Extracto
La gemcitabina, un agente eficaz en el tratamiento de cáncer de páncreas, ha sufrido fracasos en muchos casos después de múltiples ciclos de tratamiento como consecuencia de aparición de resistencia a los medicamentos. Combinación de compuestos de la dieta con medicamentos clínicamente validados ha surgido como un enfoque terapéutico eficaz para el tratamiento de tumores de páncreas, refractarios al tratamiento con gemcitabina. Con el fin de optimizar una posible combinación sinérgica de gemcitabina (GCB) con las moléculas de la dieta, el ácido Betuilnic (BA) y Timoquinona (TQ), independiente de IC dosis
50 de GCB, BA y TQ se calculó para las líneas celulares de cáncer de páncreas . índice IC
50 dosis fijas de las moléculas de la dieta en combinación con una reducción de IC dosis
50 de GCB fue probado en GCB resistentes PANC-1 y células sensibles MIA Paca-2 de sinergismo, respuesta aditiva y el antagonismo, utilizando Calcusyn. índice de combinación (CI) reveló que el tratamiento previo de BA y TQ junto con GCB inhibe sinérgicamente la proliferación de células cancerosas en
in-vitro
experimentos. Piruvato quinasa (PK) M2 isoforma, un objetivo prometedor implicado en el metabolismo de las células cancerosas, mostró baja regulación en presencia de TQ o BA en combinación con GCB. GCB con BA actuaba preferentemente en las mitocondrias tumorales y provocó la transición de permeabilidad mitocondrial. Pre-exposición de las líneas celulares, MIA PaCa-2 y PANC-1, a TQ en combinación con GCB inducida por apoptosis. Por lo tanto, la eficacia de BA o TQ en combinación con GCB para inhibir la proliferación celular, inducir la apoptosis y disminuye la expresión de PKM2, refleja promesa en el tratamiento del cáncer de páncreas
Visto:. Pandita A, Kumar B, Manvati S, S Vaishnavi, Singh SK, Bamezai RNK (2014) Combinación sinérgica de gemcitabina y dietética molécula induce la apoptosis en células de cáncer pancreático y regula la expresión de Down PKM2. PLoS ONE 9 (9): e107154. doi: 10.1371 /
Editor journal.pone.0107154: Ajay Pratap Singh, Universidad del Sur de Alabama Mitchell Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 24 de mayo de 2014; Aceptado: August 13, 2014; Publicado: 8 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Pandita et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:.. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los intentos han sido madeto mejorar la eficacia de los fármacos clínicamente validados en régimen de combinación para mejorar su respuesta hacia los tumores refractarios, incluyendo el cáncer de páncreas [1]. Al lado de 5-fluorouracilo, gemcitabina (GCB), un fármaco quimioterapéutico usado para el cáncer de páncreas, ha mostrado fallas después de múltiples ciclos de tratamiento, debido a la aparición de resistencia a los medicamentos [2], [3]. El tratamiento de los tumores de páncreas que son refractarios al tratamiento con gemcitabina es un desafío para los oncólogos. Los esfuerzos, como en otros tipos de cáncer, para orientar los procesos clave, tales como el metabolismo carcinógeno, la división celular, la diferenciación, la apoptosis, en el desarrollo del cáncer de páncreas, ha generado interés en fitoquímicos dietéticos para la quimioprevención del cáncer potencial. Una relación mecánica entre la dieta y el cáncer de páncreas proviene de su interrelación reconocido desde hace tiempo [4]. Un agente de la dieta tal, que podría ser utilizado en combinación con GCB para el tratamiento de cáncer de páncreas, es el ácido betulínico (BA), un penta-cíclico-triterpeno de origen natural con una variedad de actividades biológicas incluyendo las propiedades antitumorales potentes [5]. BA está contenido en la corteza externa de varias plantas en todo el reino de las plantas, incluyendo árboles de abedul de corteza blanca [6], con actividades anti-inflamatorias, anti-virales y anti-neoplásicas [7]. actividad contra el cáncer de BA se ha relacionado con su capacidad para desencadenar directamente permeabilización de la membrana mitocondrial, un evento central en el proceso de apoptosis, el aumento de la esperanza de eludir la resistencia a agentes quimioterapéuticos convencionales [6]. Timoquinona (TQ), otro agente potencial contra el cáncer-nutracéutico, es un compuesto bioactivo derivado de las semillas de aceite negro (
