimiento epidérmico y 1% v /v de metilcelulosa (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) para evitar la agregación celular. Los suplementos eran recién añadidos cada 2-3 días y el número y tamaño de colonospheres formados fueron evaluadas por microscopía óptica en el día 7 después de la siembra. colonospheres secundarias se forman a partir de la población celular obtenida después de la desagregación de tripsina-EDTA de esferas primarias y se sembraron a una densidad clonal y se cultivaron como se describe anteriormente. Para obtener un número de células suficiente para la formación colonosphere secundaria, colonospheres primarios se sembraron durante 7 días en placas de fijación de 6 pocillos ultra bajas.
Western Blot
Después de 6 y 48 h de tratamiento, las células cultivadas se recogieron con PBS frío y se centrifugaron a 300 x g, 4 ° C durante 5 minutos. El sedimento celular se incubó durante 15 minutos en hielo con 1 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1 mM de etilenglicol tetraacético (EGTA), 1,5 mM MgCl
2, 10% de glicerol, 1% de NP40, 0,1 M de ditiotreitol (DTT), 0,1 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1% v /v de cóctel inhibidor de la proteasa (SERVA, Heidelberg, Alemania) y 1% v /v cócteles de inhibidores de fosfatasa 2 y 3 (Sigma-Aldrich) y se centrifugó a 15.000 × g durante 15 minutos a 4 ° C. la concentración total de proteína se cuantificó por un ensayo de Bradford estándar utilizando el reactivo colorimétrico de BioRad Laboratories (Hercules, CA, EE.UU.). proteínas (12,5 g) se separaron en geles de poliacrilamida SDS utilizando un 4-12% geles de gradiente Bis-Tris en el Sistema Criterio BioRad y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). a continuación, las membranas fueron bloqueadas durante 1 h a temperatura ambiente con leche no grasa al 5% en solución salina Tris tamponada con con 0,2% de Tween-20 seguido de incubación con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante, y detección por reacción quimioluminiscente con el sistema de detección ECL Plus Western Blotting o ECL Kit de antemano Western Blot Detección (GE Healthcare Life Sciences, tipo de letra pequeño desafíos, Reino Unido). Las imágenes fueron capturadas en un sistema ChemiDoc XRS Imaging (BioRad Hercules, CA, EE.UU.) y los análisis densitométricos de las bandas de proteínas detectadas se realizaron con el software de imagen-J (NIH)
Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes:. Anticuerpo monoclonal HIF-1a, policlonal anti-p53 y policlonal anti-actina y los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Monoclonal anti-ciclina D1 fue de Señalización Celular (Beverly, MA, EE.UU.).
La proliferación celular
Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (4.000 células /pocillo) y se trataron con CoCl
2 como se describe anteriormente. Después de 48 h de tratamiento, las células se expusieron durante 72 h a diferentes dosis de 5-fluorouracilo o la proliferación de células oxaliplatino y se ensayó usando el Kit XTT ensayo de proliferación celular (Roche, Basilea. Suiza) siguiendo las instrucciones del fabricante. Durante el ensayo, la sal XTT tetrazolio se reduce a un colorante de color naranja de formazán por las deshidrogenasas y enzimas reductasas en las células metabólicamente activas, que se detectó espectrophotometrically (450 a 655 nm) utilizando un lector de microplacas ImarkTM (Biorad, Hercules, CA, EE.UU.). En cada ensayo, la proliferación celular se expresó como el porcentaje de células no tratadas.
análisis del ciclo celular
Las células (0,5 a 1 × 10
6 células) se tripsinizaron y se resuspendieron en PBS. Ice-frío 100% de etanol se añadió de una manera gota a gota mientras que suavemente vórtex y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 100 x g durante 5 minutos, se resuspendieron en PBS que contenía 50 mg /ml de yoduro de propidio, más 100 mg /ml de RNasa A y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Análisis y medición de la fluorescencia de yoduro de propidio se llevaron a cabo en un citómetro (BD Biosciences) citómetro de flujo.
inmunofluorescencia análisis
Para la tinción DAPI, se permeabilizated y fijaron mediante incubación con 50% de metanol durante 5 células minutos a temperatura ambiente, seguido de 100% de metanol durante 20 minutos a -20 ° C. Luego, las células se incubaron de nuevo con 50% de metanol durante 5 minutos a temperatura ambiente y finalmente se mantuvieron en PBS. En este punto, se incubaron las células con 2 mM 4 ', dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente para la tinción fluorescente de contenido de ADN. Las células se mantuvieron en PBS y se observaron con un microscopio de fluorescencia (Nikon, Tokio, Japón). Las imágenes obtenidas fueron digitalizados y el área nuclear se cuantificó usando el software de imagen-J (National Institutes of Health).
