Extracto
El sulindac es un fármaco anti-inflamatorio no esteroideo aprobado por la FDA con actividades contra el cáncer documentados. Nuestros estudios recientes demostraron que sulindac mejora selectivamente la muerte de las células cancerosas expuestas a agentes oxidantes a través de la producción de especies de oxígeno reactivas (ROS) que resultan en la disfunción mitocondrial. Este efecto de sulindac y el estrés oxidativo en las células de cáncer puede estar relacionado con el defecto en la respiración en las células cancerosas, se describe primero por Warburg hace 50 años, conocido como el efecto Warburg. Hemos postulado que sulindac puede realzar la destrucción selectiva de las células cancerosas cuando se combina con cualquier compuesto que altera la respiración mitocondrial. Para probar esta hipótesis hemos utilizado dicloroacetato (DCA), que es conocido para cambiar el metabolismo de piruvato lejos de la formación de ácido láctico a la respiración. Se podría esperar que el DCA, ya que estimula el metabolismo aeróbico, podría insistir en la respiración mitocondrial en las células cancerosas, lo que resultaría en mayor eliminación en presencia de sulindac. En este estudio, hemos demostrado que la combinación de sulindac y DCA mejora la destrucción selectiva de las células A549 y de cáncer de SCC25 en las condiciones utilizadas. Como se predijo, el mecanismo de matanza implica la producción de ROS, la disfunción mitocondrial, la señalización de JNK y la muerte por apoptosis. Nuestros resultados sugieren que la combinación de drogas sulindac-DCA puede proporcionar una terapia eficaz contra el cáncer
Visto:. Ayyanathan K, S Kesaraju, Dawson-K Scully, Weissbach H (2012) Combinación de Sulindac y dicloroacetato cáncer mata a las células a través de Daño oxidativo. PLoS ONE 7 (7): e39949. doi: 10.1371 /journal.pone.0039949
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Agosto, 2011; Aceptado: 4 Junio 2012; Publicado: 17 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Ayyanathan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Ofrecer ayuda financiera de los Institutos nacionales de Salud para KA (subvención 5K01CA95620) y HW (subvención R15 CA122001) y del Estado de Florida para HW (SURECAG subvención R94007) para llevar a cabo este trabajo se agradece. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Sulindac es un no esteroide anti-inflamatorio aprobado por la FDA (NSAID), que también se ha demostrado que tienen actividad contra el cáncer [1] - [6]. Estudios recientes de nuestro laboratorio han demostrado que la RKO, líneas de células cancerosas A549 y SCC25 exhibió sensibilidad hacia una combinación de sulindac y un agente oxidante, tal como TBHP o H
2O
2 [7]. Los datos indicaron que el efecto sulindac no estaba relacionada con su actividad AINE sulindac, pero que producen las células cancerosas sean más sensibles al estrés oxidativo que resulta en la disfunción mitocondrial y la pérdida de viabilidad. En contraste, las células normales no mostraron mayor eliminación en condiciones similares [7]. En los últimos 10 años ha habido informes aislados de matar el cáncer mejorada utilizando sulindac en combinación con una variedad de compuestos que incluyen trióxido de arsénico, bortezomib, difluorometilornitina (DFMO) y el ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) [8] - [14]. Aunque estos compuestos tienen diferentes sitios de acción, un mecanismo común para la mayor eliminación combinación sulindac /fármaco podría implicar daño oxidativo, como se demuestra claramente en nuestros estudios anteriores utilizando sulindac y un agente oxidante [7], [15]. De hecho, ROS se han implicado en los estudios utilizando sulindac en combinación con trióxido de arsénico, bortezomib y SAHA [10], [12], [14].
