Extracto
Cabeza y cuello cáncer de células escamosas (HNSCC) es el 7
º cáncer más común en todo el mundo. A pesar del desarrollo de nuevos agentes terapéuticos, tales como anticuerpos monoclonales, el pronóstico no cambió para las últimas décadas. plasma atmosférico frío (CAP) presenta la nueva tecnología más prometedor en el tratamiento del cáncer. En este estudio la eficacia de un dispositivo de micro superficie de descarga de plasma (SMD) en contra de dos líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello se probó. Efectos sobre la viabilidad celular, la fragmentación del ADN y la apoptosis de inducción se evaluó con el ensayo MTT, electroforesis microgel alcalina (ensayo cometa) y Anexina-V /PI tinción. ensayo de MTT reveló que el tratamiento CAP disminuye notablemente la viabilidad de las células para todos los tiempos de tratamiento a prueba (30, 60, 90, 120 y 180 s). IC 50 se encuentra a 120 segundos máximos de tratamiento de la PAC. El análisis mostró ensayo cometa un dependiente fragmentación del ADN dosis alta de ser uno de los jugadores clave en la actividad anticancerígena de la PAC. inducción reveló Anexina-V /PI tinción de la apoptosis en líneas celulares PAC tratada HNSCC, pero no se observó ninguna dependencia de la dosis significativa. Por lo tanto, se confirmó que la tecnología SMD plasma es definitivamente un enfoque nuevo y prometedor en el tratamiento del cáncer
Visto:. Welz C, S Emmert, Canis M, Becker S, P Baumeister, Shimizu T, et al. (2015) Fría atmosférica de plasma: una terapia complementaria prometedor para escamosas de cabeza y cuello. PLoS ONE 10 (11): e0141827. doi: 10.1371 /journal.pone.0141827
Editor: Michael Hamblin, el Hospital General de Massachusetts, Estados Unidos |
Recibido: 21 Abril, 2015; Aceptado: October 13, 2015; Publicado: noviembre 20, 2015
Derechos de Autor © 2015 Welz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. el trabajo fue apoyado por la Fundación Friedrich Baur-Stiftung Múnich (GrandNumber 40/13) [http://www.baur-stiftung.de/front_content .php? idCAT = 76]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Aunque los autores J. Zimmermann T. Shimizu y G. Morfill no estaban afiliados a terraplasma GmbH en el momento en que se llevaron a cabo los estudios, el empleo actual representa un interés en competencia financiera percibida como la empresa y sus empleados probablemente se beneficiaría del éxito de la tecnología de plasma atmosférico frío. Por supuesto, lo mismo se aplica a cualquier número de empresas de plasma, para los que la publicación de los resultados de la investigación proporciona una entrada libre, así como la libertad para operar.
Introducción
Cabeza y cuello cáncer de células escamosas (CECC), incluyendo tumores malignos de la cavidad oral, la faringe y la laringe, es el 7
º cáncer más común en todo el mundo contribuye más del 4% del número total de nuevos casos de cáncer en 2012. Esto significa, casi 600.000 nuevos enfermedades son diagnosticados por año en todo el mundo [1]. Para 2014, 55.070 nuevos casos y 12.000 muertes se estiman en los EE.UU.. La tasa de supervivencia promedio de 5 años es del 50%, que se debe principalmente a la alta tasa de metástasis, tumores malignos secundarios y la recurrencia local, especialmente de estos tumores [2]. A pesar de los nuevos enfoques en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello, como los anticuerpos monoclonales la supervivencia global no podría aumentarse esencialmente en las últimas décadas, que pide el desarrollo de enfoques novedosos y tecnologías antitumorales. Debido a sus características, plasma atmosférico frío (PAC) es el desarrollo más prometedor y potencial en esta área.
El plasma puede simplificado ser descrito como un gas ionizado total o parcialmente. plasmas generados sintéticos como el argón plasma ya están establecidas herramientas en medicina [3]. Sin embargo, debido a su alta temperatura (& gt; 10.000 ° C) sólo pueden ser utilizados con fines de ablación o coagulación [4]. Desde hace algunos años plasmas pueden ser generados con una temperatura de iones que está cerca de la temperatura ambiente. Estos llamados plasmas atmosféricos fríos ya han demostrado su eficacia inmensa antimicrobiana en los ensayos clínicos y ha abierto una amplia gama de aplicaciones médicas, especialmente para todo tipo de superficies sensibles al calor y vitales tales como la piel o mucosa humana [5-10].
