Extracto
α-tomatina es una glicoalcaloide encuentra en los tomates y la curcumina es un pigmento amarillo principal de la cúrcuma. En el presente estudio, se estudió el efecto combinado de estos dos compuestos en las células de cáncer de próstata. El tratamiento de las diferentes células de cáncer de próstata con la curcumina o α-tomatina solo dio como resultado la inhibición del crecimiento y la apoptosis de una manera dependiente de la concentración. Las combinaciones de α-tomatina y curcumina sinérgicamente inhibieron el crecimiento y la apoptosis inducida en células de cáncer de próstata PC-3. Efectos de la combinación α-tomatina y curcumina se asociaron con la inhibición sinérgica de la actividad de NF-kB y un potente disminución en la expresión de su gen aguas abajo Bcl-2 en las células. Por otra parte, fuertes disminuciones en los niveles de fosfo-Akt y fósforo-ERK1 /2 se encontraron en células PC-3 tratadas con α-tomatina y curcumina en combinación. En experimentos con animales, los ratones SCID con PC-3 xenoinjertos de tumores fueron tratados con α-tomatina y la curcumina. Combinación de α-tomatina y curcumina más potentemente inhibió el crecimiento de tumores PC-3 que cualquier agente solo. Los resultados del presente estudio indican que la α-tomatina en combinación con la curcumina puede ser una estrategia eficaz para inhibir el crecimiento del cáncer de próstata
Visto:. Huang H, Chen X, Li D, Y Él, Li Y, du Z, et al. (2015) Combinación de α-tomatina y curcumina inhibe el crecimiento e induce la apoptosis en células de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 10 (12): e0144293. doi: 10.1371 /journal.pone.0144293
Editor: Hong Wang, Rutgers, la Univesidad Estatal de Nueva Jersey, Estados Unidos |
Recibido: 7 Octubre 2015; Aceptado: 16 de noviembre de 2015; Publicado: Diciembre 2, 2015
Derechos de Autor © 2015 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. la provincia de Guangdong, la concesión de Liderazgo 2011 (http://pro.gdstc.gov.cn/egrantweb/), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, 81272452, 21102020 y 21272043 (http : //www.nsfc.gov.cn/), Instituto Nacional del cáncer, P30-CA072720 (http://www.nih.gov/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los cánceres más comunes en los hombres europeos y americanos y tiene una alta tasa de mortalidad [1]. La mayoría de los pacientes muestran una respuesta inicial a la manipulación hormonal, pero por desgracia la gran mayoría de los pacientes progresan a desarrollar la enfermedad refractaria a las hormonas. Mientras que los nuevos tratamientos de quimioterapia y opciones anti-andrógenos están disponibles para los pacientes con cáncer de próstata independiente de andrógenos, estos agentes poseen una toxicidad considerable y son sólo temporalmente efectiva [2-5]. Por lo tanto, enfoques novedosos y menos tóxicos para el tratamiento del cáncer de próstata sería de gran beneficio para los pacientes.
La curcumina (Figura 1) es un pigmento amarillo de la cúrcuma importante
Curcuma longa Linn
. La cúrcuma es una especia común en las comidas asiáticas y tiene una larga historia de uso medicinal en los países asiáticos. La curcumina tiene numerosas funciones biológicas y farmacológicas, incluyendo contra el cáncer, anti-inflamatorio y antioxidante [6-8]. La curcumina se ha evaluado en ensayos clínicos para el tratamiento de la enfermedad hepática, la artritis reumatoide, las enfermedades infecciosas y el cáncer [9, 10]. A pesar de sus efectos biológicos prometedores en estudios preclínicos, la utilidad clínica de la curcumina se ve disminuida por su pobre biodisponibilidad [11]. Aunque muchos análogos de la curcumina se han desarrollado para mejorar la eficacia terapéutica, la biodisponibilidad y los efectos secundarios tóxicos de estos compuestos necesitan más estudios [12-18]. La combinación de la curcumina con otros agentes contra el cáncer es una estrategia eficaz para mejorar su eficacia contra el cáncer, y de hecho los estudios anteriores han demostrado que las combinaciones de curcumina con otros agentes contra el cáncer han mejorado eficacias contra el cáncer [19-21].