Nuestros resultados anteriores sugieren que la mayor eliminación de las células cancerosas por la combinación de sulindac y un agente oxidante podría ser debido a un defecto en la respiración en las células cancerosas, como se describe primero por Warburg hace más de 50 años [16], que observó que las células cancerosas a favor de la glucólisis, no la respiración, para obtener energía, a diferencia de las células normales. Algunas células cancerosas obtienen tanto como 50% de su energía de la glucólisis, mientras que la glucólisis en las células normales representan menos del 5% de las necesidades de energía [16]. Para obtener una prueba más de las posibles funciones de la respiración alterada y ROS en la muerte de las células cancerosas al sulindac y el estrés oxidativo, hemos iniciado estudios con ácido dicloroacético de sodio (DCA). DCA es un candidato ideal, ya que es conocida para inhibir una quinasa que regula negativamente la actividad de la piruvato deshidrogenasa, lo que resulta en un cambio de metabolismo del piruvato lejos de la formación de ácido láctico, hacia la respiración [17], [18]. DCA se ha utilizado clínicamente para tratar a pacientes con acidosis láctica [19], y en base a sus propiedades bioquímicas DCA también ha sido probado como un agente contra el cáncer. Capo et al. 2007 han demostrado que el DCA invierte el efecto Warburg en las células cancerosas mediante la reorientación de metabolismo de las células del cáncer de la glucólisis a la fosforilación oxidativa. En estos estudios previos se demostró que DCA aumenta los niveles de ROS de I. Este complejo a su vez desencadena "remodelación" del metabolismo mitocondrial (reduce ΔΨm, abre poro de transición mitocondrial) en células de cáncer empujándolos hacia la apoptosis. Además, varios estudios recientes han verificado que DCA puede aumentar los niveles de ROS en células de cáncer y despolarizar la membrana mitocondrias en el pulmón, endometrio, y líneas celulares de glioblastoma que resulta en apoptosis tanto
in vitro
y
in vivo
[18], [20] - [22]. De interés fue la observación de que en las condiciones utilizadas DCA no parece afectar significativamente el metabolismo mitocondrial o la viabilidad de las células normales [18], [23].
Sobre la base de nuestras observaciones anteriores sobre el cáncer de efecto de sulindac matando y un agente oxidante que afecta el metabolismo mitocondrial [7], que postula que la combinación de sulindac y DCA podría potenciar sinérgicamente matar el cáncer y tienen un importante valor terapéutico. En el presente estudio hemos examinado el efecto del uso de sulindac en combinación con DCA sobre la viabilidad de A549 y las líneas celulares de cáncer de SCC25. También hemos estudiado el papel de la función mitocondrial y la apoptosis en el cáncer de matar observado con esta combinación de fármacos.
Materiales y Métodos
Materiales
El sulindac, N-acetilcisteína y Tiron fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). sal de sodio DCA se obtuvo de Acros Organics (Geel, Bélgica). H2DCFDA y JC-1 se adquirieron de Molecular Probes (Eugene, OR). reactivo de ensayo de MTS y Kit Deadend Tunel se obtuvieron de Promega (Madison, WI). Citosol /kit de fraccionamiento de las mitocondrias y el CBA077 InnoCyte ™ citometría de flujo citocromo
c
kit de lanzamiento eran de Calbiochem, Gibbstown, Nueva Jersey. Todos los medios de cultivo celular, suero bovino fetal, y otros suplementos tales como penicilina /estreptomicina, glutamina, etc. fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD).
El A549 y células de cáncer de SCC25, células pulmonares normales y queratinocitos epidérmicos humanos se trataron con las concentraciones indicadas de DCA en la presencia o ausencia de sulindac (Sul) durante 48 horas. La viabilidad celular se controló mediante el ensayo de MTS como se menciona en los métodos. La viabilidad celular se expresa como% del control (células no tratadas con sulindac). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM), expresada en% del valor medio de quadruplicates de un experimento representativo. viabilidades celulares se ilustran presencia de células cancerosas A549 (A), las células cancerosas SCC25 (B), las células pulmonares normales (C) y queratinocitos epidérmicos humanos normales (D). ♦, -Sul; ▪, + Sul. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,005, *** p & lt;.