Nigella sativa
). En medicina tradicional, el consumo de las semillas de TQ se ha asociado con diversos beneficios terapéuticos en el asma bronquial, la disentería, dolor de cabeza, problemas gastrointestinales, eczema, la hipertensión y la obesidad [8]. En el contexto del cáncer, TQ se informa a exhibir efectos antiproliferativos en las líneas celulares, derivadas de mama, colon, ovario, laringe, pulmón, leucemia mieloblástica y osteosarcoma [9] - [15]; y el efecto anti-metástasis en el cáncer de humanpancreatic. Se ha demostrado para suprimir la migración y la invasión de las células PANC-1 de una manera dependiente de la dosis [16] y regular a la baja NF-kappa B y la expresión de MMP-9. Estudios previos han demostrado también la actividad biológica de timoquinona (TQ) en las células de cáncer de páncreas
in vitro
. Esto ha puesto de manifiesto su efecto quimio-sensibilizar después de la pre-exposición de las células a TQ (25 mmol /L) durante 48 horas, seguido de gemcitabina u oxaliplatino, lo que resulta en la inhibición del crecimiento del 60% al 80% en comparación con 15% a 25% . de la inhibición con gemcitabina o oxaliplatinalone [17]
las células cancerosas, que dependen principalmente de la reprogramación de sus necesidades metabólicas, consumen más glucosa y producir una gran cantidad de lactato incluso en un entorno bien oxigenada; el proceso denominado como la glucólisis aeróbica o "efecto de Warburg" [18], [19]. Mientras que las células diferenciadas normales maximizar la producción de ATP por fosforilación oxidativa mitocondrial de la glucosa en condiciones de normoxia, las células cancerosas generan mucho menos ATP a partir de la glucosa por glucólisis aeróbica. A pesar de ser menos eficiente en la producción de ATP, la glucólisis es un proceso mucho más rápido en las células del cáncer [20], [21]. Aquí piruvato quinasa (PK) cataliza la última reacción con transferencia de un grupo fosfato de alta energía a partir de fosfo-enolpiruvato (PEP) a ADP, produciendo ATP y piruvato que se reduce a lactato mediante la lactato deshidrogenasa (LDH) en el citosol. Piruvato quinasa (PK) se compone de cuatro isoformas, de las cuales PKM2 expresa predominantemente en las células del cáncer [22]. Estos son: de colon [23], célula renal [24], de pulmón [25] y otros. PKM2 se ha demostrado que actúa como un marcador de: carcinoma de células renales (RCC) [26], [27], cáncer testicular [28], cáncer de mama [29], tumores urológicos [30], carcinoma de pulmón, cáncer cervical, y tumores gastrointestinales [31]; y con una posible detección en las heces de los pacientes con cáncer gástrico y de colon [32]. En el pasado reciente, la espectrometría de masas también ha demostrado la presencia predominante de PKM2 en:. CCR, el carcinoma de vejiga, carcinoma hepatocelular, cáncer colorrectal, carcinoma de pulmón, y el adenoma folicular de tiroides [33]
En este estudio, se investigó el efecto de la BA o TQ con GCB, independientemente y en combinación, en las células de adenocarcinoma humano, MIA PaCa-2 y PANC-1, para inducir la muerte celular. Se evaluó el mecanismo subyacente de su acción, especialmente con respecto a la expresión y la actividad y la transición de permeabilidad mitocondrial PKM2.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares, mantenimiento y reactivos
pancreática humana líneas celulares de cáncer, PANC-1 y MIA PaCa-2 fueron adquiridos de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. Glutamina, HEPES o suplementos de piruvato de sodio, se añadieron a mantener un crecimiento celular apropiado. El ácido betulínico (BA), Timoquinona (TQ), gemcitabina (GCB), dimetiltiazol-2-il-2, 5-difenil-tetrazolio (MTT), Rodhamine-123 (Rh-123), yoduro de propidio (PI) y otros productos químicos (Sigma Chemical Co, EE.UU.); junto con anexina-V-FITC kit de detección de apoptosis (Cayman Chemical Company), los anticuerpos contra: Pro-caspasa-3, Beta-actina, PKM2, poli-ADP-ribosa-polimerasa (PARP) (Cell Signaling), se adquirieron y utilizaron en el estudio.