α -Tomatine (figura 1) es una forma natural se produjo glicoalcaloide esteroideos en los tomates (
Lycopersicon esculentum
). Tomates verdes inmaduros contienen hasta 500 mg α-tomatina /kg de peso de fruta fresca. El compuesto se degrada parcialmente como el tomate madura hasta que a los niveles de madurez de tomates rojos son aproximadamente 5 mg /kg de peso fruta fresca [22]. En las plantas, α-tomatina puede proporcionar una defensa frente a hongos patógenos, bacterias y virus [22]. Las actividades contra el cáncer de α-tomatina y sus mecanismos de acción se han estudiado durante los últimos años. Los estudios in vitro demostraron que α-tomatina inhibió el crecimiento de las diferentes células de cáncer humano [23-25]. Estudios recientes también mostraron que la α-tomatina inhibió el crecimiento de tumores de mama y de próstata en ratones [26, 27]. Se encontró una combinación de α-tomatina y paclitaxel para mejorar sinérgicamente la apoptosis de las células de cáncer de próstata humano [28].
Existe un interés creciente en el uso de una combinación de dosis bajas de agentes contra el cáncer que difieren en sus modos de acción en lugar de la administración de un solo agente en una dosis alta. Las combinaciones de agentes contra el cáncer que tienen diferentes mecanismos de acción pueden tener un efecto sinérgico sobre la inhibición del crecimiento y la inducción de apoptosis en células de cáncer de próstata. Aunque el efecto inhibidor de α-tomatina o curcumina en el cáncer de próstata se ha estudiado, ningún estudio ha examinado el efecto combinado de estos dos agentes en las células de cáncer de próstata en cultivo in vitro y se hicieron crecer como xenoinjertos de tumores in vivo. Los estudios demostraron que los efectos de la curcumina y α-tomatina en las células cancerosas se asocia con la inhibición de NF-kappa B activación [7, 17, 24, 26]. La hipótesis de que la combinación de bajas concentraciones de curcumina y α-tomatina se forma sinérgica inhibir la activación de NF-kB que conduce a la inhibición del crecimiento fuerte y la inducción de apoptosis en células de cáncer de próstata. Por tanto, el presente estudio fue diseñado para explorar el efecto de α-tomatina en combinación con la curcumina a bajas concentraciones sobre el crecimiento y la apoptosis en células de cáncer de próstata humano. Se determinaron los efectos de α-tomatina y la curcumina en combinación de NF-kB y vías moleculares relacionados. Nuestro estudio proporciona la primera evidencia de que una combinación de bajas concentraciones de α-tomatina y curcumina inhibió fuertemente las células del cáncer de próstata en cultivo in vitro y se cultiva como xenoinjertos de tumores en ratones inmunodeficientes.
Materiales y Métodos
cultivo de células y reactivos
RWPE-1, LNCaP, VCAP y células PC-3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). La curcumina, α-tomatina, propilenglicol, polisorbato 80, alcohol bencílico, etanol y DMSO fueron de Sigma (St. Louis, MO). Matrigel se obtuvo de BD Biosciences (Bedford, MA). RPMI-1640 medio de cultivo tisular, penicilina-estreptomicina, L-glutamina y suero bovino fetal (FBS) eran de Gibco (Grand Island, NY). células RWPE-1 se mantuvieron en medio de queratinocitos libre de suero (K-SFM; 17005-042) de Gibco (Grand Island, NY). LNCaP, VCAP y células PC-3 se mantuvieron en medio de cultivo RPMI-1640 que contiene 10% de FBS que fue suplementado con penicilina (100 unidades /ml) -streptomycin (100 g /ml) y L-glutamina (300 mg /ml). Las células cultivadas se hicieron crecer a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y se pasaron dos veces a la semana.
Determinación del número de células viables
El número de viable las células después de cada tratamiento se determinó utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio de luz (Nikon Optiphot, Japón). La viabilidad celular se determinó por el ensayo de exclusión de azul de tripano, que se realizó mediante la mezcla de 80 l de suspensión celular y 20 l de 0,4% de solución de azul de tripano durante 2 min. Células azules se contaron como células muertas y las células que no absorben colorante se contaron como células vivas.