0,0005
Cell Cultura y
Una de pulmón de células línea celular de carcinoma no microcítico (CPNM), A549, el línea de células de pulmón humano normal, MRC-5, y una línea de carcinoma de células escamosas lengua derivados, SCC25 se adquirieron de ATCC (Rockville, MD) y se mantuvieron en medio F12-K suplementado con 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 100 IU /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina en una atmósfera humidificada, 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C. Queratinocitos epidérmicos humanos normales se obtuvieron de Promocell GmbH (Heidelberg, Alemania) y se mantuvieron en el medio de cultivo recomendado. pasaje temprana, se utilizaron las células normales no inmortalizadas para los experimentos.
El A549 y células de cáncer de SCC25 se trataron con las concentraciones indicadas de DCA en la presencia o ausencia de sulfona de sulindac (Suls) durante 48 horas. Suls se utilizó a una concentración final de 250 mM para las células cancerosas A549 y 75 mM para las células de cáncer de SCC25. La viabilidad celular se controló mediante ensayo MTS como se describe en Métodos. La viabilidad celular se expresa como% del control (células no tratadas con sulindac sulfona). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM), expresada en% del valor de la media de triplicados de un experimento representativo. viabilidades celulares se ilustran para las células cancerosas A549 (A) y células de cáncer de SCC25 (B). ♦, -SulS; ▪, + Suls. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,005, *** p & lt;. 0,0005
células normales
Ensayo de viabilidad celular
El cáncer de pulmón A549 y se sembraron a 3 × 10
3 células por pocillo, mientras que las células de cáncer SCC25 y queratinocitos normales se sembraron a 7,5 x 10
3 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células se cultivaron durante 18-20 horas, el medio se elimina en condiciones asépticas y se reemplaza con medio de cultivo fresco que contiene las combinaciones de fármacos indicados. Donde se indique 500 sulindac mu M se utilizó con el cáncer de A549 y células normales de pulmón y 100 M sulindac fue utilizado con cáncer de SCC25 y células de queratinocitos normales. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora. El medio de cultivo se desechó y las células se enjuagaron a fondo en 1 × PBS. La viabilidad celular se determinó utilizando el CellTiter 96 Aqueous Un Ensayo de proliferación celular (Promega) según las instrucciones del fabricante. El ensayo utiliza un compuesto de tetrazolio que se convierte en un formazán soluble en agua por la acción de deshidrogenasas celulares presentes en las células metabólicamente activas [24]. El formazán se cuantificó midiendo la absorbancia a 490 nm usando un lector de placa de microtitulación colorimétrico (SpectraMax Plus; Molecular Devices). absorbancia de fondo se sustrajo de cada muestra.
Medición intracelular de ROS
El A549 y líneas celulares de cáncer de SCC25 se sembraron que el anterior. Tras el tratamiento farmacológico de 48 horas, las células fueron incubadas con 50 M de diacetato dichlorodihydrofluorescein (H
2DCFDA, Molecular Probes) en el indicador de medio libre durante 30 minutos a 37 ° C. Las células se enjuagaron con PBS y los niveles de ROS se visualizaron por microscopía de fluorescencia. Las imágenes fueron capturadas utilizando el software Qcapture y serán tratados en Adobe Photoshop. El análisis de imágenes se realizó utilizando el software Slidebook. Los datos obtenidos de un experimento representativo se utilizaron para la cuantificación de células DCF-positivos como se mide por la fluorescencia verde debido a DCF oxidado.
Los paneles superiores (A) ilustran los resultados para las células cancerosas A549 mientras que los paneles de fondo ( B) representan los resultados para las células cancerosas SCC25. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de los fármacos y se procesaron para microscopía de fluorescencia como se describe en los métodos. La extensión de los niveles de ROS intracelulares se ilustran como intensidad de fluorescencia verde observado en células tratadas con no hay drogas (sub-paneles A1 y B1), sulindac solo (sub-paneles A2 y B2), DCA solo (sub-paneles A3 y B3) y sulindac y el tratamiento de combinación de DCA (sub-paneles A4 y B4). Varios campos independientes fueron photomicrographed y se muestran campos representativos para cada condición.