perfil del tratamiento y la viabilidad de la célula de ensayo
PANC-1 y células MIA Paca-2 se cultivaron en matraces T-75. Después de 80% de confluencia, se tripsinizaron las células y se centrifugaron a 100 xg durante 5 min. El sedimento celular se suspendió en medio DMEM; y 2 × 10
5 células /pocillo dispensado en Nunclon-placas de 96 pocillos de fondo plano para fijar durante 24 horas. Las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de BA, TQ y GCB, solos y en combinaciones. En los experimentos de combinación, las células se trataron primero y sensibilizados con BA o TQ durante 24 horas, seguido de exposición a GCB para los próximos 24 horas y se incubaron en CO
2 incubadora a 37 ° C. Para el ensayo de viabilidad celular, la solución de MTT (20 l de 2,5 mg /ml en DMEM) se añadió a cada uno y las placas de cultivo bien agitada suavemente, seguido de incubación en CO
2 incubadora a 37 ° C durante 3 horas. El sobrenadante se aspiró y los cristales de MTT-formazon disolvió en 150 l de DMSO. Las placas se incubaron de nuevo a 37 ° C y se agitó durante 10 min en un agitador de placas. La absorbancia de DMSO cristales disuelto MTT-formazon se midió a 570 nm. valores Chemo-sensibilidad se expresaron como la viabilidad celular% de la concentración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 50%; y el IC
50 valores calculados a partir de las relaciones de concentración-efecto, utilizando Graph Pad Prism versión 5.00.
Análisis de los efectos de fármacos combinados
sinergia fármaco se determinó por el isobolograma y combinación- métodos de índice, derivados del principio del efecto mediano de Chou y Talalay [34], utilizando el software Calcusyn (Biosoft, Versión 2.1). Los datos obtenidos de los experimentos de inhibidores del crecimiento se utilizó para llevar a cabo estos análisis. El método isobolograma es una representación gráfica de la interacción farmacológica; y se forma mediante la selección de una muerte de células fraccional afectado deseada (Fa). Una línea recta se elaboró para conectar el Fa puntos trazados contra utilizados experimentalmente la relación de combinaciones fijas de fármacos (GCB) y la molécula de la dieta (BA o TQ) en X e Y para generar ejes isobologramas. Combinación de puntos de datos que caen en la línea representan una interacción fármaco-fármaco aditivo; mientras que, los puntos de datos que estaban por debajo o por encima de la línea representados sinergismo o antagonismo, respectivamente. La combinación-index (CI), un valor numérico, se calculó por la fórmula [35]: Cuando, C
A, x y C
B, x, eran las concentraciones de fármaco A anddrug B, utilizados en combinación para lograr x efecto% de fármaco. IC
x, A y IC
x, B fueron las concentraciones de los agentes individuales para lograr el mismo efecto.
La combinación del índice (IC) del método es una representación matemática y cuantitativa de una de dos -drug interacción farmacológica. Utilizando los datos de los experimentos inhibidoras del crecimiento y el software computarizado, los valores de CI se generaron en un rango de niveles Fa 0,05-0,90 (inhibición del crecimiento de 5% -90%). Un CI de 1 indica un efecto aditivo entre los dos agentes, mientras que un CI & lt; 1 o CI & gt; 1 indica, la sinergia o antagonismo, respectivamente.
análisis de citometría de flujo para la detección de apoptosis
1 × 10
5 células /ml /pocillo de MIA PaCa-2 y PANC-1 eran tratado con BA, TQ, y GCB solo y en combinación durante 48 hrs. Las células se lavaron y se tiñeron con anticuerpo anexina-V-FITC y PI, según las instrucciones del fabricante. ensayo gráfico de puntos de citometría de flujo se realizó y células analizan en busca de la intensidad de fluorescencia de FL-1 (FITC) y los canales FL-2 (PI). Se analizó la fracción de la población de células en diferentes cuadrantes, utilizando las estadísticas de cuadrante. Las células en el cuadrante inferior derecho, representa la apoptosis; y en el cuadrante superior derecho, necrosis superficial o posterior apoptosis [36].
Medición del potencial de membrana mitocondrial
1 × 10
5 células /ml /pocillo de MIA Paca-2 y PANC-1 células fueron tratadas con BA, TQ, y solo y en combinación GCB en placa de 12 pocillos durante 48 horas. En el último 1 hr de incubación, antes de la terminación de la exposición, las células se tiñeron con rodamina-123 (5 g /ml). Las células se lavaron en PBS y se centrifugaron a 100 xg durante 5 min y se suspendieron en PBS. Para detectar los cambios en mitocondrial trans-potencial de membrana (ψ), como resultado de la perturbación mitocondrial, una disminución en la intensidad de fluorescencia se analizó flujo-citometría en FL-1 canal [37].