Además de la aplicación de sustancias antimicrobianas, resultados recientes planteó un potencial antitumoral de la PAC. Los efectos y mecanismos biológicos siguen siendo poco conocidos [11-15]. Algunos autores describen la inducción de la apoptosis por las especies reactivas de oxígeno (ROS) [13,14]. Otros autores explican los efectos de plasma a través de mecanismos tales como necrosis y desprendimiento de las células [12]. Además, algunos estudios han demostrado una influencia sobre el ciclo celular, como la detención del ciclo celular o la inducción de los mecanismos de senescencia por CAP [15,16]. Por otra parte, nuestro grupo de trabajo mostró una restauración de la sensibilidad de las células de glioma quimio-resistentes por CAP [17]. La comparación y la interpretación de los resultados de estas investigaciones diferentes con respecto a la PAC "capacidad anti-cáncer" es muy difícil. Esto también se relaciona con el despliegue de diferentes tecnologías (micro superficie de descarga (SMD), descargando dieléctrica (DBD), chorros de plasma o agujas) y sus aplicaciones. Por lo tanto, la química diferente, la composición y las concentraciones de los productos derivados del plasma, las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, electrones, iones, se investigaron la luz UV y la temperatura. Sin embargo, casi todos los estudios podían ver un efecto antitumoral en muchas células malignas diferentes. Por otra parte, el efecto muestra especificidad para las células tumorales [13-15,18,19].
Subrayando esta hipótesis nuestro grupo de trabajo mostró que el tratamiento de la PAC de las culturas sanas del tejido de la mucosa humana (de la faringe y nasales) induce sólo una ligera citotoxicidad, pero no tiene efectos genotóxicos significativa de hasta 120 segundos de tratamiento con plasma [20].
el objetivo de este estudio fue la evaluación de la eficacia antitumoral de nuestro dispositivo PAC contra dos líneas de células de cáncer de cabeza y cuello escamosas ( OSC-19 y FaDu) y la investigación de los posibles mecanismos que causan este efecto. El enfoque metódico se fijó sobre la citotoxicidad aguda (MTT-Assay), fragmentación de ADN (Comet Assay) y la inducción de apoptosis (AnnexinV /PI). El tratamiento con plasma se realizó mediante un dispositivo de mano y accionado por batería que operaba a la superficie de descarga Micro tecnología (SMD) [21].
Material y Métodos
Cell Culture
la línea celular FaDu, procedente de un cáncer de lengua graduada baja [22], se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). La línea celular OSC 19 obtenido 1989 de un cáncer de hipofaringe está creciendo en vivo como un carcinoma de células escamosas bien diferenciado con una alta tasa de metástasis [23] y se adquirió de JCBR banco de células. OSC 19 células se cultivaron en DMEM /HAM 's células FaDu F-12 (Biochrom AG, Berlín, Alemania) y en DMEM (Biochrom). Ambas líneas celulares también se complementaron con 10% de suero bovino fetal (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) y 10 U /ml de penicilina-estreptomicina (Biochrom). células FaDu se suplementaron adicionalmente con ácidos 1% no esenciales aminoácidos (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y cada 1% de L-glutamina y piruvato sódico (Biochrom). Las células se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO
2 bajo condiciones de humedad.
Tratamiento de plasma
Este estudio se llevó a cabo por el llamado MiniFlatPlaSter®, un dispositivo de mano PAC que utiliza la tecnología de Micro superficie de descarga (SMD) para la producción de plasma en aire [21] (Fig 1). Los detalles del dispositivo y su química del plasma fueron publicados en Welz et al. [20] y Maisch et al. [24]. La Tabla 1 muestra la principal constituye producida por el dispositivo plasma
La concentración de especies reactivas se midió como una función del tiempo.; los valores anteriores son promedios de 1 min.