se determinó JC-1 tinción de Seguimiento membrana mitocondrial potencial
potencial de membrana mitocondrial utilizando el colorante JC-1 ( Molecular Probes). Las líneas de células cancerosas A549 y SCC25 se sembraron que el anterior. Tras el tratamiento farmacológico de 48 horas, las células se incubaron con 5 ng /ml de JC-1 tinte en indicador de medio libre durante 30 minutos a 37 ° C. Las células se enjuagaron con PBS y se visualizaron por microscopía de fluorescencia. mitocondrias normales toman activamente JC-1 de colorante de una manera dependiente del potencial y forman J-agregados, lo que da una fluorescencia roja. La interrupción y la posterior pérdida de potencial de membrana mitocondrial conduce a un aumento de fluorescencia verde en el citosol, debido a monomérica JC-1, que se determina siguiendo la aparición de fluorescencia verde usando un filtro FITC (Zeiss microscopio invertido Axiovert-40 CFL). captura de imágenes, el procesamiento y análisis se realizaron como anteriormente. Los datos obtenidos de un experimento representativo se utilizaron para la cuantificación de células positivas JC-1-verdes.
Los paneles superiores (A) ilustran los resultados para las células cancerosas A549 mientras que los paneles de fondo (B) muestran los resultados para SCC25 Células cancerígenas. membrana pérdida potencial mitocondrial se detectó por un cambio en la distribución de JC-1 resulta en un aumento en la fluorescencia verde (ver Métodos). Las condiciones experimentales para JC-1 tinción y microscopía de fluorescencia se explican en detalle en los métodos y los regímenes de tratamiento de drogas se representan debajo de los paneles. Las células no tratadas (sub-paneles A1 y B1), las células tratadas con sulindac (sub-paneles A2 y B2), las células tratadas con DCA (sub-paneles A3 y B3), y las células tratadas con sulindac y DCA (sub-paneles A4 y B4). Varios campos independientes fueron photomicrographed y se muestran campos representativos para cada condición.
Efecto de ROS carroñeros sobre la viabilidad celular en presencia de sulindac y DCA
El A549 y líneas celulares de cáncer SCC25 se sembraron como se describió anteriormente. Para limpiar ROS, se añadieron o bien 2 mM N-acetilcisteína (NAC) o Tiron 2 mM (4,5-dihidroxi-1,3-bencenodisulfónico sal disódica del ácido) junto con sulindac y DCA durante 48 horas a 37 ° C. La viabilidad celular se controló mediante el ensayo MTS y el análisis estadístico realizado como se mencionó anteriormente.
tinción TUNEL de Seguimiento Las células sometidas a la apoptosis
ensayo TUNEL se realizó en placas de 96 pocillos usando el kit de ensayo colorimétrico tunel DeadEnd (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante. El A549 y las líneas celulares de cáncer de SCC25 se sembraron como anteriormente y se trataron durante 48 horas con ningún fármaco, sulindac, DCA, o combinación de fármacos. Con posterioridad al tratamiento con fármacos, las células se fijaron con formalina y se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 en PBS. Las células se incubaron con transferasa recombinante terminal de desoxinucleotidil (TdT) y los nucleótidos biotinilados. peroxidasas endógenas se bloquearon con 0,3% H
2O
2 antes de la incubación con peroxidasa de rábano-estreptavidina (HRP-estreptavidina) que se une a los nucleótidos biotinilados incorporados en el mellado termina presente en células que experimentan apoptosis. células marcadas HRP-estreptavidina se detectaron por peróxido de hidrógeno y diaminobencidina (DAB). Las células que muestran tinción nuclear marrón oscuro son indicativos de la apoptosis.
Las células cancerosas A549 y SCC25 se trataron con las concentraciones indicadas de DCA en ausencia (barras grises) o presencia de sulindac (barra de color negro) o presencia de sulindac y N-acetilcisteína (barra rayada) durante 48 horas. La viabilidad celular se controló mediante el ensayo de MTS como se menciona en los métodos. La viabilidad celular se expresa como% del control (células no tratadas con sulindac). Las barras de error son el error estándar de la media (SEM), expresada en% del valor medio de quadruplicates de un experimento representativo. La inhibición del crecimiento de células de cáncer se produjo de una manera dependiente de la dosis durante el tratamiento de combinación de DCA y sulindac (barras negras) tanto en el cáncer A549 (A) y células de cáncer de SCC25 (B). Sin embargo, esta mayor eliminación fue impedido cuando N-acetilcisteína estuvo presente con el tratamiento de combinación de drogas (barras a rayas en A y B).