El análisis de la poliploidía por hibridación in situ fluorescente (FISH) se realizó en el laboratorio de Genética Molecular del Hospital Reina Sofía utilizando el kit AneuVysion (Abbott Molecular, Inc./Vysis, Downers Grove, IL) siguiendo el protocolo recomendado estándar. Las células se centrifugaron a 100 xg durante 10 minutos y se incubaron en tripsina-EDTA durante 20 minutos en un baño de agua 37 ° C. Entonces, el sedimento celular se centrifugó de nuevo durante 5 minutos, y se incubó en 0,56% de KCl durante 20 minutos a 37 ° C. Después de la adición de unas gotas de solución de Carnoy (ácido acético methanol:glacial [03:01]), las muestras se centrifugaron, se resuspendieron y se mantuvieron en solución de Carnoy a 4 ° C durante al menos 30 minutos o hasta que esté listo para llevar a cabo FISH. El sobrenadante se descartó y las células se diluyeron en 200 l de solución de Carnoy. Las células fueron manchadas en dos áreas en el mismo portaobjetos, un área para la hibridación con sondas LSI (21 y 13), y la otra zona para la hibridación con sondas de CEP (X /Y y 18). Las diapositivas fueron cubiertos por una cubierta de vidrio y se introducen en un sistema de HYBrite (Abbott) durante la noche, con una temperatura de fusión de 74 ° C durante 5 minutos, seguido de la hibridación a 27 ° C durante 20 h. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron con una solución de lavado (0,4 x SSC /03% de NP-40) a 70 ° C durante 2 min, seguido de 2 x SSC /0,1% NP-40 a temperatura ambiente durante 1 minuto. Por último, los portaobjetos se secaron al aire, por contraste con DAPI, y se analizaron con un microscopio de fluorescencia (Nikon, Tokio, Japón).
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como medias como media ± DE y son representativos de tres experimentos separados. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student de dos colas. Las diferencias se consideraron significativas a p & lt;. 0.05
Resultados
CoCl
2 tratamiento induce la formación de PGCCs en células de cáncer de colon
Cuando HCT-116 y Caco- 2 líneas celulares de cáncer de colon se cultivaron en condiciones normales se observaron esporádicamente algunas células grandes con núcleos agrandados (PGCCs). Sin embargo, cuando las células fueron tratadas con CoCl
2 estos PGCCs claramente aumentaron en número, mientras que las células con morfología normal fueron eliminados selectivamente (Figura 1A). Los PGCCs inducidos por CoCl
2 tratamiento fueron 3-10 veces más grande que las células normales, y con una morfología distintiva dependiendo de la línea celular (Figura 1A). Así, en las células HCT-116 el tratamiento con CoCl
2 PGCCs generados con extensiones citoplasmáticas que recuerdan a las células de tipo neuronal (Figura 1 A), mientras que en células Caco-2 los PGCCs inducidos se redondeada y no tenía ramificaciones (fig. 1A) . El aumento en el tamaño nuclear después del tratamiento también varió entre las dos líneas celulares, y aunque se observó un claro aumento en ambas líneas celulares, la ampliación nuclear fue más pronunciado en el caso de células Caco-2 (Figura 1B).
a) Tanto HCT-116 y de células Caco-2 líneas fueron tratadas con 300 mM CoCl
2 durante 48 horas. Todas las fotomicrografías se obtuvieron utilizando la misma ampliación final (× 200). La barra de escala corresponde a 20 micras. La tinción de los núcleos celulares con DAPI se realizó para evaluar el tamaño nuclear promedio (aumento final, × 200). Las barras de escala corresponden a 20 micras. B) Los cambios en el tamaño nuclear después de CoCl
2 tratamiento. Los datos representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (* P & lt; 0,05, en comparación con el control) guía empresas formación
PGCCs en células de cáncer de colon se asocia con alteraciones del ciclo celular y la poliploidía
para profundizar en los mecanismos responsables de la inducción de PGCCs, el ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. En ambas líneas celulares CoCl
tratamiento 2 causó alteraciones claras en diversas fases del ciclo celular (Figura 2). Se observó una clara reducción en el número de células en fase G1, junto con un aumento de las células en las fases S y G2. Además, el análisis de citometría de flujo confirmó que el tratamiento con CoCl
2 que imita la hipoxia es capaz de generar una subpoblación de células con un alto incremento en el contenido de ADN y por lo tanto corresponde a PGCCs. La naturaleza poliploide de estas células fue confirmada por hibridación in situ fluorescente (FISH) para detectar la presencia de múltiples copias de ADN en PGCCs individuales. Para células Caco-2 FISH análisis arrojado resultados no concluyentes, posiblemente debido a que esta línea celular ya tiene un cariotipo alterado gravemente. Sin embargo, como se puede ver en la Figura 3, mientras que HCT-116 células de control mostraron tamaño nuclear normal y marcadores indican la disomía normal para los cromosomas X (verde), 18 (azul) y 21 (rojo), el tratamiento con CoCl
2, PGCCs inducidas que muestran un tamaño nuclear aumento acompañado de poliploidía para los tres marcadores cromosómicos utilizados.