El electrodo SMD consiste en una placa de vidrio epoxi, que se intercala una capa de lámina de cobre y una rejilla de malla de acero inoxidable. Mediante la aplicación de un alto voltaje de impulso como de 7 kV (pico a pico) con una frecuencia de repetición de 6,75 kHz el plasma se produce de forma homogénea en el lado de la red de malla en el aire ambiente. Por lo tanto, las especies generadas son transportados a las células por difusión. En contraste con dieléctrico Barrera de descarga dispositivos de los (DBD) dispositivos SMD usadas produce corrientes muy bajas (Tabla 1), lo que garantiza una aplicación segura si se aplica in vivo.
Para los experimentos de 5x10
5 células cancerosas eran colocado en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante 24 h horas bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Antes del tratamiento de la PAC, medio de cultivo celular se retiró para que las células caminabas't cubiertos por el líquido. El electrodo de CAP fue construido con un diámetro de 28 mm, de manera que se ajusta exactamente el borde de un pocillo. Esta condición volumen cerrado durante todo el tratamiento CAP confinar las especies producidas (figura 2) en el interior. La distancia entre el electrodo y las células igualó 17,5 ± 0,5 mm. La temperatura en el fondo del pozo no aumentó en más de un grado Celsius después de 180 s de tratamiento de la PAC. Junto con la aplicación por difusión, efectos de la deshidratación de las células se consideran poco probable. Se utilizaron los tiempos de tratamiento de CAP 30, 60, 90, 120 y 180 s. Para descartar los efectos de plasma no específicos (tales como "efectos de secado") como un posible sesgo, un control separado para cada tiempo de tratamiento se llevó a cabo. Esto significa que los controles respectivos se trataron de la misma manera que los experimentos de tratamiento de plasma correspondientes, salvo que las células de control no recibieron un tratamiento de plasma. medio celular se añadió a todos los pocillos inmediatamente después de la exposición de la PAC.
Viabilidad celular /MTT-ensayo
mediciones de citotoxicidad se realizaron utilizando el kit de proliferación celular I de Roche Diagnostics (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el manual de instrucciones. Para monitorear los cambios de viabilidad celular después de diferentes tiempos de tratamiento CAP, como se describe anteriormente, las células tratadas y los respectivos controles se trataron con tripsina y se sembraron a 8000 células /pocillo (100 l) en una placa de 96 pocillos. toxicidad celular se midió 24 h después del tratamiento de plasma de la sustitución del medio de cultivo con 10 l medio de marcaje que contiene 0,5 mg /ml de MTT. Después de 4 h de incubación en una atmósfera humidificada (37 ° C con 5% de CO
2), se añadió solución de MTT-tinción 100 l en cada pocillo, seguido de incubación durante la noche. El colorante formazán púrpura se cuantificó usando un lector ™ ELISA- VERSAmax (Molecular Devices GmbH, Biberach, Alemania) a una longitud de onda de 550 nm. La longitud de onda de referencia corresponde a 690 nm. Cada experimento contenía mediciones por triplicado de la reducción de la viabilidad celular de cada tiempo de tratamiento de plasma. Además, cada experimento se repitió cinco veces (mediciones para cada tiempo de tratamiento n = 15). Las curvas medias de reducción de la viabilidad celular fueron normalizados a la reducción del porcentaje de células vivas, mientras que las células de control se fijaron en 0%.
daños en el ADN /Comet ensayo
Para la cuantificación de daños de ADN después de la diferente se llevó a cabo el tratamiento de la PAC, la evaluación de la electroforesis microgel alcalina (ensayo cometa). Básicamente, el protocolo es capaz de detectar roturas en el ADN de hebra en las células individuales, sitios alcalinos lábil (ALSs) y reparación por escisión incompleta [25].