Análisis Western Blot
Las células fueron cultivadas a 70 % de confluencia, se tratan con drogas especificados para las duraciones indicadas, y las fracciones citosólicas se aislaron utilizando el kit de citosol /mitocondrias fraccionamiento (Calbiochem, Gibbstown, NJ) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se recogieron a diferentes puntos de tiempo y luego se centrifugaron a 600 xg durante 5 min a 4 ° C. Las células sedimentadas se suspendieron en el tampón suministrado y se incubaron durante 10 min en hielo. Después las células se homogeneizaron usando un douncer vidrio y el homogeneizado se centrifugó a 700 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar los núcleos y restos celulares. El sobrenadante se centrifugó a 10, 000 × g durante 30 min a 4 ° C para obtener el pellet mitocondrial y el sobrenadante se consideró como la fracción citosólica. La concentración de proteína se determinó usando un ensayo de Bradford estándar.
Sesenta microgramos de proteína total se cargaron y se separaron en un 4-12% de geles NuPage Bis-Tris (Invitrogen, Eugene, OR) y se transfirieron a una membrana de PVDF que fue sondeado por los anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios, JNK, pJNK, citocromo
c
, y PARP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), se usaron a una dilución 1:1000. ß-actina, (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, California), se utilizó a una dilución 1:4000. Peroxidasa de rábano picante conjugado con anticuerpos secundarios se utilizaron y las bandas se visualizaron usando un método de quimioluminiscencia (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Los paneles superiores (A) ilustran los resultados para las células cancerosas A549 mientras que los paneles de fondo (B) representar los resultados para las células cancerosas SCC25. La extensión de las células sometidas a apoptosis se monitorizó mediante tinción TUNEL de células tratadas con no hay drogas (sub-paneles A1 y B1), sulindac solo (sub-paneles A2 y B2), DCA solo (sub-paneles A3 y B3), y sulindac y DCA (sub-paneles A4 y B4). Las células se trataron con los fármacos indicados como se menciona en los paneles, sometidos a tinción TUNEL, y procesadas para microscopía fluorescente, como se describe en los métodos. Varios campos independientes fueron photomicrographed y se muestran campos representativos para cada condición. células teñidas de color marrón son indicativos de apoptosis en las células.
ADN de la Escala de ensayo basado en la PCR mediada por ligación de Seguimiento de Extensión de la apoptosis en las células
Para confirmar el alcance de la apoptosis, ligation- ensayo de laddering mediada por PCR basada en el ADN nucleosomal se realizó tal como se describe [25]. Las líneas celulares A549 y cáncer SCC25 se sembraron a 5 x 10
4 y 1 × 10
5 células por pocillo en placas de 35 mm. Las células cancerosas A549 se trataron durante 48 horas con una) sin drogas, b) 500 M sulindac, c) DCA 20 mM, y d) 500 M sulindac más DCA 20 mM. Del mismo modo, las células cancerosas SCC25 se trataron con los anteriormente citados cuatro combinaciones de fármacos diferentes, excepto que sulindac y DCA se utilizaron a 100 micras y 10 concentraciones mM, respectivamente. Después del tratamiento, se extrajeron el ADN celular total, se ligó al adaptador construido a partir de 27-mer 5'-GACGTCGACGTCGTACACGTGTCGACT-3 'y 12-mer 5'-AGTCGACACGTGTAC-3'. Después de la ligación, el DNA se calentó para liberar el 12-mer, lleno de Taq polimerasa, se sometió a PCR semi-cuantitativa, y se analizaron en un gel de agarosa al 1,2% junto con marcadores de tamaño.