Tanto HCT-116 (a) y Caco-2 células (B) fueron tratados con las dosis indicadas de CoCl
2 para 6 o 48 horas. A continuación, un análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo. Los gráficos de barras de la derecha muestran los cambios relativos a las células de control en el porcentaje de células en diferentes fases del ciclo celular. Los datos representan la media ± desviación estándar de tres cultivos independientes.
células HCT-116 se cultivaron en presencia de 300 mM CoCl
2 y luego un análisis FISH utilizando sondas para los cromosomas X (verde) , 18 (azul) y 21 (rojo) se llevó a cabo.
mecanismos moleculares implicados en la formación de PGCCs en el cáncer de colon
Una serie de experimentos se llevaron a cabo el próximo para analizar la posible mecanismos moleculares implicados en la generación de PGCCs en células de cáncer de colon. En primer lugar, se analizó la expresión de la proteína HIF-1α para confirmar que el tratamiento con CoCl
2 puede inducir eficazmente su estabilización. Como se muestra en la Figura 4, aunque la expresión de HIF-1α fue indetectable en las células de control, el tratamiento con CoCl
2 inducida en ambas líneas celulares, y de una manera dependiente de la dosis, un aumento en los niveles de expresión de esta proteína . Por lo tanto, el sinóptico de la hipoxia en las células de cáncer de colon está asociado con alteraciones en el ciclo celular y la generación de PGCCs.
) HCT-116 y las células A Caco-2 se trataron con las dosis indicadas de CoCl
2 durante 6 horas y luego la expresión de HIF-1α, p53 y ciclina D1 proteínas se evaluó usando anticuerpos específicos. B) Los análisis densitométrico correspondiente de las bandas de proteína detectadas en las inmunotransferencias y normalizados a la señal de β-actina se muestran también. Los datos son medias ± SD de tres experimentos independientes. (* P & lt; 0,05, en comparación con el control)
Por otro lado, la expresión de ciclina D1 es esencial para el ciclo celular progrese de G1 a la fase S, un punto en la célula. ya se ha comprometido a completar una nueva ronda de división celular. Una vez que la célula "decide" para iniciar esta fase S, los altos niveles de ciclina D1 son downregulated para permitir la síntesis de ADN. Si las condiciones siguen permitiendo el crecimiento celular, niveles de ciclina D1 se incrementan de nuevo durante la fase G2. Sin embargo, si el ciclo celular se ve comprometida en este punto, los niveles de ciclina D1 siguen siendo bajos. Como se muestra en la Figura 4, los niveles más bajos de la ciclina D1 observó en el tratamiento de células HCT-116 o Caco-2 con CoCl
2 también sugirió una detención del ciclo celular en G2, lo que confirma los resultados obtenidos en el análisis de citometría de flujo.
se sabe que p53 juega un papel importante en la regulación de la progresión del ciclo celular en G1 y G2 puestos de control. Específicamente, en respuesta al daño del ADN, la activación de las vías moleculares regulados por p53, conduce a la detención del ciclo celular en G1 [23]. Además, más recientemente se ha informado de que la expresión de una isoforma de p53 que carece de los primeros 39 aminoácidos y denominado p47, está involucrada en la detención del ciclo celular en G2 en respuesta a diferentes condiciones de estrés celular, incluyendo estrés del retículo endoplásmico, la respuesta de proteína no plegada y la hipoxia [24]. Por lo tanto, el próximo analizado la expresión de ambas isoformas de p53 en células de cáncer de colon después del tratamiento con CoCl
2. Como se muestra en la Figura 4, el tratamiento con CoCl
2 no alteró la expresión de p53 completo proteína de longitud (p53FL), pero indujo la expresión de la isoforma truncada (p53 /p47). Estos resultados sugieren que imitan de la hipoxia en las células de cáncer de colon induce la expresión de la isoforma p53 /p47 regulando negativamente la progresión del ciclo celular en G2. Por lo tanto, el papel de p53 /p47 se exploró adicionalmente por tratamiento de las células de cáncer de colon con pifithrin-α (PFT-α), que suprimen específicamente la transactivación mediada por p53. El tratamiento de células Caco-2 con PFT-α causó una citotoxicidad inesperado que impidió posteriores análisis morfológico y ciclo celular. Sin embargo, y como se muestra en la figura 5A, el tratamiento de células HCT-116 con 10 mM PFT-α reducido el impacto de CoCl
2 en el ciclo celular Además, este pretratamiento, que bloquea específicamente la actividad transcripcional de p53, abrogó la formación de PGCCs inducidos por CoCl
2 en células HCT-116 (Figura 5B). Por lo tanto, transcripcionalmente activo p53 /p47 es necesaria para las alteraciones del ciclo celular inducida por la hipoxia y la formación de PGCCs en células de cáncer de colon.