Para las mediciones, tripsinización se llevó a cabo directamente después del tratamiento CAP por incubación con 1 solución de tripsina /EDTA ml durante 8-10 min. Después de la neutralización y centrifugación (10 min, 900 U /min), se llevaron a cabo el recuento de células y la pantalla de la viabilidad celular mediante la prueba de exclusión con azul de tripano. En cada diapositiva 200.000 células se aplicaron y se cubrieron con 0,5% de agarosa de fusión normal (Biozym) para asegurar la estabilidad de las capas de agarosa. Para la lisis celular los portaobjetos se cubren con solución alcalina durante 1 h (10% de DMSO, 1% de Triton-X, 2,5 M NaCl, 10 mM de Trizma-Base, mM Na 100
2 EDTA y 1% N -lauroylsarcosine sal de sodio) . A continuación, los portaobjetos se colocan en la cámara de electroforesis en gel (Renner, Dannstadt, Alemania) y se incubaron durante 20 min con una solución de tampón alcalino que contiene 300 mM NaOH y 1 mM Na2EDTA a pH 13,2. Después de este período de DNA desenrollado, la electroforesis se inició a 0,8 V cm-1 y 300 mA y se continuó durante 20 min seguido de neutralización (base Trisma, 400 mM, pH 7,5; Merck, Alemania).
Antes del análisis con un microscopio DMLB (Leica, Bensheim, Alemania) tinción de ADN fluorescente se realizó con 75 l de bromuro de etidio (Sigma; [51 mM]). 80 núcleos de las células por portaobjetos (2 diapositivas por tiempo de tratamiento PAC) fueron seleccionados al azar con el patrón y digitalizada con la cámara acoplada CCD monocromo (Cohu Inc., San Diego, CA, EE.UU.).
A la fragmentación de ADN de alta /daño de ADN conduce a una migración más rápida y más en el campo eléctrico, ya que el ADN intacto no migra (Fig 3). DNA-migración se midió por el software de análisis de imágenes Komet ++ (Kinetic Imaging, Liverpool, Reino Unido) mediante el% de ADN en la cola. El ADN de la cola% es una medida de la intensidad de fluorescencia relativa en la cabeza y la cola
.
A no dañado celular OSC-19 con el ADN intacto y sin migración. la fragmentación del ADN conduce a una migración más rápida y más en el campo eléctrico, lo que resulta en una figura con forma de cometa con ADN sin daños en la cabeza y el ADN dañado en la cola (B + C). Cuanto más brillante y más larga es la cola, mayor será el nivel de fragmentación del ADN. células B OSC-19 con una PAC inducida por daño del ADN-moderada. Imagen C Representante de alta fragmentación del ADN.
La apoptosis detección
La inducción de la apoptosis 24 h después del tratamiento de la PAC se investigó con microscopía de fluorescencia utilizando el kit de detección de Anexina V-FITC (PromoKine , Heidelberg). tratamiento CAP y tripsinización se llevaron a cabo como se describe anteriormente. Para los experimentos de 1x10
5 células se volvieron a suspender en 500 l solución soplador de unión y se incubaron durante 5 minutos bajo luz roja con 5 l Anexina V-FITC y 5 l de propidio yoduro (PI). Translocación de phosphatidylserin (PS) desde el interior a la cara externa de la membrana plasmática es una etapa temprana de la apoptosis. Anexina-V es una proteína de unión de fosfolípidos dependiente de calcio con una alta afinidad a PS y por lo tanto puede ser utilizado como un marcador sensible para las células apoptóticas. La combinación de etiquetado Anexina-V con una tinción PI permite la diferenciación entre células necróticas apoptóticas /viables, a principios de apoptosis y tardías (Fig 4). 100 células por tratamiento PAC se contaron y se identificaron las células apoptóticas tempranas y se calcularon los índices.
Los resultados obtenidos por fluorescencia microscopia muestran que las células apoptóticas principios han unido Anexina-FITC a la phosphatidylserin sobre la superficie de la membrana (celular verde) . A medida que avanzaba la apoptosis, la integridad de la membrana de plasma se pierde, y el yoduro de propidio es capaz de unirse al ADN nucleótido, de modo que las células apoptóticas o necróticas finales aparecen en rojo.