En situ
localización de citocromo
c fotos: por inmunofluorescencia
Localización intracelular de citocromo
c
se controló mediante inmunofluorescencia utilizando el CBA077 InnoCyte ™ citometría de flujo citocromo
c
Kit de salida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sembraron las células SCC25 a 3,5 × 10
5 células por mm de vidrio 35 plato inferior y tratados con los fármacos indicados para 15 h. Las células se lavaron en 5 ml de 1 × PBS y se permeabilizaron en hielo durante 10 min en 300 l de tampón suministrado. Las células se fijaron a TA durante 20 min en 500 l de paraformaldehído al 4%. Después de lavado y bloqueo, se incubaron las células con 250 l de anticuerpo anti-c citocromo (1:500 dilución) durante 1 hora a RT. Después del lavado, las células se incubaron con 300 l de FITC-IgG (1:300 dilución) durante 1 hora a RT. Finalmente, las células se tiñeron con 300 l de DAPI (1 mg /ml) durante 10 min a TA. Las células se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Olympus. Las imágenes fueron capturadas y procesadas como se ha mencionado anteriormente. Varios campos se analizaron y micrografías representativas que muestran los patrones de localización de citocromo
c
bajo cada condición de tratamiento se obtuvieron. los valores cuantitativos se presentan en el texto.
A. células SCC25 fueron tratadas durante 48 h con sulindac (100 m) y las concentraciones indicadas de DCA y donde se indique 20 mM del inhibidor de JNK, SP600125. ♦, Sin drogas; ▪, sulindac; ▴, sulindac y SP600125. La viabilidad celular se controló mediante el ensayo de MTS como se menciona en los métodos. Las barras de error son el error estándar de la media (SEM), expresada en% del valor medio de quadruplicates de un experimento representativo. Véase el texto para más detalles. El análisis estadístico entre ♦, y además n ▪, Sul; * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,005, *** p & lt; 0,0005. El análisis estadístico entre ▪, Sul y ▴, sulindac y JNKI;
$ p & lt; 0,05,
$$ p & lt; 0,005,
$$$ p & lt; 0,0005. B. representativos transferencias Western que representan el efecto de sulindac y DCA en los niveles totales de JNK, phopsho-p46JNK y phopsho-p54JNK. los niveles de beta-actina se utilizaron como un control interno. fracciones citosólicas de células SCC25 se aislaron en el punto de tiempo de 12 h y los niveles de JNK y fosfo-JNK se determinaron por Western Blot. En la línea celular SCC25, JNK totales mostró dos bandas distintas a los 46 y 54 kDa.
Análisis y Determinación de los índices de combinación estadística
Los datos se presentan como media ± SEM de la célula ensayos de viabilidad. Para el análisis estadístico, el software estadístico Minitab se utilizó para realizar la prueba t de Student y los valores de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Para determinar el efecto sinérgico de sulindac y DCA en A549 y líneas celulares de cáncer SCC25, se realizó un análisis cuantitativo de la relación dosis-efecto para determinar los índices de combinación [26]. Tanto sulindac y DCA se ensayaron solos en A549 y SCC25 células a las concentraciones indicadas. Para las células A549, una proporción de 01:50 se mantuvo durante el sulindac: combinaciones de fármacos DCA que van desde 0,2 mM: 10 mM hasta 1 mM: 50 mM, respectivamente. Para SCC25 células, una proporción de 1:100 se mantuvo durante el sulindac: combinaciones de fármacos DCA que van desde 0,05 mM: 5 mM hasta 0,3 mM: 30 mM, respectivamente. Nuestros resultados experimentales y los valores de índice determinado de combinación se incluyen en el texto.