Evaluación de células apoptóticas
La apoptosis se determinó por evaluación morfológica de las células teñidas con yoduro de propidio ( PI) [29]. Las células apoptóticas fueron identificados por rasgos morfológicos clásicos, incluyendo la condensación nuclear, contracción celular, y formación de cuerpos apoptóticos [29]. La apoptosis se determinó también por la Anexina V /PI ensayo de doble tinción utilizando fluoresceinisotiocianato (FITC) marcado con Anexina V /kit de detección de apoptosis PI (BD Bioscience, San Jose, CA) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se recogieron las células después del tratamiento, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) dos veces, se tiñeron con anexina V y PI colorantes conjugados con FITC. La externalización de phoshotidylserine y la permeabilidad a PI se evaluaron mediante FACS Calibur citómetro de flujo (BD Bioscience, San Jose, CA). Se recogieron datos de 10.000 eventos por muestra cerradas. Las células en las primeras etapas de la apoptosis se tiñeron positivamente con anexina V. Las células en apoptosis tardía se tiñeron positivamente tanto con anexina V y PI.
Western El análisis de transferencia
Después del tratamiento, se prepararon los lisados de células como se describió anteriormente [30]. Las proteínas se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear los sitios de unión no específicos con tampón de bloqueo, la membrana se incubó durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (# 4051 de fósforo-Akt y#4376 de fósforo-Erk1 /2, tanto de Cell Signaling Co., Beverly, MA; 05 -729 para Bcl-2 de Millipore Co., Billerica, MA). El β-actina se utilizó como control de carga. Después de la eliminación del anticuerpo primario, la membrana se lavó tres veces con TBS (PBS que contiene 0,05% de Tween 20) de tampón a temperatura ambiente y después se incubó con el anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA). La membrana se lavó con TBS tres veces. detección final se realizó con el sistema de imágenes por infrarrojos Li-Cor Odyssey (Li-Cor Biotecnología, Lincoln, NE).
NF-KB dependiente del gen reportero de ensayo de expresión
actividad transcripcional de NF-kB fue medido por el ensayo de expresión del gen indicador NF-kappa B-luciferasa. Un constructo de luciferasa de NF-kB se transfectó de forma estable en células PC-3 y un solo clon estable, PC-3 /N [17], se utilizó en el presente estudio. En breve, PC-3 /N células se trataron con la curcumina o α-tomatina solo o en combinación durante 24 h, y las actividades de NF-kappa B-luciferasa se midieron utilizando los kits de ensayo de luciferasa de Promega (Madison WI, EE.UU.). Después de los tratamientos, las células se lavaron con helado de fosfato tamponada con solución salina (PBS) y se recogieron en tampón de lisis reportero 1 x. Después de la centrifugación, se midieron 10 ml de alícuotas de los sobrenadantes para la actividad luciferasa utilizando un luminómetro Turner de diseños de instrumentos (Sunnyvale, CA, EE.UU.). La actividad de luciferasa se normalizó contra concentraciones de proteínas conocidas y se expresó como porcentaje de actividad luciferasa en las células de control, que fueron tratadas con DMSO disolvente. El nivel de proteína se determinó mediante kits de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
formación y crecimiento de tumores PC-3 en ratones inmunodeficientes
Male inmunodeficiencia combinada severa (SCID) (6-7 semanas de edad) se obtuvieron de Taco Farms Inc (Germantown, NY). Los animales se alojaron en jaulas de filtro microisolator-capsulado estériles y siempre con la comida esterilizada y agua. El cáncer de próstata PC-3 células (2 × 10
6 células /0,1 ml /ratón) se inyectaron en suspensión en 50% de Matrigel (Collaborative Research, Bedford, MA) en medio RPMI 1640 por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones. Después de aproximadamente 4 semanas, los ratones con tumores de xenoinjertos establecidos fueron inyectados con vehículo, α-tomatina (5 mg /kg), la curcumina (5 mg /kg), o α-tomatina (5 mg /kg) + curcumina (5 mg /kg ) una vez cada tres días durante 30 días. Cada grupo tenía 9 ratones y todos los animales recibieron misma cantidad de vehículo (5 l /g de peso corporal) que consistía en propilenglicol, polisorbato 80, alcohol bencílico, etanol y agua (40: 0,5: 1: 10: 48,5). El tamaño del tumor (longitud x anchura) y el peso corporal se midieron cada tercer día. Al final del estudio, se sacrificaron los ratones, los tumores se extirparon, se pesaron y se colocaron en formalina tamponada con fosfato a temperatura ambiente durante 48 h y luego se colocan en etanol durante 48 h antes de preparar secciones de parafina como se describe anteriormente [31]. El estudio de los animales se realizó de acuerdo a las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de Rutgers (RU02-001). Este protocolo aprobado por nuestro presente estudio en animales utilizando el modelo de xenoinjerto en ratones SCID para determinar los efectos de forma natural producido compuestos (α-tomatina y curcumina) sobre el crecimiento de los tumores de próstata.
La inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica de antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) se utilizó para determinar la proliferación de las células del tumor PC-3. En breve, se prepararon secciones de parafina de los tejidos tumorales y se procesaron para la tinción inmunohistoquímica. Las secciones de tumor se incubaron con un anticuerpo PCNA primaria (MAB424, Millipore Corp. de Billerica, MA, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Después se lava con tampón fosfato salino (PBS), las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado durante 30 min seguido de la incubación con peroxidasa de rábano picante solución conjugado-avidina durante 30 minutos utilizando el kit Elite ABC (PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). PCNA tinción en las células tumorales (color marrón en el núcleo) se examinaron con un microscopio (Nikon Optiphot, Nikon, Tokio, Japón). Se contaron al menos 1000 células por cada sección.
análisis estadísticos
El potencial efecto sinérgico de α-tomatina o curcumina se evaluó por el método isobola [32], utilizando la ecuación Ac /Ae + BC /BE = índice de combinación (IC). AC y BC representan la concentración de los medicamentos A y B utilizados en la combinación, y Ae y Be representan la concentración de fármaco A y B que produjo la misma magnitud del efecto cuando se administra solo. Si es CI & lt; 1, entonces se considera que los fármacos para actuar de forma sinérgica. Si el CI es & gt; 1 o = 1, entonces los fármacos actúan en un antagonista o aditivo de forma, respectivamente. Se utilizó el modelo de análisis de varianza (ANOVA) con ajuste de Tukey-Kramer para la comparación de la apoptosis en células PC-3 entre los diferentes grupos de tratamiento, y para la comparación de peso corporal, el tamaño del tumor, peso del tumor y la proliferación de tumores en animales entre los diferentes grupos de tratamiento al final del experimento.
resultados
α-tomatina y curcumina inhiben el crecimiento de células de cáncer de próstata
En los estudios iniciales, los efectos de la α-tomatina o la curcumina sola en diferentes células de cáncer de próstata se determinó. cáncer de próstata humano LNCaP, VCAP (dependiente de andrógenos) y las células PC-3 (independientes de andrógenos) se trataron con diferentes concentraciones de α-tomatina y curcumina para 72 h. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de exclusión de azul de tripano. Como se muestra en la figura 2A, el tratamiento de las diferentes células de cáncer de próstata con α-tomatina resultó en una disminución dependiente de la concentración en el número de células viables. El tratamiento de las células con la curcumina también resultó en una disminución dependiente de la concentración en el número de células viables (Fig 2B). Los efectos de la curcumina y α-tomatina sobre el crecimiento celular fueron similares entre las líneas celulares de cáncer de próstata tres probados. Como se muestra en la figura 2C, α-tomatina y curcumina en combinación tuvieron efecto inhibidor más potente sobre la LNCaP, VCAP y células PC-3. El índice de combinación (IC) para IC
50 se calculó como 0,69, 0,72 y 0,48 para LNCaP, VCAP y PC-3 células, respectivamente. Este resultado indica que la combinación de α-tomatina y curcumina inhibe sinérgicamente el crecimiento de células de cáncer de próstata en cultivo. La curcumina y α-tomatina solo o en combinación tuvieron un pequeño efecto inhibidor sobre el crecimiento de epiteliales de próstata RWPE-1 células no tumorigénicas (Fig 2C).