Preparación de lisado de células enteras e inmunotransferencia
Las células, (2 × 10
6/6 ml de medio /60 mm placa de cultivo de tejidos) se expone a BA, TQ, y GCB solo y en combinación después de 48 horas de tratamiento, se recogieron por tripsinización y se lavó con PBS.The pellet obtenido se lisaron con tampón de hielo frío de lisis (50 mMTris pH 8,0, 150 mMNaCl, EDTA 5 mM, 1% v v Nonidet P-40, PMSF 1 mM y 1% (v /v) /proteasa cóctel inhibidor) y se mantuvo durante 30 min en hielo con toma intermedia después de cada 5 minutos. Los lisados se centrifugaron a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C y el sobrenadante recogieron para inmunotransferencia [38]. El sobrenadante así recogido se cuantificó usando el ensayo de ácido bicinconınico (ensayo BCA) Kit de Thermo Scientific. Por Western blot, 50 g de proteínas totales se resolvió en SDS-PAGE al 60 V y luego se transfiere a una membrana de PVDF electro noche a 4 ° C bajo una corriente de 30 V. proteína de unión no específica se bloqueó con leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris, que contiene 0,1% de Tween-20 (TBST), durante 1 hora a temperatura ambiente. Las transferencias se sondearon con los respectivos anticuerpos humanos anti principal del ratón /conejo /cabra durante 2 horas y se lavaron tres veces con TBST. Las transferencias se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpos secundarios durante 1 hora, se lavaron de nuevo tres veces con TBST y señales detectadas, utilizando ECL plus kit químico-luminiscencia en una película de rayos X [38].
actividad PKM2 ensayo
PKM2 actividad se midió espectrofotométricamente (UV-1800, Shimadzu, Japón), utilizando NADH /lactato deshidrogenasa (LDH) ensayo acoplado como se describe anteriormente [39].
estadística análisis
los datos de los experimentos realizados por triplicado se expresó como la media +/- SD, a menos que se indique lo contrario. Se realizaron comparaciones entre el control y los grupos tratados, utilizando un modelo lineal (Dunnett o Tukey) y P valores. & Lt; 0,01 se consideraron significativos
Resultados
in vitro
estudios de combinación de gemcitabina con ácido betulínico y timoquinona
la quimio-sensibilidad en líneas celulares de cáncer de páncreas, MIA Paca-2 y PANC-1, hacia el GCB drogas y las moléculas de la dieta, BA o TQ, se reflejó en inhibición del crecimiento celular, calculado por IC
50 (inhibición del crecimiento del 50%) a las 48 horas; y en comparación inicialmente con los valores obtenidos en una línea celular de control, FR2. El IC
50 valores obtenidos a partir de un tratamiento independiente en las tres líneas celulares, MIA Paca-2, PANC-1 y FR2, se proporcionan en detalle en la Tabla 1 (BA: 25 ± 0,9 M, 23,5 ± 3,5 m, 50 ± 1 M; TQ 36 ± 0,28 M, 23 ± 2 M y 77 ± 2 M; GCB 1 ± 0,66 M, 5,5 ± 2,5 M y & lt; 0,025 M). Los resultados se analizaron con una vía Annova-Dunnett que muestra una significativa (valor de p & lt; 0,01) entre efecto tratar, de una manera dependiente de la dosis (Figura 1). Basándose en estos resultados, se seleccionó una relación de fármaco fija (GCB: BA o GCB: TQ) en un intervalo de concentraciones de fármaco y se utiliza en otras experimentaciones (Figura 2). Se utilizó combinación de índice (CI) para analizar y confirmar sinergismo observado después de pre-tratamiento de las células con la molécula de la dieta, seguido de la exposición a GCB durante 48 horas (GCB: BA y GCB: TQ). Los valores de CI, que proporcionan una medida cuantitativa del grado de interacción de fármacos, se calcularon utilizando software Calcusyn, a valores de Fa de 0,50, 0,75 y 0,90 (Tabla 2). Isobologramas construido para estos valores, lo que representa 50%, 75% y 90% de inhibición del crecimiento, respectivamente, tanto para MIA PaCa-2 y PANC-1 en las células (Figura 3) y la trama Fa-CI, se proporciona como figura S1. La Tabla 3 muestra los valores de CI en Fa del 0,50 a la 0,90 para las moléculas dietéticos (BA o TQ) y drogas (GCB). Una comparación de la monoterapia (BA, GCB, TQ) con la combinación (CI