células HCT-116 se trataron con 300 mM CoCl
2 en presencia o en ausencia de 10 mM pifithrin-α (PFT-α), que es un inhibidor específico de la actividad transcripcional de p53. A continuación, un análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo. Representan (A) Datos de la media ± desviación estándar de tres cultivos independientes. (* P & lt; 0,05, en comparación con las células expuestas a CoCl
2 en ausencia de PFT-α), y (b) cambios en la morfología celular se examinaron mediante microscopía visible. Las barras de escala corresponden a 50 micras.
generación
PGCCs en el cáncer de colon está asociado con un aumento en la subpoblación de células madre de cáncer de
Se ha sugerido que la hipoxia genera PGCCs pueden contribuir activamente para el crecimiento del tumor por la generación de células madre cancerosas [19]. Por lo tanto hemos decidido analizar a continuación la formación de colonospheres
in vitro
, que es un ensayo funcional de la capbility autorrenovación de las células madre cancerosas. Con este fin, después de enriquecimiento en PGCCs por tratamiento con CoCl
2 durante 48 h, las células supervivientes se cultivaron a una densidad clonal con medio libre de suero en placas de baja adherencia que impiden la adhesión celular. Bajo estas condiciones, las células tumorales epiteliales diferenciadas mueren por anoikis y solamente una subpoblación de células indiferenciadas tumorales con características madre (células madre cancerosas) sobrevive, que es capaz de generar tumorospheres (colonospheres) en suspensión mediante la auto-renovación. Los experimentos anteriores utilizando manchas fluorescentes lipofílicos se realizaron para confirmar que colonospheres individuales se obtuvieron a partir de células individuales. Por lo tanto, la mezcla de números iguales de Dil (rojo) - células o Dio (verde) itrio antes de realizar el ensayo de formación colonosphere dieron como resultado la formación de esferas que contienen sólo una o la otra etiqueta (Figura S1)
Como se muestra en la Figura 6, el tratamiento previo con CoCl
2 y el enriquecimiento posterior en PGGCs aumentó tanto en HCT-116 y Caco-2 células la capacidad de formar colonospheres, lo que sugiere que la generación de PGCCs contribuye a la expansión de la subpoblación CSC en ambas líneas celulares. A continuación, los colonospheres formados fueron desagregados y la población de células resultante se cultivaron de nuevo a una densidad clonal para la formación de colonospheres secundarias. (Figura 6). Las células derivadas de colonospheres primarios formados por células CoCl
2 tratados de cáncer de colon conservan una mayor capacidad para formar colonospheres, lo que confirma una capacidad de auto-renovación superior. Además, colonospheres secundarios derivados de colonospheres formados por células sometidas a hipoxia fueron significativamente más grandes en tamaño en comparación con las derivadas de las células de control (Figura 7). Este aumento en el tamaño corroboró que las CSC generados en una población de células enriquecida en PGCCs también poseían una mayor capacidad de auto-renovación, y por lo tanto habían más marcadas características stemness [25].
Después del enriquecimiento en PGCCs por tratamiento durante 48 M CoCl
2, las células supervivientes se cultivaron a una densidad clonal con medio libre de suero en placas de baja adherencia y el número de colonospheres formados primarios se evaluó después de siete días. colonospheres primarios fueron desagregados y la población de células resultante se cultivaron de nuevo a una densidad clonal para la formación de colonospheres secundarias. Gráficos muestran los números de (barras grises) primaria y secundaria (barras negras) colonospheres formados por HCT-116 y células Caco-2 después de cada tratamiento. Los datos representan la media ± desviación estándar de tres cultivos independientes. (* P & lt; 0,05, comparado con el control) guía empresas
El ensayo de formación de colonosphere secundaria se realizó tal como se describe en la leyenda de la Figura 6 y en Materiales y métodos. (Aumento final, × 200). La barra de escala corresponde a 10 micras.