próstata humano células cancerosas (LNCaP, VCAP y PC-3 ) y no tumorigénicas células epiteliales de la próstata (RWPE-1) se sembraron a una densidad de 0,2 × 10
5 células /ml en placas de cultivo de tejido de 35 mm y se incubaron durante 24 h. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones de α-tomatina y curcumina sola o en combinación para 72 h. Las células viables se determinó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. la viabilidad celular (A) por ciento en las diversas líneas de células tratadas con α-tomatina. la viabilidad celular (B) por ciento en las diversas líneas celulares tratados con curcumina. la viabilidad celular (C) por ciento en las diversas líneas de células tratadas con α-tomatina (1 M) y la curcumina (5 M) solo o en combinación. Cada valor representa la media ± SE de tres experimentos separados.
α-tomatina y curcumina induce la apoptosis en células PC-3
El efecto de α-tomatina y la curcumina en la inducción de la apoptosis en la próstata se determinaron las células de cáncer utilizando la evaluación morfológica y la Anexina V /PI doble tinción. Como se muestra en la Tabla 1, el tratamiento de cáncer de próstata LNCaP, VCAP y células PC-3 con α-tomatina o curcumina resultaron en pequeño aumento en el número de células apoptóticas. Las combinaciones de α-tomatina y curcumina tenían efecto estimulador más potente sobre la apoptosis que cualquier agente utilizado solo. La curcumina y α-tomatina solo o en combinación tuvieron un pequeño efecto en la estimulación de la apoptosis a moderados en epiteliales de próstata células RWPE-1 no tumorigénicas (Tabla 1). El análisis estadístico para la sinergia mostró que α-tomatina y curcumina tenían un efecto más fuerte sinérgico sobre células PC-3 (IC = 0,77) que en las células LNCaP (CI = 0,90) y VCAP (CI = 0,96). Dado que la combinación de α-tomatina y curcumina tenía un efecto sinérgico más fuerte en la inducción de la apoptosis en las células independientes de andrógenos PC-3, se optó por la línea de PC-3 para más
in vitro
y
in vivo
estudios. La inducción de la apoptosis en las células PC-3 tratadas con α-tomatina y curcumina también se determinó en experimentos utilizando el Anexina V /PI doble tinción. En estos análisis, las células en las primeras etapas de la apoptosis se tiñeron positivamente con anexina V, mientras que las células en las últimas etapas de la apoptosis se tiñeron positivamente tanto con anexina V y PI. La figura 3A muestra un resultado representativo de análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la figura 3B, α-tomatina (1 M) o curcumina (5 M) tenían efecto pequeño a moderado en la estimulación de la apoptosis, y la combinación de los dos agentes causaron un aumento sustancial de la apoptosis. El análisis estadístico usando ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Tukey-Krama mostró que el porcentaje de células apoptóticas en el grupo de combinación fue significativamente más alta que en el grupo tratado con α-tomatina (
p
& lt; 0,001) y que en el grupo tratado con la curcumina (
p
& lt; 0,001).
PC-3 células se sembraron a una densidad de 0,5 × 10
5 células /ml en placas de cultivo de tejidos de 100 mm y se incubaron durante 24 h. Las células se trataron luego con α-tomatina y curcumina sola o en combinación para 48 h. La apoptosis se determinó por el ensayo de Anexina V /PI doble tinción utilizando anexina V kit marcado con FITC /PI apoptosis detección y análisis citómetro de flujo. se muestra (A) Representante resultado del análisis de citometría de flujo. (B) Porcentaje de células apoptóticas en fase inicial (izquierda), etapa tardía células apoptóticas (centro) y el total de células apoptóticas (derecha). Cada valor representa la media ± DE de tres experimentos independientes.