(GCB: BA) y CI
(GCB: TQ)) mostró una diferencia significativa en el valor de p & lt; 0,01. valores de DE de la isolobologram MIA Paca-2 y PANC-1 se mencionan en la Tabla S1. En MIA células Paca-2, sensibilizados con BA y seguidos con la exposición GCB, el CI
: los valores obtenidos en las dosis (6.25:0.082 y 25:0.33) (GCB BA) fueron 0.519, 0.889. Con TQ, el CI
(GCB: TQ) en dosis (4.5:0.082; 9:0.15 y 36:0.66) mostró los valores de 0.721, 1.050, 0.681. Sin embargo, en PANC-1 del CI
(GCB: BA) a dosis (20:5.2 5:1.3 y) mostró 0,766, 0,429 y con TQ CI
(GCB: TQ) en dosis (6.25:1.3 y 25:5.3), los valores fueron de 0,736, 0,371. Los valores de CI de & lt; 1; & lt; 0,5 y & gt; 1, representado sinergismo, fuerte sinergismo y efecto antagonista, respectivamente. El sinergismo se observó a través de una amplia gama de concentraciones, tanto en las líneas de células tumorales de páncreas estudiados. Sinérgica combinación de fármacos es decir, CI (el índice de combinación) de CI
(GCB: BA) (25 + 0,33) y CI
(GCB: TQ) (36 + 0,66) en la línea de MIA Paca-2cell y CI
(GCB: BA) (20 + 5,25) y CI
(GCB: TQ) (25 + 5,25) en PANC-1, que representa el valor Fa 0,75 (que muestra la inhibición del 75%), fueron utilizados en resto de los ensayos . Sin embargo, la línea celular normal utilizado en el estudio (FR2), para la comparación como control, mostraron una inhibición en el valor Fa de 0,75 a 0,90. Nuestros resultados muestran que se observó el impacto de las moléculas de la dieta (BA o TQ) en las células normales en una concentración alta; mientras que sólo se requería una dosis mínima de GCB para la inhibición de la proliferación celular. En el caso de los estudios de combinación, la exposición total de gemcitabina a las células cancerosas sólo durante 24 horas.
IC
50
valor se calculó sobre
adenocarcinoma de páncreas humano
em
líneas celulares (a) MIA Paca-2 (B) PANC-1 y (C) de la línea celular normal FR2: para el tratamiento individual de gemcitabina, Timoquinona y ácido betulínico durante 48 h (** , comparadas significativo como para controlar a su valor p. & lt; 0,01, n = 3) en medio de las tres líneas celulares
(a) MIA Paca-2 y (B) células PANC-1 se expusieron a concentraciones graduadas de ácido betulínico, Timoquinona o gemcitabina sola o en combinación con una relación de dosis fija de ácido betulínico frente a gemcitabina y Timoquinona vs. gemcitabina durante 48 hrs. (gemcitabina
tener la exposición durante 24 horas sólo en caso de combinación), gemcitabina (cuadrados), España
El ácido betulínico y Timoquinona
(círculo) gemcitabina + ácido betulínico y gemcitabina + Timoquinona (triángulo). (terapia Mono ( BA, GCB, TQ) Versus Combinaciones (CI
(GCB: BA), CI
(GCB: TQ).) (**, una diferencia significativa en el valor de p & lt; 0,01, n = 3)
(a y B) que muestra el análisis isolobolograms de la combinación de gemcitabina, ácido betulínico o en Timoquinona, (a) células MIA Paca-2 con una relación fija de drogas 1:0.01 del GCB : BA y GCB: TQ
(B) células con una proporción fija de drogas 1:0.2 GCB 1 PANC-: BA y GCB: TQ. Las dosis individuales de gemcitabina, ácido betulínico y Timoquinona, para lograr 90% (en línea recta) de inhibición del crecimiento (Fa = 0,90), inhibición del crecimiento del 75% (línea de guiones) (Fa = 0,75), y 50% (cruces) la inhibición del crecimiento ( Fa = 0,50) se representa en el xe y ejes. índice de combinación valores (IC) calculado usando el software Calcusyn está representada por puntos anteriores (antagonismo indicating- entre las drogas) o por debajo de las líneas (sinergia indicating-). (Símbolo X) ED50, (signo más) Ed75 y (abierta círculo punteado) ED90 (monoterapia (BA, GCB, TQ) frente a combinaciones (CI
(GCB: BA), CI
(GCB: TQ)) (***, una diferencia significativa en el valor de p & lt; 0,001, n = 3).
