Extracto
terapia dirigida molecular ha mostrado prometedor como tratamiento para el carcinoma hepatocelular avanzado (HCC) . Sorafenib, un inhibidor de multicinasa, recibido recientemente la aprobación de la FDA para el tratamiento de HCC avanzado. Sin embargo, aunque sorafenib es bien tolerada, la preocupación por su seguridad se ha expresado. Celecoxib (Celebrex®) es un inhibidor selectivo de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), que presenta efectos antitumorales en células de HCC humanos. El presente estudio examinó la interacción entre celecoxib y sorafenib en dos líneas de células tumorales del hígado humano HepG2 y Huh7. Nuestros datos muestran que cada inhibidor sola redujo el crecimiento celular y la combinación de celecoxib con sorafenib sinérgicamente inhibió el crecimiento celular y el aumento de la apoptosis. Para entender mejor los mecanismos moleculares que subyacen a la actividad antitumoral sinérgico de la combinación, se investigó el perfil de expresión de las líneas celulares de cáncer de hígado tratados con la combinación utilizando el análisis de microarrays. El tratamiento de combinación alteró significativamente los niveles de expresión de 1,986 y 2,483 transcripciones en las células HepG2 y Huh7, respectivamente. Los genes funcionalmente involucradas en la muerte celular, la transducción de la señal y la regulación de la transcripción fueron predominantemente hasta reguladas, mientras que los genes implicados en el metabolismo, control del ciclo celular y la replicación y reparación del ADN fueron principalmente regulados hacia abajo tras el tratamiento. Sin embargo, las líneas celulares de HCC combinación tratados muestran especificidad en la expresión y la actividad de los factores cruciales que participan en hepatocarcinogenesis. La expresión alterada de algunos de estos genes fue confirmada por semi-cuantitativa y RT-PCR cuantitativa y por transferencia Western. Muchos genes nuevos emergen a partir del análisis de transcriptómica, y continuar con los análisis funcionales pueden determinar si estos genes pueden servir como dianas moleculares potenciales para las estrategias más efectivas contra la HCC
Visto:. Cervello M, Bachvarov D, Lampiasi N, Cusimano A, Azzolina A, McCubrey JA, et al. (2013) Combinación novela de Sorafenib y Celecoxib Proporciona sinérgico anti-proliferativa y pro-apoptóticos efectos en las células del cáncer de hígado humano. PLoS ONE 8 (6): e65569. doi: 10.1371 /journal.pone.0065569
Editor: Manlio Vinciguerra, University College de Londres, Reino Unido
Recibido: 11 Febrero, 2013; Aceptado: April 26, 2013; Publicado: 12 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Cervelló et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del italiano "Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca (Ministerio de Educación, Universidades e Investigación) - MIUR FIRB427 MERIT n.RBNE08YYBM a MC y G.M. .; D. B. es el jefe de la instalación Core Genómica del Centro de Investigación del Cáncer-CHUQ, con el apoyo de cáncer FRSQ-RR. Todos los experimentos y los datos genómicos análisis se realizaron en esta instalación; M. C. También se ha apoyado en parte por una subvención a la CNR del Ministerio de Economía y Finanzas de Italia para el Proyecto FaReBio di Qualità. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) representa el quinto cáncer más frecuente y la tercera causa más común de muerte por cáncer [1], [2]. Si bien el diagnóstico y manejo de las primeras etapas del HCC ha mejorado significativamente, CHC pronóstico sigue siendo extremadamente pobre. Por otra parte, CHC avanzado es un tumor muy agresivo con mínima o ninguna respuesta a las terapias comunes. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias eficaces y bien tolerados terapia.
El sorafenib, un inhibidor multicinasa que se dirige quinasas Raf, así como VEGFR-2 /-3, PDGFR-β, Flt-3 y c-Kit , recibido recientemente la aprobación de la FDA y EMEA para el tratamiento de los pacientes con HCC avanzado. Sin embargo, las tasas de respuesta tumorales bajos y los efectos secundarios asociados con este monoterapia indican la necesidad de investigar otras nuevas opciones terapéuticas para el CHC.