Efecto inhibidor de α-tomatina y la curcumina en la NF-kB y su diana aguas abajo de Bcl-2
se utilizó un ensayo de expresión del gen informador de la luciferasa para determinar el efecto de la α-tomatina y la curcumina sobre la activación de NF-kB. PC-3 /N es una línea celular derivada de la transfección estable de células PC-3 con una luciferasa constructo NF-kappa B [17]. PC-3 /N células fueron tratadas con α-tomatina y curcumina sola o en combinación para 24 h. El tratamiento de la /N células con α-tomatina (1-5 M) o curcumina (5-20 mM) 3-PC solo dio lugar a disminuciones en la actividad de la luciferasa en función de la concentración (Figura 4). Concentraciones más bajas de α-tomatina (1 M) o curcumina (5 o 10 mM) tenía pequeños a moderados efectos inhibidores sobre la actividad de la luciferasa, y las combinaciones de α-tomatina (1 M) y la curcumina (5 o 10 mM) tenido mucho más fuerte efectos que cualquier agente solo (Fig 4). El análisis estadístico para la sinergia mostró que α-tomatina y curcumina en combinación tuvieron un efecto sinérgico en la disminución de la actividad de la luciferasa NF-kappa B (CI = 0,56). El efecto de la α-tomatina y /o curcumina en el nivel de proteína anti-apoptótica de Bcl-2, que es un objetivo corriente abajo de NF-kappa B se determinó por el análisis de transferencia de Western. El tratamiento con α-tomatina o curcumina solo tuvo poco o ningún efecto sobre el nivel de Bcl-2, mientras que la combinación tenía un fuerte efecto inhibidor sobre la expresión de esta proteína (Fig 5). La medición de la densidad banda mostró que el nivel de Bcl-2 con respecto al control (1,00) fue de 0,89 en células tratadas con la curcumina, 0,92 en células tratadas con α-tomatina y 0,41 en las células tratadas con la combinación de α-tomatina o curcumina (Fig 5).
PC-3 /N células se sembraron a una densidad de 0,2 × 10
5 células /ml de medio en placas de 12 pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células se trataron luego con α-tomatina solo o en combinación con la curcumina para 24 h. La actividad transcripcional de NF-kB se midió mediante un ensayo de actividad de luciferasa. Cada valor representa la media ± DE de tres experimentos independientes.
Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
5 células /ml en placas de cultivo de 100 mm medio y se incubaron durante 24 h . Las células se trataron luego con α-tomatina o curcumina sola y en combinación durante 24 h (para el análisis de fósforo-Akt y de fósforo-ERK1 /2) y 48 h (para el análisis de Bcl-2). Los niveles de Bcl-2, fosfo-Akt y fosfo-ERK1 /2 se determinaron por el análisis de transferencia de Western. Se midió la densidad de banda y normalizado para la actina.
Efectos de la α-tomatina y la curcumina en el nivel de fosfo-Akt y fosfato ERK1 /2
El nivel de ERK1 activado /2 y Akt en las células PC-3 se evaluó mediante análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti fosfo-ERK1 /2 y fosfato Akt. Tratamiento de PC 3-células con α-tomatina (1 M) dio lugar a una moderada a fuerte disminución en el nivel de fosfo-Akt, mientras que la curcumina (5 M) solo tuvo poco o ningún efecto (Fig 5). Una combinación de α-tomatina y curcumina tenía un potente efecto sobre la disminución del nivel de fosfo-Akt. medición de la densidad de la banda mostró que el nivel de relación fosfo-Akt para controlar (1,00) fue de 0,99 en células tratadas con la curcumina, 0,51 en células tratadas con α-tomatina y 0,26 en las células tratadas con la combinación de α-tomatina y curcumina (Fig 5 ). Tratamiento de PC 3-células con α-tomatina (1 M) o curcumina (5 M) sola dio lugar pequeño para disminución moderada en el nivel de fosfo-ERK1 /2, y la combinación de α-tomatina (1 M) y la curcumina (5 M) provocó una disminución más fuerte en el nivel de fosfo-ERK1 /2 que cualquier agente solo (Fig 5). El nivel de fosfo-ERK1 en relación al control (1,00) como se determina por medición de la densidad banda fue 0,66 en las células tratadas con la curcumina, 0,75 en células tratadas con α-tomatina y 0,31 en las células tratadas con la combinación de α-tomatina y curcumina (Fig 5). El nivel de relación fosfo-ERK2 de control (1,00) fue de 0,58 en células tratadas con la curcumina, 0,69 en células tratadas con α-tomatina y 0,30 en las células tratadas con la combinación de α-tomatina y curcumina (Fig 5).