Resultados
Killing sulindac y DCA Causa mejorada del A549 y las células de cáncer SCC25, pero no las células normales
Para estos estudios se probó la combinación de sulindac y DCA en A549 y células cancerosas SCC25. Las células se incubaron con cada compuesto solo o en combinación durante 48 horas antes de ensayar para la viabilidad (ver Métodos). Una curva de respuesta a la dosis sulindac bajo estas condiciones se indica que las células cancerosas A549 y SCC25 pueden tolerar una concentración máxima de 500 micras y 100 mM de sulindac, respectivamente, sin exhibir cualquier destrucción significativa (datos no mostrados), y estas concentraciones se utilizaron en todo el estudios. DCA, cuando se añade, se usó en concentraciones de 0 a 40 mM, como se indica. Utilizamos estas concentraciones basados en los informes anteriores, lo que indica que por encima de 5 mM se requiere para causar la disfunción mitocondrial en
in vitro
experimentos [27]. Como se muestra en la Figura 1A, DCA solo (sin sulindac) es algo tóxico para las células cancerosas A549, especialmente por encima de concentraciones de 20 mM, pero en presencia de sulindac no se mejora la matanza de estas células a concentraciones por encima de DCA 5 mM. En el caso de las células de cáncer de SCC25 cierta pérdida de viabilidad celular con DCA solo se observó incluso a concentraciones por debajo de DCA 10 mM (Figura 1B). Sin embargo, en presencia de sulindac allí de nuevo un marcado aumento en la muerte celular que era claramente evidente entre las concentraciones de DCA 2 a 10 mM. Anteriormente hemos demostrado que la combinación de sulindac y un agente oxidante fue selectiva para las células cancerosas y no mejoran la muerte de las células normales [7]. Sulindac y DCA también no mejoran la muerte de las células del pulmón y de la piel normales en las condiciones experimentales utilizadas, como se muestra en las figuras 1C y D. Hay que señalar que el MRC-5 (pulmón normal) las células son especialmente sensibles a DCA, como se informó anteriormente [28], por razones que se desconocen.
para comprobar que hubo un efecto sinérgico cuando se utiliza la combinación de fármacos, se determinó el índice de combinación mediante la realización de un análisis cuantitativo de la relación dosis-efecto [ ,,,0],26] en dos líneas celulares de cáncer diferentes (Figura S1). Los índices de combinación eran 0,84 para el A549 y 0,73 para las células de cáncer de SCC25, respectivamente. Un valor inferior a 1,00 indica un cáncer sinérgico efecto letal (Figura S2).
El Efecto sulindac no se debe a su actividad AINE
En estudios previos utilizando sulindac y un agente oxidante se demostró que la mayor eliminación y selectiva de las células cancerosas por sulindac y un agente oxidante no estaba relacionada con la capacidad conocida de AINE sulindac. Para determinar el papel de la inhibición de la COX un metabolito sulindac, sulfona de sulindac, se puede utilizar, ya que no inhibe la COX 1 o 2 [7], [29]. Como se muestra en la Figura 2, utilizando tanto A549 (A) y células de cáncer de SCC25 (B), la combinación de sulindac sulfona y DCA demostró un efecto letal similares como se ve anteriormente con sulindac. Estos resultados indican que el efecto de matar cáncer sulindac mejorada en presencia de DCA no está relacionada con su actividad anti-inflamatoria conocida.
La combinación de sulindac y DCA Generar ROS
El efecto sinérgico sobre viabilidad observada con sulindac y dicloroacetato tanto con células de cáncer de SCC25 A549 y es muy similar a los estudios anteriores utilizando la combinación de sulindac y TBHP [7]. Para determinar si la producción de ROS estaba involucrado en la matanza selectiva observada en el presente estudio, la producción de ROS, usando el colorante indicador H
2DCFDA (ver Métodos), se determinó en las líneas celulares de cáncer expuestas al sulindac y DCA. Los resultados se resumen en la Figura 3. La Figura 3A muestra los resultados con células cancerosas A549. Es evidente a partir de los resultados representados en la figura 3A que las células cancerosas A549 no tratadas (A1 panel), o las células tratadas con sulindac solo (A2 panel), o DCA solo (A3 panel), muestran sólo unas pocas células teñidas positivamente. Sin embargo, cuando las células se expusieron a ambos sulindac y DCA (panel A4), un gran aumento en las células teñidas positivamente para ROS (fluorescencia verde) se ve, lo que demuestra que la presencia de ambos sulindac y DCA resultados en la generación de niveles significativos de ROS. Como se muestra en la Figura 3B resultados similares se observan con las células de cáncer de SCC25. Sulindac o DCA resultado por sí solo en un pequeño aumento en la producción de células ROS (paneles B2 y B3), pero un gran aumento en la producción de ROS se observa de nuevo cuando ambos fármacos se añaden (B4 panel). La cuantificación utilizando SCC25 células muestra que el número de células DCF-positivo (ver Métodos) es 9-10 × más cuando las células se tratan con sulindac y DCA en comparación con cada uno de los fármacos solos (véase la Figura S3A). Se desprende de estos resultados y los estudios anteriores que la producción de ROS puede ser una característica común en la mayor eliminación de las células cancerosas cuando sulindac se utiliza en combinación con compuestos que afectan a la función mitocondrial.