Las terapias dirigidas han entrado en el campo del tratamiento antineoplásico y se utilizan solos o en combinación con los medicamentos de quimioterapia convencionales. La terapia molecular dirigida mantiene la promesa de HCC [3]. Sin embargo, como en la mayoría de los cánceres, el uso de un solo agente dirigido molecular sería poco probable lograr una remisión o cura de larga duración en el CHC, especialmente para la enfermedad en etapa tardía. por lo tanto, se requiere la terapia de combinación, y parece razonable especular que una combinación de dos o más agentes en última instancia, incrementar la ganancia terapéutica.
HCC es generalmente el resultado de una lesión continua y la inflamación crónica. Un mediador importante de la inflamación es el gen inducible de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Ahora está bien establecido que la COX-2 es un blanco molecular importante para terapias contra el cáncer. COX-2 es crónicamente sobreexpresado en muchos cánceres, incluyendo HCC [4] - [8]. En HCC, nosotros y otros investigadores han demostrado que los inhibidores de la COX-2 pueden tener potenciales efectos terapéuticos [9] - [13]
La justificación de la combinación de sorafenib con inhibidores COX-2 en el CHC proviene de los datos publicados por. otros autores [14], sino también de nuestros propios datos publicados [12]. Hemos demostrado que el tratamiento de células de HCC humanos con un inhibidor de COX-2 se asocia con la activación de ERK1 /2, y que la inhibición de la vía de señalización MEK /ERK por un inhibidor de MEK potencia la actividad antitumoral del inhibidor. En general, nuestros resultados sugieren que la vía MEK /ERK no media la citotoxicidad inducida por los inhibidores de la COX-2, pero puede proteger las células de la muerte, que apoya indirectamente el papel de la vía MEK /ERK en la señalización de supervivencia de células de HCC [12].
por lo tanto, en base a estos resultados se evaluaron los efectos de una combinación de los selectivos de la COX-2 celecoxib con sorafenib. Sinérgico anti-proliferativa y pro-apoptóticos efectos se obtuvieron cuando se utiliza la combinación de sorafenib con celecoxib. Con el fin de comprender mejor los mecanismos detallados de los efectos citotóxicos de celecoxib y sorafenib, que también investigó y comparó la expresión génica global de las células HCC tratados con celecoxib o sorafenib, o los dos fármacos aplicados en combinación.
materiales y Métodos
Reactivos, cultivo celular, viabilidad celular, Clonigénicas y Ensayos de proliferación
el celecoxib (CLX) fue un regalo de Pfizer Inc. Corporación (Nueva York, EE.UU.), sorafenib (SOR) fue adquirido de Alexis Bioquímica (Lausen, CH), y ambos fármacos se disolvieron en dimetil sulfóxido (DMSO). El carcinoma hepatocelular líneas de células HepG2 humana (una línea celular de hepatocarcinoma humano; ATCC HB-8065) y Huh7 [15] (un regalo del Prof. Massimo Levrero, Universidad de Roma La Sapienza, Roma, Italia) utilizado en este estudio eran de baja estrecha número de pases y se mantuvieron como se ha descrito anteriormente [16]. Todas las células se mantuvieron a 5% de CO
2 y 37 ° C y de manera rutinaria examinados frente a la contaminación por micoplasma. Se realizaron ensayos de viabilidad celular como se informó anteriormente [17]. El coeficiente de interacción de fármacos (CDI) se utilizó para analizar los efectos de combinaciones de fármacos [18]. CDI se calcula como sigue: CDI = AB /(A x B). De acuerdo con la absorbancia de cada grupo, AB es la relación de los grupos de combinación con el grupo control; A o B es la proporción del grupo de agente único con el grupo control. Por lo tanto, los valores de CDI menor, igual o mayor que 1 indican que los fármacos son sinérgicos, aditivos o antagonistas, respectivamente. CDI menos de 0,7 indica que los fármacos son significativamente sinérgica. Además, el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student (dos colas). El criterio para la significación estadística fue
p
. & Lt; 0,05
El efecto de diferentes concentraciones de inhibidor sobre la viabilidad celular también se evaluó mediante un ensayo clonogénico. Para este análisis, 1,0-1,5 × 10
3 Las células se sembraron en placas de seis pocillos en medio de crecimiento, y después de las células de fijación durante la noche fueron expuestas ya sea a CLX y SOR solo o sus combinaciones o vehículo durante 48 horas. Después, las células se lavaron con medio libre de drogas y se dejaron crecer durante 14 días en condiciones libres de drogas. Se contaron las colonias que contienen más de 50 células. la formación de colonias relativa se determina por la relación del número medio de colonias en las células tratadas con el número medio de colonias en las células tratadas con disolvente (DMSO). Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron dos veces.