La generación de PGCCs en células de cáncer de colon se asocia con la resistencia a 5-fluorouracilo y oxaliplatino
En comparación con los tumores más normoxia, los tumores con un mayor fracción hipóxica son más resistentes a la radioterapia y la quimioterapia [12]. Asimismo, ambos PGCCs [19] como células madre cancerosas [5] se han asociado con la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, la próxima decidido analizar en cultivos de células de cáncer de colon enriquecidas en PGCCs la actividad antiproliferativa de 5-fluorouracilo y oxaliplatino, dos fármacos comúnmente usados en la quimioterapia del cáncer colorrectal. Como se muestra en la Figura 8, los cultivos de células que habían sido enriquecidos en PGCCs por tratamiento con CoCl
2, mostraron un aumento de la resistencia al efecto antiproliferativo de ambos fármacos.
Tanto HCT-116 y Caco-2 las células se preincubaron durante 48 horas en presencia o ausencia de CoCl
2 para el enriquecimiento PGCC y luego se expusieron durante 72 h a diferentes dosis de 5-fluorouracilo (a) u oxaliplatino (B). La proliferación celular se muestra como porcentaje de las células de control no expuestas a los fármacos quimioterapéuticos. Los datos representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (* P & lt; 0,05, en comparación con las células sin CoCl
2 de tratamiento) guía empresas
Discusión
La hipoxia en los tumores tiene larga. ha asociado con un aumento de la agresividad del tumor, peor pronóstico y mayor resistencia a la radioterapia y la quimioterapia [26]. En este estudio hemos demostrado que imitan la hipoxia in vitro mediante el uso de CoCl
2, lo que estabiliza la proteína HIF-1α mediante la inhibición de su degradación, es capaz de generar PGCCs en cultivo celular de cáncer de colon. PGCCs inducidos por el tratamiento con CoCl
2 son estables y poseen la morfología distintiva pero su generación bajo fisiológica
permanece en vivo
condiciones de hipoxia que se determine. En nuestros experimentos, la morfología de PGCCs inducidos por la hipoxia varió entre HCT-116 y células Caco-2 (Figura 1). Esta dependencia de la línea celular coincide con el estudio de Zhang et al [19], donde PGCCs derivados líneas de células tumorales HEY (ovario) y MDA-MB-231 (mama) tenían una morfología de tipo neuronal, mientras que PGGCs derivadas de células SKOV3 (ovario ), mostraron una morfología redondeada sin extensiones citoplasmáticas o ramas. En nuestro estudio, la morfología de las PGCCs derivadas de células HCT-116 coincide con los de EY y MDA-MB-231 células, mientras que los generados en Caco- 2 eran más similares a las descritas para las células SKOV3. Debe hacerse hincapié en que HEY, MDA -MB- 231 y HCT-116 son marcadamente líneas de células invasivas, siendo representativo de la transición epitelio mesénquima proceso (EMT) que sufren algunas subpoblaciones de células tumorales [27]. Por lo tanto, o resultados sugieren que el programa genético que controla EMT en las células tumorales también puede ser un factor importante en la generación de PGCCs con mayor capacidad de infiltración y la difusión.
Nuestros resultados también indicaron que la formación de PGCCs en células de cáncer de colon se asocia con cambios en el ciclo celular y la posterior poliploidía (Figuras 2 y 3). células procariotas y eucariotas unicelulares se dividen por procesos amitotic. En las células eucariotas complejas, aunque prevalece la mitosis, los cambios bien documentados en el ciclo celular mitótico se produce para lograr un crecimiento y desarrollo celular en circunstancias estresantes. Entre estas variaciones es el proceso endoreplication, una variación del ciclo celular mitótico normal, que implica múltiples rondas de replicación del ADN sin la participación de la etapa de la mitosis [28]. células gigantes tumorales observados por los patólogos han sido tradicionalmente consideradas como inerte desde el punto de vista de la repoblación tumor. Sin embargo, los nuevos datos indican que estas células son capaces de generar progenie clonogénico por división asimétrica y en ciernes [19]. Por lo tanto, un proceso ha sido descrito en el que las células escapan a la muerte celular inducida por la catástrofe mitótica al convertirse en PGCCs que, antes de morir, dan lugar a varias células a través de florecimiento nuclear y la citocinesis asimétrica. Este modo de división celular en el cáncer se ha denominado neosis, y se ha relacionado con el origen de las células madre del cáncer [29], [30].