La pérdida de potencial de membrana mitocondrial
BA o pre-tratado TQ MIA PaCa-2 y las células junto con GCB, en combinación y, independientemente, 1 PANC-, cuando se analizaron por Rh-123 captación por citometría de flujo, se muestra una pérdida de 11% y 17% mitocondrial potencial de membrana (MMP) , en MIA células Paca-2 tratados con 0,33 M y 0,66 M de GCB, respectivamente, mientras que en combinación, CI
(BA: GCB)., thedecrease fue del 77% en comparación con el control (valor de p & lt; 0,001) (Figura . 4A) Sin embargo, las células PANC-1, que son relativamente resistentes a la GCB en comparación con MIA PaCa-2, mostró una disminución de 74% con BA solo y en combinación, CI
(GCB: BA), la disminución fue hasta TO46%, en comparación con el control (valor p & lt; 0,001). el tratamiento con la dosis individual de GCB es decir, 5,25 M, mostró una disminución de hasta 13% (Figura 4B). TQ solo o en combinación con GCB no mostró ningún cambio en MMP tanto en las líneas celulares. Aparentemente, BA equi-potentemente dirigida funciones mitocondriales que TQ y GCB, en ambos tipos de células. En las células de control no tratadas, casi todas las células eran bio-energía activa, como lo demuestra la alta fluorescencia Rh-123
(A) MIA Paca-2:. El ácido betulínico
solo y en combinación CI
(GCB: BA) con la pérdida de gemcitabina inducida del potencial de membrana mitocondrial (ψ) que no se observa en Timoquinona y gemcitabina solos ni en combinación CI
(GCB: TQ). Las células se tiñeron con rodamina-123 (5 mg /ml) durante 1 hr y se analizaron en FL-1 canal de citómetro de flujo. Los datos de todas las cifras son representativos de uno de tres experimentos similares. (B) Estudios similares se llevaron a cabo en PANC-1 línea de células, el ácido betulínico solo induce una mayor pérdida de la membrana mitocondrial que en combinación con gemcitabina CI
(GCB: BA) también se observó ninguna pérdida en la membrana mitocondrial cuando se tratan con Timoquinona y gemcitabina sola o en combinación CI
(GCB: TQ) durante 48 horas (control versos monoterapia (BA, TQ, GCB) y control versos Combinaciones (CI
(GCB.: BA), CI
( GCB: TQ)), (***, una diferencia significativa en el valor de p & lt; 0,001, n = 3)
citometría de flujo de puntuación -análisis de las células apoptóticas, se trató con BA, TQ. y GCB, solo y en combinación
El aumento de la citotoxicidad por BA o TQ pretratamiento apoptosis inducida era una cuestión que debe resolverse. BA o TQ células pretratadas junto con GCB, en combinación y de forma individual, la dosis producida aumento dependiente de la población de células apoptóticas y post apoptosis tanto en las líneas celulares de cáncer de páncreas, MIA Paca-2 y PANC-1. en MIA Paca-2, un tratamiento independiente con BA (25 mM), TQ (36 mM) y la GCB (0,33 M y 0,66 M) resultaron en 7%, 5%, 1% y 2% de tasa de apoptosis, respectivamente. En combinación, CI
(GCB: BA), produce el 11% y CI
(GCB: TQ) produjo el 6% (valor de p & lt; 0,001) la apoptosis, whencompared con el control (Figura 5A). Del mismo modo, en la línea celular Panc1, BA (20 mM), TQ (25 M) y GCB (5,25 M), producen individualmente 9%, 8%, la tasa de 7% de la apoptosis, respectivamente. Si bien en combinación, CI
(GCB: BA), y CI
(GCB: TQ), la tasa aumentó a 11% y 12% (valor de p & lt; 0,001), respectivamente, en comparación con el control (Figura 5B) . En el tratamiento de combinación se produjo un aumento en la tasa de apoptosis en ambas líneas celulares. BA produjo efecto más apoptótica individualmente y en combinación con GCB de GCB y TQ solo o en combinación con TQ GCB en MIA PaCa-2; mientras, se observó inversa en las células PANC-1.