La proliferación celular se determinó mediante la estimación de la cantidad de bromodesoxiuridina incorporación (BrdU) en el ADN mediante un inmunoensayo colorimétrico (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). En resumen, 5 × 10
3 células se cultivaron en placas de 96 pocillos en las diferentes concentraciones de CLX y SOR solos o sus combinaciones o vehículo durante 24 horas. A continuación se añadió BrdU a las 10 mM concentración final. Las células se incubaron adicionalmente durante 24 horas adicionales y posteriormente se fijan y se tratan con peroxidasa anti-BrdU de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El color se desarrolló mediante la adición de sustrato de tetrametilbencidina y se mide a 490 nm. La intensidad del color y los valores de absorbancia directamente correlacionados con la cantidad de BrdU incorporada en el ADN. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición de incorporación de BrdU sobre el control. Los valores se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos separados, cada uno realizado por triplicado.
TUNEL Ensayos
Las células fueron cultivadas en 8 pocillos cámara de diapositivas durante la noche. Después del tratamiento durante 24 horas con diversas concentraciones de CLX y SOR ya sea solo o en combinación, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron en solución de paraformaldehído al 4% durante 25 minutos a temperatura ambiente. Las células apoptóticas se detectaron mediante el ensayo de deoxinucleotidil terminal de dUTP nick fin de etiquetado transferasa mediada (TUNEL) utilizando el Kit ™ DeadEnd sistema colorimétrico TUNEL de Promega (Madison, WI), siguiendo las instrucciones del fabricante. El número de células apoptóticas se determinó contando el porcentaje de células positivas brown-color. Al menos 500 células de dos preparaciones diferentes de células se contaron para cada condición. Las células se visualizaron con un microscopio Axioskop (Zeiss, Alemania).
Los análisis Western Blot
Para el análisis de transferencia Western, los lisados de células enteras se obtuvieron utilizando tampón RIPA (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA) y Western Blot se realizaron como se describe anteriormente [19], con anticuerpos primarios dirigidos contra survivina y trib3 /TRB3 (Abcam Ltd, Cambridge, Reino Unido), DDIT3 /CHOP (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), β- actina, YAP1 y DKK1 (Sigma-Aldrich Srl, Milán, Italia).
de perfiles
expresión génica y análisis de datos
La expresión de genes se llevó a cabo utilizando Agilent 44 K Whole Genoma humano de oligonucleótidos microarrays ( ~44,000 que contiene los genes), como se describe anteriormente [20] - [23]. Todos los experimentos de microarrays se realizaron por duplicado, utilizando tinte de canje durante el etiquetado. El software GeneSpring (Agilent, Palo Alto, CA) se utilizó para generar listas de genes seleccionados para los diferentes métodos estadísticos y visualización. Red y vía de análisis de los datos de microarrays se terminaron usando el software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (http://www.Ingenuity.com). Los datos de microarrays se ha depositado en la base de datos GEO con el número de acceso GSE45340.
semi-cuantitativos de RT-PCR (sqrt-PCR) Los análisis
Microarray datos fueron validados para los genes expresados diferencialmente seleccionados por sqRT- PCR como se describió previamente [21], [23]. El gen de β-actina se utilizó como gen de referencia. Se utilizaron los siguientes cebadores sentido y antisentido, respectivamente, para amplificar BIRC5 humana ( '-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3 5' y '5'-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3), DDIT3 (CHOP) (5'-ATGGCAGCTGAGTCATTGCC-3' y 5'-TCATGCTTGGTGCAGATTC -3 '), FABP1 (5'-CTCTATTGCCACCATGAGTTTC-3' y 5'-GCTGATTCTCTTGAAGACAAT-3 '), HRK (5'-CTGTGTCCTTGGAGAAAGCTG-3' y 5'-GTGTTTCTACGATCGCTCCAG-3 '), LARP6 (5'-GGAACAAGCTGGGATATGTGA- 3 'y 5'-GGTGGTCCTCATTCAACTCAA-3'), MT2A (5'-AAGAAAAGCTGCTGCTCCTG-3 'y 5'-TGGAAGTCGCGTTCTTTACAT-3'), YAP1 (5'-GGCAAAGACATCTTCTGGTCA-3 'y 5'-CATCATATTCTGCTGCACTGG-3') y β-actina (5'-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3 'y 5'-AGTACAGCTACGAGCAGTTCTTGTT-3'). Las reacciones de PCR se realizaron utilizando los siguientes parámetros: 95 ° C durante 5 min, 94 ° C durante 30 segundos, 62 ° C para HRK, LARP6, 60 ° C para BIRC5, β-actina, FABP1, MT2A, YAP1, 58 ° C para DDIT3, y 72 ° C durante 1 min seguido de una etapa de extensión final de 72 ° C durante 8 min. El número de ciclos se ajustó para permitir la detección en el intervalo lineal. Por último, los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa, se fotografiaron y se cuantificaron por densitometría.
RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) Los análisis
La expresión de genes seleccionados se cuantificó mediante real cuantitativa Time PCR (qPCR) utilizando SYBR Green fluorescencia (Qiagen, Milán, Italia) el StepOnePlus (Applied Biosystems). QuantiTect Primer ensayos para CCND1 (QT00495285), DDIT3 (CHOP) (QT00082278), DKK1 (QT00009093), FGF19 (QT02452289), FNDC3B (QT01882748), KLB (QT02454977), trib3 (QT00088543), LARP6 (QT00221445) fueron adquiridos de QIAGEN (Milán, Italia) y se amplifica como se recomienda. Expresión relativa se calculó utilizando el comparativo C
método t. La expresión del gen de interés se calculó como veces de inducción en comparación con el control (DMSO) y se corrigió con el nivel de expresión cuantificada de β-actina (QT00095431).
Resultados
Combinación de Celecoxib con sorafenib sinérgica reduce la viabilidad celular, la proliferación celular y la formación de colonias e induce la apoptosis en células de HCC
Usando el ensayo de MTS se evaluó por primera vez los efectos de sorafenib (SOR) y celecoxib (CLX) sobre la viabilidad de las dos células humanos HCC líneas, HepG2 y Huh7, que muestran características diferentes, incluyendo la diferenciación, comportamiento biológico y defectos genéticos, la COX-2 niveles de expresión [21], así como Raf //ERK actividades MEK [23]. Como se muestra en la Figura 1, el tratamiento con CLX y SOR durante 48 horas reducido efectivamente la viabilidad en ambas líneas celulares. Después de 72 horas de exposición de la droga, el IC
50 años de CLX fueron 76 ± 9,9 y 72,5 ± 0,7 M en células HepG2 y Huh7, respectivamente; el CI
50 años de SOR fueron 10,3 ± 1,1 y 10,1 ± 1,8 M en las mismas células. Desde COX-2 expresión de ARNm es indetectable en las células HepG2 [10], [21], la actividad inhibidora del crecimiento de CLX parece ser en gran parte de la COX-2 independiente en estas células [21]. Además, parece la actividad inhibidora del crecimiento SOR mediada ser independiente de MEK inactivación /ERK vía en las células HepG2, ya que como se informó anteriormente, la expresión de fosfo-MEK y fosfo-ERK1 /2 es apenas detectable en esta celda HCC línea [23].
vitalidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTS. células HepG2 y Huh7 fueron tratadas durante 48 h con las concentraciones indicadas de CLX y SOR ya sea solo o en combinación. Los datos se expresan como el porcentaje de células de control y son las medias ± SD de tres experimentos separados, cada uno de los cuales se realizó por triplicado. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con sorafenib solas,#p & lt; 0,05; ## P. & Lt; 0,01 en comparación con celecoxib solo
A continuación se investigó los efectos citotóxicos de la combinación SOR + CLX en ambas líneas celulares de HCC utilizando ensayos de MTS (Figura 1). La combinación SOR + CLX está representada aumentó significativamente la citotoxicidad en comparación con los agentes individuales. CDI se utilizó para determinar el tipo de interacción entre los agentes (Tabla 1). En ambas líneas celulares se produjo una fuerte sinergia cuando CLX se aplica en combinación con SOR (Tabla 1).