El análisis estadístico
A menos que los datos indicados en otras partes se informaron como la media aritmética ± SEM. El software SigmaPlot para Windows versión 12.0 (2011 por Systat Software Inc. CA, EE.UU.) se utilizó para el análisis estadístico. Para calcular la significación estadística de los resultados se utilizó el análisis de medidas repetidas de Friedman de la varianza en los Rangos y todos los procedimientos de comparación múltiple por parejas (Student-Newman-Keuls Método). Las diferencias se consideraron significativamente en los valores de p & lt; 0.05, antes del análisis estadístico.
Resultados
reducción dependiente de la dosis de la viabilidad celular después del tratamiento PAC
La figura 5 muestra la reducción de la viabilidad de las OSC-19 y FaDu cáncer las células después de la exposición de la PAC para los tratamientos de 30, 60, 90, 120 y 180 s en comparación con los controles no tratados. La viabilidad celular se cuantificó usando el ensayo MTT-como se describe en la sección de métodos. Reducción de la viabilidad se fijó a 0% para que los resultados -expresada en negativo por ciento de los control- permiten la comparación visual entre las dos líneas celulares. Para FaDu célula células viabilidad se redujo significativamente en 4,8% (p & lt; 0,05) para un tiempo de tratamiento CAP de 30 s, en comparación con los controles. Un tiempo de tratamiento de 60 s indujo una reducción de 23,4% (p & lt; 0,05) que era estadísticamente significativa en comparación con los controles y 30 años. Los tiempos de tratamiento más largos de 90 s y 120 s se redujo la viabilidad del 43,6%, respectivamente, en un 49,2. En comparación con los controles y los tratamientos anteriores más cortos tiempos de 30 s y 60 s estas reducciones fueron altamente significativas (p & lt; 0,001). Un tiempo de tratamiento de 180s disminuye FaDu viabilidad de 51,4%. En el caso de 90 s y 120 s se trataba de una reducción significativa en comparación con los controles y los tiempos de tratamiento de hasta 60 s (P & lt; 0,05). La comparación de 90, 120 y 180 s no mostró una mayor reducción significativa de la viabilidad celular (p & gt; 0,05).
Para ambas líneas celulares HNSCC la viabilidad disminuye para aumentar los tiempos de tratamiento PAC. Los errores estándar de la media, representados mediante transferencias de bigotes.
Para OSC 19 células viabilidad se redujo en un 20% después de un tiempo de tratamiento de 30 s, y por el 31,2% durante 60 s, respectivamente. Los tiempos de tratamiento más largo (90 s y 120 s) indujeron una mayor reducción de la viabilidad celular en el 51,7% (90 s) y 64,1% (120 s). Todas las reducciones de viabilidad fueron estadísticamente significativas en comparación con los controles no tratados y para los tiempos de tratamiento más cortos anteriores (p & lt; 0,05). 180 s de plomo tratamiento a una reducción adicional de 73,3%, lo que fue significativa en comparación con los controles y con tiempos de tratamiento de hasta 90 s (p & lt; 0,05) guía
inducción de daños en el ADN por. CAP
Para investigar si la reducción dependiente del tiempo en la viabilidad celular y la creciente tasa de apoptosis es causada por daño en el ADN inducido PAC se realizó el ensayo de electroforesis alcalina microgel. Las figuras 6 y 7 muestran el porcentaje de cola-ADN de cada línea celular en detalle.
estándar caja de parcelas (cuartil inferior, la mediana, el cuartil superior) fueron utilizados para ilustrar los resultados. Los puntos denotan valores estadísticos atípicos leves (entre 1,5 y 3 veces rango intercuartil (IQR)); asteriscos denotan valores estadísticos atípicos extremos (más de 3 veces RIC).
estándar caja de parcelas (cuartil inferior, la mediana, el cuartil superior) fueron utilizados para ilustrar los resultados. Los puntos denotan valores estadísticos atípicos leves (entre 1,5 y 3 veces el rango intercuartil (IQR)).