Efectos de la α-tomatina y la curcumina sobre el crecimiento de tumores PC-3 en ratones SCID
ratones SCID con PC-3 xenoinjertos de tumores fueron tratados con inyecciones ip con vehículo (5 l /g de peso corporal) , α-tomatina (5 mg /kg), la curcumina (5 mg /kg), o α-tomatina (5 mg /kg) + curcumina (5 mg /kg) tres veces a la semana durante 30 días. Como se muestra en la figura 6A, el tratamiento con α-tomatina o curcumina solo tenía un efecto inhibidor moderado sobre el crecimiento de PC 3-tumores mientras que la combinación tiene un efecto potente en la inhibición del crecimiento de los tumores. La media ± S. E. por ciento el tamaño inicial del tumor al final del experimento fue 277,6 ± 18,6 para el grupo de control, 217,3 ± 10,5 para el grupo tratado con α-tomatina, 207,3 ± 15,6 para el grupo de la curcumina tratados, 151.2 ± 9.6 para la combinación tratados grupo. El análisis estadístico usando ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Tukey-Krama mostró diferencias estadísticamente significativas en el tamaño medio del tumor entre el grupo control y el grupo tratado con α-tomatina (
p Hotel & lt; 0,05), entre el grupo de control y el grupo de la curcumina tratados (
p
& lt; 0,01), y entre el grupo control y el grupo de combinación tratados (
p
& lt; 0,001). El tamaño medio de tumor en el grupo de combinación fue significativamente menor que en el grupo tratado con α-tomatina (
p
& lt; 0,05), y que en el grupo tratado con la curcumina (
p
& lt; 0,05).
ratones SCID machos fueron inyectados por vía subcutánea con células PC-3 (2 × 10
6 células /0,1 ml) en suspensión en 50% de Matrigel en medio RPMI. Después de aproximadamente 4 semanas, los ratones con 3 PC-xenoinjertos de tumores (0,6-1,0 cm de ancho y 0,6-1,0 cm de largo) fueron inyectados ip con vehículo, α-tomatina (5 mg /kg de peso corporal), la curcumina (5 mg /kg de peso corporal peso), y una combinación de α-tomatina (5 mg /kg de peso corporal) y la curcumina (5 mg /kg de peso corporal) una vez cada tres días durante 30 días. La tinción inmunohistoquímica de PCNA se hizo para determinar el efecto de los diferentes tratamientos sobre la proliferación de células tumorales. (A) El tamaño del tumor se expresó como porcentaje del tamaño del tumor inicial. (B) el peso (g) de cada tumor se midió al final del experimento en ratones después de sacrificio. (C) El peso corporal se expresa como porcentaje del peso corporal inicial. (D) Porcentaje de células PCNA positivas en los tumores de animales tratados con vehículo, α-tomatina, la curcumina o la combinación de α-tomatina y curcumina. Micrografías representativas de PCNA tinción inmunohistoquímica en tumores del grupo de control (E), el grupo tratado con α-tomatina (F), se muestran el grupo tratado con la curcumina (G) y el grupo tratado con la combinación (H). Las flechas negras indican la tinción de PCNA positivas y flechas blancas indican la tinción de PCNA negativo.
El peso de cada tumor fue también medido en cada ratón al final del experimento después del sacrificio. El peso del tumor de los ratones individuales en cada grupo de tratamiento se muestra en la figura 6B. La media ± S. E. para el peso del tumor (g) fue 0,69 ± 0,05 para el grupo de control, 0,52 ± 0,04 para el grupo α-tomatina tratados, 0,50 ± 0,04 para el grupo de la curcumina tratados, 0,33 ± 0,04 para el grupo de combinación tratados. El análisis estadístico usando ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Tukey-Krama mostró que el peso medio del tumor en el grupo de combinación fue significativamente menor que en el grupo tratado con α-tomatina (
p
& lt; 0,05) y que en grupo tratado con curcumina (
p Hotel & lt; 0,05). Se obtuvo una buena relación entre el tamaño del tumor (medido en animales vivos antes del sacrificio) y el peso del tumor (medida después del sacrificio) en ratones individuales (
r = 0,804
). El efecto de los diversos tratamientos sobre el peso corporal se muestra en la figura 6C. El análisis estadístico usando ANOVA con la prueba de comparación múltiple de Tukey-Krama mostró que las diferencias en el porcentaje de peso corporal inicial entre el grupo control y cualquiera de los grupo de tratamiento no fueron estadísticamente significativas (
p
& gt; 0,05).