Los efectos citotóxicos del tratamiento de combinación más se confirmó usando un ensayo clonogénico (Figura 2). Las células fueron tratadas durante 2 días con o sin compuestos, se aspiró el medio y luego se lavaron con medio libre de inhibidor. Las células se dejaron crecer durante 14 días adicionales. Hubo una disminución dependiente de la dosis en la capacidad de formación de colonias debido a los tratamientos SOR + CLX combinadas en ambas líneas celulares. De hecho, la combinación SOR + CLX a una relación de dosis fija resultó en un aumento significativo en la destrucción de células tumorales tal como se mide mediante ensayos de formación de colonias en comparación con los agentes individuales (Figura 2).
El crecimiento celular de las células HepG2 y Huh7 se determinó mediante ensayo clonogénico después del tratamiento con CLX y SOR ya sea solo o en combinación. Las células se sembraron durante la noche y se exponen a CLX y SOR solo o en combinación a las concentraciones indicadas durante 48 h. Después del tratamiento se lavó cada pocillo y el experimento continuó durante 14 días en ausencia de fármacos. Las colonias supervivientes fueron teñidas (panel izquierdo) y contado (panel derecho). Los datos se expresan como porcentaje de la colonia en las células de control y son las medias ± SD de dos experimentos separados, cada uno de los cuales se realizó por duplicado. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p
. & Lt; 0,01 frente a cada agente por separado
Dado que los efectos anti-crecimiento del individuo o tratamientos combinados podrían deberse a un aumento de la muerte celular y /o disminución de la célula proliferación, que examina por separado los efectos del fármaco sobre la inducción de la apoptosis y la síntesis de ADN. Con respecto a la apoptosis, el tratamiento de las células HepG2 y Huh7 con hasta 50 M CLX tenía efectos despreciables sobre la inducción de apoptosis tal como se evaluó mediante el ensayo de TUNEL (Figura 3A). El tratamiento con SOR 7,5 o 10 mM aumentó la cantidad de células HepG2 apoptóticas a 3,4 ± 0,85% y 5,5 ± 1,4%, respectivamente. Sin embargo, la combinación SOR + CLX aumentó significativamente la apoptosis en las células HepG2 en comparación con el tratamiento con cualquiera de los agentes utilizado solo (
p
& lt; 0,05), mientras que en las células Huh7 se observó ningún efecto (Figura 3B). El ensayo de BrdU se utilizó para estudiar los efectos del tratamiento de combinación sobre la proliferación celular. Como se muestra en la Figura 3C, la combinación SOR + CLX tuvo un fuerte efecto sinérgico sobre la proliferación celular en ambas líneas celulares, se presentan los valores de CDI menos de 0,5 y 0,6 en todos los medicamentos combinaciones SOR + CLX en células HepG2 y células Huh7, respectivamente.
(A) Detección de la apoptosis por TUNEL ensayo. Las fotomicrografías de células HepG2 tratadas durante 24 h con las concentraciones indicadas de CLX y SOR ya sea solo o en combinación. Las células apoptóticas se visualizaron por tinción con TUNEL tal como se describe en la sección Materiales y Métodos. (B) Análisis cuantitativo de las células HepG2 y Huh7 TUNEL-positivos. Los datos se expresan como la media ± SD de dos experimentos separados. *
p Hotel & lt; 0,05, frente a cada agente por separado. (C) la proliferación celular se evaluó mediante un ensayo de BrdU. Las células fueron tratadas durante 48 h con las concentraciones indicadas de CLX y SOR ya sea solo o en combinación. Los datos se expresan como el porcentaje de las células de control y son las medias ± SD de tres experimentos separados. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p
. & Lt; 0,01 frente a cada agente por separado
Análisis Transcriptomic Identifica cambios de expresión génica común a las dos y únicos para HepG2 y Huh7 células después de tratamiento de combinación