Análisis de experimentos usando la línea celular FaDu (Figura 6) reveló un aumento significativo de daño en el ADN en comparación con los controles (4,2%; p & gt; 0,05) durante 30 s de tratamiento de plasma (4,8% del ADN en la cola). Durante 60 s un aumento significativo del ADN de la cola% (7,6%) en comparación con los controles no tratados (P & lt; 0,05) y la duración de la PAC de 30 s (P & lt; 0,05) se observó. duraciones más largas aumentaron la fragmentación del ADN a 14,8% (90 s), respectivamente, hasta el 17,9% (120 s). En comparación con los controles, 30 s y 60 s de tratamiento CAP este incremento fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). El aumento de daño en el ADN a partir de 90 s 120 s del tratamiento PAC mostró una significación estadística también. CAP duración de 180 s conduce a una fragmentación del ADN más del 20,5% del ADN en la cola. En comparación con los controles no tratados y todos los demás tiempos de tratamiento este incremento de 180 s fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,05).
Para OSC 19 células 30 s del tratamiento con plasma induce una fragmentación del ADN de 4,0%, lo que no fue significativa en comparación con los controles no tratados (3,1%; p & gt; 0,05). Ya el tratamiento de la PAC (60 s y 90 s) indujo un aumento del daño del ADN a 6,5% (60) y el 9,6% (90 s). De manera similar a los experimentos de la línea celular FaDu este aumento mostró una significación (p & lt; 0,05) en comparación con los controles y cada tiempo de tratamiento previo. De hecho, durante 120 s y 180 s se observó un crecimiento adicional de la fragmentación del ADN (9,8% durante 120 s, 12,7% durante 180 s), pero este incremento no fue significativa en comparación con la duración antes de 90 s (p & gt; 0,05). Fig 7 muestra el ADN de la cola% para OSC 19 células en detalle.
CAP apoptosis inducida
Para aclarar si aumento dependiente del tiempo del daño del ADN induce la apoptosis y si la reducción de la viabilidad celular se puede explicar por la muerte celular programada, AnnexinV /PI tinción se realizó 24 h después del tratamiento CAP. Tal como se presenta en las figuras 8 y 9, el tratamiento con plasma induce apoptosis en ambas líneas celulares. 180 s de tratamiento de plasma resultó en un exceso de 4 veces aumento de células apoptóticas tempranas en comparación con los controles (p ≤ 0,002). En detalle, para la línea celular FaDu (Fig 8) el control no tratado mostró un promedio de células apoptóticas 1,9%. Después de un tiempo de tratamiento de CAP 30 es un ligero aumento de la apoptosis (3,6%) se detectó, que fue significativo a los controles (p & lt; 0,01). Después de 60 s un promedio de 5,5% de las células fueron apoptóticas y una duración de 90 s aumentó la tasa de células apoptóticas a 7,3%. En comparación con los controles y para cada tiempo de tratamiento más corto este aumento fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). Los tiempos de tratamiento más largos de 120 y 180 s s mostraron un aumento de las tasas de las células apoptóticas de 8,5%, 7,5%, respectivamente. En comparación con los controles y con tiempos de tratamiento hasta 60 segundos en estas tasas fueron estadísticamente significativas (p & lt; 0,05), pero sin significación se observaron en comparación con los otros y con 90 s (p & gt; 0,05).
Las células no tratadas OSC 19 mostraron un promedio de 2,6% de las células apoptóticas (Fig 9). Para los tiempos de tratamiento de la PAC de 30 s, se detectó un ligero aumento de la apoptosis al 4,4%, pero estos datos no son significativos. Un tiempo de tratamiento CAP de 60 s mostró un promedio de células apoptóticas 5,5%, que es un aumento significativo en comparación con los controles (p & lt; 0,05). El tratamiento de 90 s aumentó la tasa de apoptosis al 5,9% y 120 s a un 6,4%. Ambos duraciones mostraron un aumento significativo de la tasa de células apoptóticas en comparación con las células sin tratar (p & lt; 0,05), pero no se observó significación cuando se compara con los tiempos de tratamiento más cortos. Un tiempo de tratamiento de 180 s indujo 11,3% de células apoptóticas. Este incremento fue estadísticamente significativa en comparación con el control y todos los tiempos de tratamiento previo (p & lt; 0,05).