(A) MIA Paca-2 células (1 × 10
5) se incubaron con las concentraciones indicadas de ácido betulínico, Timoquinona y gemcitabina
solo y en combinación CI
(GCB: BA), y CI
(GCB: TQ) para
48 horas y se analizaron para AnnexinV-FITC /PI tinción para determinar la apoptosis poblaciones de células como se describe en Materiales y Métodos sección. (B) Estudios similares se llevaron a cabo con en células Panc-1 después del tratamiento con dosis indicadas de ácido betulínico, Timoquinona y gemcitabina sola y en combinación CI
(GCB: BA), y CI
(GCB: TQ) durante 48 horas (control frente a la monoterapia (BA, TQ, GCB) y control frente a combinaciones (CI
(GCB.: BA), y CI
(GCB: TQ)), (***, una diferencia significativa en el valor de p & lt; 0,001, n = 3)
PKM2 expresión y actividad
BA o TQ pre-tratamiento con una dosis sinérgica de Fa 0.75 junto con GCB en combinación. (CI
GCB: BA y CI
GCB: TQ). durante 48 horas en ambas líneas celulares de cáncer pancreático, MIA PaCa-2 y PANC-1, mostraron una disminución inPKM2 nivel de proteína (Figura 6A y B) Mientras , en Fa pre-tratados con BA (5 M) y TQ (6,25 M) en combinación con GCB (1,3 M) durante 48 horas, se observó 0.5 es decir, células de una disminución de la procaspasa 3-expresión y PARP; sin ningún efecto sobre la expresión PKM2, excepto por una disminución moderada de la expresión en PKM2 con TQ (Figura 6C). la actividad de PKM2, sin embargo, mostró un aumento inuntreated MIA PaCa-2 células y una disminución en las células tratadas con BA (25 M) , TQ (36 M) y GCB (0,33 M y 0,66 M); que mejoró en la combinación (CI
GCB: BA y CI
GCB: TQ) (Figura 7A). Mientras que, en el caso de las células Panc-1, los resultados así obtenidos eran inverso en las células no tratada que mostraron una disminución de la actividad de PKM2 y un aumento de la actividad en las células tratadas solo o en combinación (Figura 7B).
(a) MIA Paca-2 y (B) PANC-1 dosis sinérgicas en Fa 0,75 de ácido betulínico y Timoquinona fueron usados solos y en combinación CI
(GCB: BA) y CI
(GCB: TQ) con gemcitabina
a partir de los borrones se observó que hubo una disminución en la expresión de PKM2 cuando son tratados en dosis de combinación.. (C) Panc1 línea celular dosis a Fa 0,5 de ácido betulínico, Timoquinona y gemcitabina se utilizaron solos y en combinación, y de las manchas que observó que hubo una disminución en Pro-caspasa-3 seguido por disminución de la PARP y un ligero descenso se observa en Timoquinona tratada en PKM2.
MIA Paca-2 células (a) tratadas con ácido betulínico, Timoquinona y gemcitabina sola y en combinación, CI
(GCB : BA) y
CI
(GCB: TQ) a las 48 hrs. Una disminución de la actividad en las células tratadas con
seguido
más
disminuir
en combinación (s), CI
(GCB: BA)
y CI
(GCB: TQ), Francia
en comparación con el control fue observado;
(B)
En PANC-1 línea celular fue viceversa observado. El control frente a la monoterapia (BA, TQ, GCB) y control frente a combinaciones (CI
(GCB: BA) & amp; IC
(GCB: TQ)), (***, una diferencia significativa en el valor de p & lt; 0,001, n = 3)
Discusión
Los tumores pancreáticos que son refractarios a la terapia con gemcitabina suponen un reto para los oncólogos. Terapias que están actualmente en uso para el tratamiento de cáncer de páncreas han demostrado eficacia decepcionante; y la adquisición de resistencia a los fármacos durante la quimioterapia constituye un reto importante. Por lo tanto, las nuevas estrategias tienen que ser puesto en marcha con el fin de desarrollar agentes quimio-preventivas y /o quimio-terapéuticos que podrían mejorar el resultado clínico de esta enfermedad. La creciente evidencia fomenta el uso de las moléculas de la dieta y la suplementación en la dieta para aumentar la respuesta de los agentes quimioterapéuticos estándar contra el cáncer. Anteriormente, se ha informado de flavonoides para inactivar vías desregulados con frecuencia, tales como Akt y NF-kappa B, en el cáncer de páncreas, lo que contribuye al crecimiento celular, la metástasis y la resistencia a la quimioterapia. La genisteína, un compuesto de la dieta, se ha demostrado que aumentar la actividad anti-tumor de erlotinib y gemcitabina en sistemas experimentales de cáncer de páncreas [40]. Anteriormente, también se ha demostrado que garcinol, una molécula de la dieta, sinergia con gemcitabina para inhibir la proliferación celular e induce la apoptosis en las células MIA PaCa-2 con una modulación significativa de los principales reguladores de cáncer, incluyendo
PARP
,
VEGF
,
MMP
,
ILS
, caspasas, y
NF-kB
[
41
]. La curcumina, un componente de la dieta, el cáncer de páncreas sensibiliza a la gemcitabina
in vitro
y
in vivo. In vitro
, la curcumina ha demostrado inhibir la proliferación de diversas líneas de células de cáncer de páncreas, potenciar la apoptosis inducida por gemcitabina, y la inhibición de la activación de NF-kappa B constitutiva en las células.