Para identificar nuevos mecanismos potenciales de la acción combinada de celecoxib y sorafenib, sus efectos sobre la expresión génica global en ambas líneas celulares fueron investigados y se compararon utilizando la tecnología de microarrays de ADN. Agilent 44 K Whole Genoma Humano de oligonucleótidos microarrays (que contiene los genes ~44,000) se utiliza para identificar los cambios de expresión génica global en las líneas celulares de HCC, después de un tratamiento simultáneo con 50 CLX M y 7,5 M SOR durante 48 horas. Estas concentraciones se calcularon empíricamente como las concentraciones de fármaco máximas que no causan una reducción considerable de la viabilidad celular (menos de 20 a 30%) y /o cambios en la morfología celular durante el período de tratamiento (datos no mostrados). Todos los experimentos de microarrays se realizaron por duplicado aplicación de tinte-swap para evitar el sesgo de etiquetado. Usando este enfoque, un total de 1.986 genes expresados diferencialmente con los niveles de expresión ≥2 veces se identificaron en células HepG2, y 2.483 genes se muestra ≥2 veces la expresión en células Huh7. Entre estos, 975 genes o 1.382 genes fueron reguladas y 1.011 o 1.111 genes se redujeron reguladas en las células HepG2 y Huh7, respectivamente. Debe hacerse hincapié en que en ambas líneas celulares de HCC el tratamiento combinado SOR + CLX produjo una reducción predominante en genes asociados con el metabolismo, control del ciclo celular y la replicación y reparación del ADN, como numerosos genes implicados en la replicación y reparación del ADN fueron especialmente regulados hacia abajo en las células HepG2 (véase la Tabla 2A y 2C). Los genes funcionalmente relacionados a la muerte celular, la transducción de señales y regulación de la transcripción eran en su mayoría hasta reguladas tanto en células Huh7 (Tabla 2B y 2D) y HepG2. Los genes implicados en el crecimiento celular y la proliferación y el transporte fueron proporcionalmente hacia arriba y hacia abajo modulada en células HepG2, mientras que fueron inducidos principalmente en las células Huh7 (Tabla 2). Tablas S1 y S2 pantalla una lista completa de los genes expresados diferencialmente (≥2 veces) en las células HepG2 y Huh7 tratadas con CLX SOR +, respectivamente.
Nuestros análisis de transcriptómica confirmó fuertemente la observó sinérgico efectos del tratamiento combinado en células de HCC. previamente hemos investigado los mecanismos moleculares (incluidos los perfiles de expresión génica) de celecoxib [21] y sorafenib [23] citotoxicidad en células HepG2 y Huh7. análisis de diagrama de Venn basado en la previamente publicados y las listas de genes anteriores eran indicativos de un número sustancial de genes expresados diferencialmente que se modula exclusivamente en ambas líneas celulares de HCC solamente sobre el tratamiento combinado SOR + CLX (Figura 4A). Por otra parte, la mayoría de estos genes modulados de forma única muestra evidente HepG2 o Huh7 especificidad de las células tras el tratamiento SOR + CLX (véase la figura 4B). Estos datos están de acuerdo con nuestros hallazgos anteriores sobre los diferentes mecanismos moleculares de la acción citotóxica de celecoxib o sorafenib en células HepG2 y Huh7 [21], [23]. Lo anterior también nos los análisis llevó a evaluar si las células HepG2 y Huh7 tratadas con CLX SOR + podían distinguirse sobre la base de sus perfiles de expresión génica. Después de la filtración de la intensidad de señal de 2 veces, se utilizó una prueba paramétrica ANOVA de una sola vía (Welch
t-test
; no Asumiendo varianzas iguales) para seleccionar los genes discriminatorios. De hecho,
t
prueba con un
p-valor de corte de
0,005 seleccionó 174 genes para los que la expresión fue diferente en las células HepG2 y Huh7. Se realizó el análisis de agrupamiento basado en la lista de 174 genes utilizando el algoritmo estándar de estado de los árboles proporcionada en GeneSpring, revelando la formación de dos grupos principales de racimo que distinguir claramente las células HepG2 y Huh7 tras el tratamiento (Figura 4C). Noventa y nueve genes de la lista de 174 genes fueron reguladas en las células HepG2 tratadas, en comparación con las células Huh7. Clasificaciones principales de estos genes incluyen la proliferación celular, la transducción de señales, el metabolismo y el transporte. Los genes regulados hasta en las células tratadas con Huh7 en comparación con las células HepG2 (75 genes) están principalmente involucrados en el metabolismo, la transducción de señales, regulación de la transcripción, la respuesta inmune y la replicación y reparación del ADN. La lista de 174 genes se presenta en la Tabla S3.