Sulindac en combinación con DCA Resultados en una la pérdida de la membrana mitocondrial potencial
Si la producción de ROS está implicado en el sulindac /DCA mejoradas efecto letal sería de esperar que la producción de ROS por la combinación de fármacos podría afectar la función mitocondrial. Con el fin de determinar esto, el potencial de membrana mitocondrial se midió usando JC-1 tinción como se describe en Métodos. Una pérdida de potencial de membrana se indica por un aumento en la fluorescencia verde tal como se describe en Métodos. Un resultado típico se resume en la Figura 4. Tanto A549 y células de cáncer de SCC25 fueron expuestos a sulindac y DCA ya sea solo o en combinación durante 48 horas y se tiñeron con JC-1 con el fin de controlar el potencial de membrana mitocondrial. La Figura 4A muestra los resultados con la línea celular de cáncer A549. En ausencia de cualquier droga, las mitocondrias parecen intacto y mantienen su potencial de membrana tal como se indica a poco fluorescencia verde (panel A1). En presencia de sulindac solo (panel A2) o DCA solo (panel A3) hay un pequeño aumento en la fluorescencia verde, lo que indica una cierta pérdida de potencial de membrana mitocondrial. Sin embargo, cuando ambos sulindac y DCA están presentes hay una pérdida notable de potencial de membrana mitocondrial como se evidencia por un gran aumento en la fluorescencia verde (panel A4). Se observó el mismo patrón cuando varios campos independientes se analizaron por microscopía de fluorescencia. La figura 4B muestra resultados similares con las células de cáncer de SCC25. Una vez más una importante pérdida de potencial de membrana mitocondrial sólo se observó cuando las células fueron expuestas a ambos sulindac y DCA (panel B4). La cuantificación del efecto se muestra en la Figura S3B. Se puede observar que el porcentaje de células positivas JC1-verde cuando se utilizó la combinación de fármacos es × 3-4 a la observada con cada fármaco por separado.
ROS están implicados en la muerte de las células cancerosas por la combinación de sulindac y DCA
Para proporcionar una evidencia más directa de que el ROS produce participan en la mayor eliminación de las células cancerosas por sulindac y DCA, hemos utilizado dos eliminadores de ROS conocidos, N-acetilcisteína (NAC) y Tiron ( ver Métodos). Los resultados utilizando NAC se muestran en la Figura 5. La Figura 5, panel A, muestra que tanto DCA 20 y 30 mM, la mayor eliminación de las células cancerosas A549 observados en la presencia de sulindac, se impide en gran medida si NAC (2 mM) es presente durante las incubaciones de 48 horas. Resultados muy similares se observan con las células cancerosas SCC25 como se muestra en la Figura 5, se obtuvieron Panel B. Resultados comparables cuando se utilizó Tiron en el lugar de la NAC (figura S4).
El sulindac y DCA destrucción de células de cáncer implica la muerte apoptótica
los resultados anteriores (Figuras 3, 4, 5) muestran que la mayor eliminación de las líneas celulares de cáncer implica la disfunción mitocondrial, lo que sugiere que la muerte celular por apoptosis observada es. Estudios previos han indicado que el sulindac y sus derivados son fármacos pro-apoptóticos [5], [6]. También hay informes de que el DCA puede causar la muerte celular por apoptosis [20], [23]. Para determinar si la muerte de las células cancerosas por la combinación de estos dos fármacos, mediada por ROS, implica la muerte apoptótica se realizó la tinción de TUNEL para medir la apoptosis (ver Métodos). Múltiples repeticiones se ensayaron para sulindac y DCA solo, o en combinación, para los experimentos de tinción de TUNEL.