In vivo
, los tumores de los ratones nude inyectados con células de cáncer pancreático y tratados con una combinación de la curcumina y gemcitabina mostró una reducción significativa en el volumen (
P
= 0,008 vs control;
P
= 0,036 vs gemcitabina sola) [42]. En nuestros experimentos, una interacción combinada de ácido betulínico (BA) o timoquinona (TQ), los dos nutracéuticos con gemcitabina (GCB), en GCB-sensible a la MIA Paca-2 y GCB-resistentes-PANC-1 - líneas pancreáticos de células cancerosas , mostró sinergismo. El ensayo de viabilidad reveló una interacción sinérgica entre citotóxico GCB y BA o GCB y TQ en ambas líneas celulares GCB-sensibles y resistentes, como se determina por el DRI (Índice de Reducción de la dosis) de & gt; 1 obtenido a partir de Calcusyn [43]. Mecánicamente, GCB media sus efectos citotóxicos mediante la inhibición de la etapa de síntesis de reparación a través de su acción como un inhibidor de la ribonucleótido-reductasa, el agotamiento de las piscinas desoxi-nucleótidos intracelulares, y mejorar el potencial de su propia incorporación en el ADN recién sintetizado. Una vez incorporada en el ADN, el análogo causa la terminación de la síntesis de ADN y es resistente a la eliminación por exo-nucleasas, lo que resulta en roturas de la cadena de ADN [44]. El ácido betulínico (BA), un nutracéutico, se ha demostrado que induce la apoptosis a través de vías mitocondriales, donde durante este proceso se permeabilizan tanto las membranas externa e interna mitocondrial, lo que resulta en la liberación de proteínas solubles, tales como el citocromo c, Smac o AIF, desde el espacio intermedio mitocondrial en el citosol [45]. BA también induce deathin varias líneas celulares de cáncer diferentes a través de múltiples vías, que incluyen la inducción independiente de p53 de p21 /Waf1, sobre regulación de los receptores de muerte, la inhibición de la proteína de especificidad (Sp) factores de transcripción [46]. Del mismo modo, Timoquinona (TQ) induce la apoptosis en células tumorales mediante varios mecanismos, incluyendo la supresión de NF-kB, la activación de Akt y de señalización de la quinasa vías reguladas por señales extracelulares, y también mediante la inhibición de la angiogénesis del tumor [47]. Sobre la base de ED
50, ED
75 y ED
90 de combinaciones de fármacos, se generaron isobologramas y la sinergia evaluados, utilizando Calcusyn. El ácido betulínico (BA) o Timoquinona (TQ) en combinación con gemcitabina (GCB), en múltiples concentraciones de fármaco, mostró que en GCB sensible-MIA PaCa-2 y GCB resistente-PANC-1 en las células, el índice de combinación (CI) estaba bajo 0,88 a Fa de 0,75 (75% de reducción de crecimiento celular) en las células MIA PaCa-2. Considerando que, en caso de PANC-1, el índice de combinación (CI) se encontraba bajo 0,76 a Fa de 0,5. La base biológica para esta sinergia era evidente en los cambios diferenciales en la apoptosis tanto con las moléculas de la dieta. A pesar de que mecánicamente nuestras combinaciones son "mutuamente no exclusiva" en la naturaleza pero tanto las moléculas de la dieta mostraron una diferencia significativa en cuanto de la inducción de citotoxicidad en comparación con estar solo GCB. Sin embargo, la tasa de inducción de apoptosis por BA en combinación con GCB fue más eficiente, tanto en las líneas celulares, que TQ en combinación con GCB. También, disminución del potencial mitocondrial transmembrana (Ψ) se observó cuando BA solo o en combinación con GCB se proporcionó a las dos líneas celulares. Sin cambios, sin embargo, se observó en el potencial mitocondrial transmembrana (Ψ) cuando las líneas celulares de cáncer se trataron con GCB solo.