(A) Diagrama de Venn análisis de los genes, expresados diferencialmente (≥2 veces) en líneas celulares HepG2 y Huh7 sobre CLX (50 mM) de tratamiento, SOR (7,5 M) de tratamiento, y el tratamiento combinado SOR + CLX. (B) Venn comparación diagrama de genes comunes y distintas modulada única (≥2 veces) en células HepG2 y Huh7 solamente después del tratamiento combinado SOR + CLX. (C) La agrupación jerárquica basada en la lista de 174 genes (2 veces la diferencia en la expresión génica;
p-valor de corte de
0,05) que discrimina a las células HepG2 y Huh7 en función de su respuesta al tratamiento combinado SOR + CLX. El rojo significa la regulación y significa verde baja regulación.
Camino y la red de análisis generados a través del uso de software Ingenuity Pathways Analysis (IPA) confirmaron los principales grupos de genes relacionados funcionalmente comunes e independientes, se encontró que se expresa diferencialmente en células HepG2 y Huh7 tratadas con CLX SOR + (Figura 5). En particular, las vías funcionales arriba hacia abajo-regulados en ambas líneas celulares fueron los relacionados con el ciclo por células, la replicación del ADN, la recombinación y reparación, el metabolismo lipídico y la bioquímica de moléculas pequeñas (Figura 5B y 5D), mientras que las vías asociadas con el desarrollo celular y la expresión génica se comprobó que estaban comúnmente inducida (Figura 5A y 5B). Vías relacionadas con la muerte celular y el crecimiento celular y la proliferación fueron ambos inducidos y reprimidos en las dos líneas celulares, aunque, como se esperaba, en cada línea celular HCC vías de muerte celular fueron más fuertemente inducida de suprimida (Figura 5A-5D). Las dos líneas celulares de HCC también muestran algunas diferencias por tratamiento SOR + CLX; por lo tanto, las vías asociadas con el conjunto de células y la organización eran predominantemente regulados hacia abajo en las células HepG2 (Figura 5B), mientras que las vías funcionalmente relacionados con la vitamina, mineral y el metabolismo de aminoácidos eran en su mayoría regulados hacia abajo en las células Huh7 (Figura 5D). De acuerdo con ello, las vías asociadas con el movimiento celular, la morfología celular, la función celular y el mantenimiento y el ciclo celular fueron más fuertemente reguladas en las células HepG2 (Figura 5A), mientras que las células Huh7 muestran sobre regulación específica de las vías relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos, el transporte molecular, pequeña molécula de la bioquímica y la replicación del ADN, la recombinación y reparación (Figura 5C).
un análisis de redes identificado numerosas redes altamente significativas con una puntuación ≥3 que estaban abajo o hasta reguladas en las células HepG2 y Huh7 tras el tratamiento combinado SOR + CLX. Como era de esperar, para las dos líneas celulares de HCC las cinco redes de mayor puntuación hasta reguladas se asocian principalmente con funciones vinculadas a la muerte celular y la expresión génica, mientras que las redes principales de puntuación baja regulado eran en su mayoría relacionados con el ciclo celular y el metabolismo (Tabla S4 ). Aquí de nuevo, cada una de las dos líneas celulares de HCC muestran alguna especificidad en la modulación de la red: por tanto, para las células HepG2, las cinco redes de mayor puntuación hasta reguladas eran en su mayoría asociados con la biosíntesis de proteínas y el transporte molecular (Tabla S4A), mientras que para las células Huh7, la parte superior de puntuación redes hasta reguladas fueron, además, vinculado al montaje y organización celular, la función celular y el mantenimiento y el ciclo celular (Tabla S4B). redes funcionales acopladas a la replicación del ADN, la recombinación y reparación fueron suprimidos específicamente en las células HepG2 (Tabla S4C), mientras que las células Huh7 muestran baja regulación de redes relacionadas con la función celular y el mantenimiento, la modificación del ARN post-transcripcional, el montaje y la organización celular, el transporte molecular y la respuesta inmune (Tabla S4D).