Discusión
Con ser uno de los agentes más potenciales contra cualquier microorganismo y la prueba de su eficacia en los ensayos clínicos, la PAC medicamento es un tema de investigación en rápido crecimiento y se desarrolla cada vez más importancia en el cuidado de la salud. El tratamiento del cáncer es la nueva aplicación médica más prometedora de la PAC. In vitro y en estudios in vivo en diferentes tipos de tumores reveló efectos fuertes y específicas en las células cancerosas y la inhibición del crecimiento del cáncer [14-16,18,19]. Parece, que CAP puede inducir la detención del ciclo celular y en suficientemente altas dosis causan apoptosis y necrosis en las células cancerosas. Sin embargo, los mecanismos exactos de los efectos de la PAC siguen sin estar claros.
La producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno por CAP se piensa que es un jugador clave del inicio de los efectos antitumorales directos observados. Varias publicaciones sugieren un aumento de los niveles de ROS /RNS intracelulares en el tratamiento de la PAC, induciendo de este modo el daño del ADN y la apoptosis en células tumorales [13,14,26]. Vandamme et al. mostró una dosis dependiendo inducción de la apoptosis después del tratamiento CAP de glioma maligno (U87MG) y carcinoma colorrectal (HCT-116) de las células [14]. La muerte celular por apoptosis también fue explicado como resultado de los efectos de ROS. Además de ROS lesión de ADN inducida por la apoptosis seguido hay datos que describen un citotóxico /efecto necrótico aguda [12]. A la fecha no existen datos que demuestran la eficacia de un dispositivo de plasma generado CAP SMD contra las células de cáncer de cabeza y cuello. Sin embargo, especialmente para los órganos con orificios naturales como la piel y la mucosa del tracto digestivo superior (cavidad oral, orofaringe, partes de la hipofaringe y laringe) CAP presenta opciones de tratamiento altamente potentes para el cáncer de cabeza y cuello. Además nuestro dispositivo SMD de mano, la generación de plasma en el aire circundante puede alcanzar HNSCC por difusión evitando al mismo tiempo un flujo de gas portador o gas. Por lo tanto, la hipótesis de que nuestro dispositivo puede inducir un tiempo de tratamiento en función de la muerte celular en las líneas celulares CECC.
El ensayo de viabilidad celular mostró que el CAP tenía una actividad antitumoral significativa en FaDu y 19 OSC-líneas celulares con una IC
50 de 120 seg (FaDu) y 90 seg tiempo de exposición (OSC-19). En las líneas celulares OSC-19, la duración de 180s condujo a la muerte celular de 75%. Estos resultados están en línea con varios estudios, que mostraron una actividad antitumoral de la PAC en diversas líneas de células malignas como el melanoma, glioma, hepatocelular y carcinoma colorrectal [11,13,14,27-30]. En comparación, nuestras investigaciones en cultivos de células de la mucosa sanos con el mismo dispositivo y en las mismas condiciones experimentales mostraron sólo una reducción de la viabilidad celular de 15% después de 120 s de tratamiento de plasma [20]. En consecuencia hemos demostrado que nuestro dispositivo de plasma SMD es eficaz contra las líneas celulares HNSCC mientras que las células sanas permanecen casi no afectado.
Además de la cirugía, la radioterapia (RT) es la principal modalidad en el tratamiento HNSCC primaria y necesaria para las estrategias adyuvantes [31] . El principal mecanismo para la actividad contra el cáncer, respectivamente, la capacidad de la radioterapia son inducidos por la radiación daños al ADN que inician los cambios del ciclo celular y cascadas de señales que conducen finalmente a la muerte celular. Para evaluar si CAP también es capaz de inducir daño en el ADN en las células HNSCC, que podría ser responsable de una reducción de la viabilidad dependiente del tiempo de tratamiento, se realizó la técnica de electroforesis microgel alcalina (ensayo cometa) que es muy sensible para la detección de ADN solo capítulo rompe (SSB) , doble filamento se rompe (DSBs) y sitios lábiles al álcali (ALSs). Debido a SSB y /o ALS ocurren más propensas que los OSD y otras alteraciones del ADN, tales como entrecruzamientos de ADN o intercalaciones, la electroforesis mircogel alcalina es muy sensible para la cuantificación de bajos niveles de daño en el ADN, lo que hace que sea superior a otras pruebas de genotoxicidad [25,32] . A pesar de esta alta sensibilidad que tiene que ser mencionado que los mecanismos de reparación del ADN y sus consecuencias sobre la viabilidad de las células, no son considerados por este método Nuestra prueba observó un momento significativo del tratamiento, la dosis, respectivamente aumento dependiente de daños en el ADN en ambas líneas celulares HNSCC. En comparación con la exposición de cultivos de tejidos de las mucosas saludables para tapa [20], una hasta cuatro se detectó fragmentación de ADN veces en las células cancerosas. Por lo tanto nuestros resultados muestran que CAP o sus productos interactúan con el ADN de las líneas celulares HNSCC, y es capaz de inducir daño en el ADN letal, que puede explicar la actividad contra el cáncer dependiente de la dosis de nuestro dispositivo plasma SMD.