efectos de α-tomatina y la curcumina sobre la proliferación de PC 3-tumores
los efectos de la α-tomatina y la curcumina sobre la proliferación de PC 3-tumores se investigaron mediante la determinación de la expresión de antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) en células tumorales. Las secciones en parafina de PC-3 tumores fueron teñidas con anticuerpos PCNA. Como se muestra en la figura 6D, el tratamiento de los ratones con α-tomatina o curcumina sola disminuyó el número de células PCNA positivas en los tumores. El tratamiento combinado con α-tomatina y curcumina tenía un efecto más potente en la disminución del número de células PCNA positivas que cualquier agente utilizado solo (Fig 6D). Las diferencias en el número de células PCNA positivas fueron estadísticamente significativas entre el grupo de combinación-tratado y el grupo tratado con α-tomatina (
p
& lt; 0,01), y entre el grupo de combinación-tratado y el curcumin- grupo tratado (
p
& lt; 0,01). Se encontró una buena correlación entre las células positivas PCNA y el peso del tumor en ratones individuales (
r
= 0,72).
Discusión
A pesar de que estudios anteriores mostraron que la α-tomatina o curcumina células inhibidas de cáncer de próstata [17, 26, 28, 33, 34], los efectos y mecanismos de estos dos agentes en combinación sobre el crecimiento y la apoptosis de las células de cáncer de próstata
in vitro
y
in vivo
no han sido reportados. En el presente estudio, hemos probado la hipótesis de que bajas concentraciones de curcumina y α-tomatina en combinación sinérgica se inhibe la activación de NF-kB que conduce a la inhibición del crecimiento fuerte y la inducción de apoptosis en células de cáncer de próstata. Nuestro estudio demostró que la α-tomatina y la curcumina en combinación sinérgica inhibieron el crecimiento y la apoptosis inducida en células PC-3 con cáncer de próstata, y estos efectos se asociaron con la sinergia de los dos compuestos sobre la disminución de la actividad de NF-kB. Estudios anteriores demostraron que se requiere una mayor concentración de la curcumina para inhibir el crecimiento de células de cáncer de próstata (IC
50 ≈ 20 M) [16, 35]. Sin embargo, la biodisponibilidad de la curcumina es baja [11]. Una estrategia eficaz es la combinación de una baja concentración de curcumina con otro agente anticanceroso. Las combinaciones de dosis bajas de agentes contra el cáncer que funcionan por diferentes mecanismos pueden ser más eficaces con menos toxicidad que los compuestos individuales a niveles de dosis más altos. En nuestro estudio, se encontró que una baja concentración de curcumina (5 M) en combinación con una baja concentración de α-tomatina (1 M) sinérgicamente inhibió el crecimiento de células de cáncer de próstata en cultivo. Además, esta combinación inhibe fuertemente el crecimiento de tumores PC-3 de xenoinjerto en ratones SCID. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe que indica un fuerte efecto combinado de bajas concentraciones de α-tomatina y la curcumina en células de cáncer de próstata.
El factor de transcripción NF-kB es un regulador importante para el crecimiento celular y la supervivencia en una variedad de células incluyendo las células de cáncer de próstata [36-38]. NF-kappa B ha demostrado ser activado de forma constitutiva en el cáncer de próstata invasivo [39-41]. La activación de NF-kappa B está relacionado con la progresión del cáncer de próstata debido a la regulación de la transcripción de sus genes de respuesta [41]. Además, la activación de NF-kappa B predice un alto riesgo de recaída en pacientes con enfermedad localizada [40, 42]. Por lo tanto, NF-KB puede servir como una diana terapéutica para el tratamiento de cáncer de próstata. La curcumina a concentraciones más altas (20-50 M) se muestra para inhibir la activación de NF-kappa B [17, 43].