redes comunes, generada por la fusión de las cuatro redes con mayor puntuación que incluían tanto abajo y arriba de los genes regulados (≤2 veces), reconocido algunos nodos de genes relacionados funcionalmente, que fueron modulada específicamente en las dos líneas celulares de HCC por tratamiento SOR + CLX (Figura 6 y 7). En particular, en las células HepG2 un número de nodos de genes implicados en el control del ciclo celular y la replicación del ADN, la recombinación y reparación (incluyendo erbB2, EPO, CCNE1, CDC25A, CCNB1, BIRC5, NDC80, BUB1, PXN, KPNB1, KITLG, CDCA5, CDCA8 , TCF3, CDH1, CDKN3) se redujeron reguladas, mientras que los nodos de genes vinculados a la muerte celular (incluyendo ASNS, SOX4, EPAS1, S100P, IRS2, LCN2, IGFBP1, trib3, PHLDA2, AURKB) eran en su mayoría inducida, con la excepción de la nodo gen AURKB (Figura 6). nodos de genes específicamente las reguladas en las células Huh7 incluyen una serie de ciclo celular y la transcripción reguladores (CCND1, CCNE1, TCF3, FANCA, CENPF, FGFR3, ID1, ID2, ID3, MSX1 y miembros del complejo NF-kB), así como genes implicados en el ARN modificación post-transcripcional (CDKN2A, SREK, SRSF1), mientras que hasta reguladas nodos (incluyendo SP1, ATF3, SRSF1, BMP4, MSX1, KLF4, JMJD6) se asociaron principalmente con el control de la muerte celular (Figura 7) .
las cuatro redes con mayor puntuación se han fusionado y se muestran gráficamente como nodos (productos de genes /genes) y bordes (las relaciones biológicas entre los nodos). Intensidad del color nodo indica el grado de arriba (rojo) o hacia abajo (verde) -Regulación. Los nodos se muestran con diferentes formas que representan la clase funcional del producto génico (cuadrado = citoquina; ovalada vertical = receptor transmembrana; rectángulo = receptores nucleares; diamante = enzima; transportador romboide =; hexágono = factor de traducción; óvalo horizontal = factor de transcripción; círculo = otros). Los bordes se muestran con diferentes etiquetas que describen la naturaleza de la relación entre los nodos: -
obligatorios solamente
, →
actúa sobre
. La longitud de un borde refleja la evidencia que apoya esa relación y bordes apoyados por artículos de la literatura de nodo a nodo son más cortos. bordes de puntos representan la interacción indirecta.
Las cuatro redes con mayor puntuación se han fusionado y se muestran gráficamente como nodos (productos de genes /genes) y bordes (las relaciones biológicas entre los nodos). Leyendas de las figuras son como se describen en la Figura 6.
Validación de los resultados de microarrays con semi-cuantitativos de RT-PCR (sqrt-PCR) y RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
para validar nuestros resultados de microarrays, hemos seleccionado arbitrariamente 13 genes expresados diferencialmente después de un tratamiento de combinación. Algunos de estos genes fueron reportados previamente a ser afectados por sorafenib y por celecoxib y están involucrados en la regulación de la apoptosis, la respuesta de estrés ER, respuesta al daño del ADN, la proliferación celular y la invasión. Estos genes incluyen BIRC5 (survivina), ciclina D1 (CCND1), Harakiri (Hrk), daños en el ADN-inducible factor de transcripción 3 (DDIT3, también conocido como GADD153 o CHOP), proteína relacionada con Tribbles-3 (trib3, también conocido como TRB3 ), metalotioneína 2A (MT2A), La dominio ribonucleoprotein miembro de la familia 6 (LARP6), proteína asociada Sí-1 (YAP1), Fatty aceptor de ácido proteína 1 (FABP1, también conocida como proteína de unión a ácido graso de tipo hígado, L- FABP), y Dickkopf 1 (DKK1). Además, la expresión de algunos otros genes recientemente informado a participar en hepatocarcinogénesis, como Klotho-beta (KLB), factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF19), fibronectina tipo III 3B (FNDC3B) que contiene el dominio, también se analizó. La expresión génica se cuantificó por sqrt-PCR y en algunos casos por qRT-PCR en el control y en las células tratadas. sqrt-PCR y QRT-PCR se realizaron análisis de muestras utilizadas anteriormente para los experimentos de microarrays luego repitió usando ARN extraído de otros dos experimentos diferentes. La Tabla 3 muestra las mediciones de la expresión génica de todos los genes validados.
Validación de los resultados de microarrays con el Western Blot
Microarray datos mostraron que el gen que codifica la survivina (BIRC5) fue significativamente más baja