Para la evaluación si dosis daño en el ADN dependiente induce apoptosis y si la reducción dependiente del tiempo de tratamiento de la viabilidad celular es el resultado de un proceso de apoptosis, se realizó la tinción de AnnexinV /PI. Después de 60 s tiempo de tratamiento y más tiempo, nuestro dispositivo CAP indujo la muerte celular apoptótica en ambas líneas celulares en comparación con los controles no tratados. Sin embargo la comparación de los tiempos de tratamiento por separado, no hubo un aumento dependiente de la dosis significativa de las células apoptóticas. Solamente los largos tiempos de tratamiento de dosis altas de plasma correspondientemente indujeron una alta tasa de apoptosis en la línea celular OSC-19 que está de acuerdo con los resultados de Arndt et al. En ese estudio, que se llevó a cabo con el mismo dispositivo de plasma se utilizó (MiniFlatPlaSter®), y por lo tanto tenía el mismo física del plasma y composiciones químicas, los tiempos de tratamiento de 120 s induce daño del ADN y un fuerte aumento de la apoptosis en líneas celulares de melanoma. En caso de tiempos de tratamiento más cortos se observó casi ningún tipo de células apoptóticas pero puso de manifiesto una inducción de la senescencia [16].
Nos volveríamos a hacer hincapié en que la comparación de diversos experimentos llevados a cabo con diferentes dispositivos de la PAC es difícil debido a la diferente PAC parámetros y diseños, es decir, la tecnología de DBD, la tecnología SMD, entrada de potencia, tensión, frecuencia, etc. gas portador que resulta en diferencias relevantes en la producción de sus componentes. Pero los experimentos llevados a cabo con el dispositivo de plasma igual también conducen a resultados divergentes cuando se apuntan diferentes líneas de células malignas (/no maligno). Sin embargo un efecto citotóxico selectivo en las células de cáncer se está convirtiendo en correlación con los resultados de diversos experimentos de CAP en las células malignas [14,15,18,19]. El mecanismo de esta selectividad sigue siendo poco clara. Pero en nuestras investigaciones sobre las células epiteliales, la PAC parece tener similitudes con los mecanismos contra el cáncer de la radiación, con mostrar un alto daño en el ADN y la muerte celular en células de cáncer de alto proliferantes, mientras que bajo la proliferación de tejido de la mucosa sana parece estar menos afectada por el mismo tratamiento . Sin embargo la reivindicación selectividad con respecto a las células y tejidos sanos HNSCC, investigaciones más comparables sobre las células del cáncer de cabeza y cuello y el tejido de la mucosa que se han llevado a cabo [20] .Este es el primer estudio, la evaluación de los efectos de un dispositivo SMD PAC generada en líneas celulares CECC. Se observó una reducción de la dosis dependiente alta de la viabilidad celular, que es causada en parte por inducción de la apoptosis. Además se detectó un tiempo de tratamiento en función de alta fragmentación del ADN, que es probablemente el jugador clave en relación con la muerte de células de cáncer. Con estos resultados se confirmó que la tecnología de plasma SMD es un nuevo enfoque muy prometedor en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello.
Apoyo a la Información
S1 Archivo. Los datos en bruto
doi:. 10.1371 /journal.pone.0141827.s001 gratis (XLSX)
S2 Archivo. Estadística de
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