Extracto
Antecedentes
El tratamiento del cáncer de próstata metastásico (CaP ) con agentes individuales ha mostrado una eficacia modesta. La hipótesis de la inhibición dual de los diferentes caminos en los resultados de CaP en la inhibición de tumores mejorada. Las quinasas de la familia Src (SFK) y ejes factor de crecimiento 1 (IGF-1) de señalización similares a la insulina son activadas de manera aberrante en ambos CaP y metástasis óseas primarias y regulan funciones distintas y superpuestas en la progresión del CaP. Se examinaron los efectos antitumorales de la inhibición combinada de estas vías.
Materiales y Métodos
Src andIGF-1 receptor (IGF-1R) se logró la inhibición
in vitro fotos: por corto horquilla (sh) ARN y
in vitro
y
in vivo fotos: por inhibidores de molécula pequeña (dasatinib y BMS-754807, contra SFK y IGF-1R receptor /insulina (RI), respectivamente).
resultados
in vitro
, la inhibición de IGF-1 de señalización afectado a la supervivencia y la proliferación celular. SFK bloqueo solo no tuvo efectos modestos sobre la proliferación, pero aumentó significativamente el bloqueo de IGF-1R. Estos resultados se correlacionaron con un robusto inhibición de IGF-1 inducida por Akt1 fosforilación por dasatinib, mientras que la fosforilación Akt2 era SFK independiente y sólo inhibido por BMS-754807. Por lo tanto, la inhibición completa de ambos genes Akt, que no se veían por cada fármaco por separado, es probable que un mecanismo importante para la disminución de la supervivencia de células de CaP. Por otra parte, el dasatinib y BMS-754807 inhibieron
in vivo
crecimiento del xenotrasplante humano primario MDA PCa 133, correspondiente con la inhibición de Akt en tumores. También, el crecimiento tanto ortotópico y intratibial tumor de las células PC-3 fueron más potentemente inhibida por doble SFK y IGF-1R /bloqueo IR en comparación con ya sea sola vía, con la correspondiente disminución en los marcadores de recambio óseo.
Conclusiones
Dual de IGF-1R /IR y SFK inhibición puede ser un enfoque terapéutico racional en el CaP mediante el bloqueo de los procesos, tanto independientes y complementarios críticos para el crecimiento del tumor
Visto:. Dayyani M, Parikh NU, Varkaris AS , canción JH, Moorthy S, T Chatterji, et al. (2012) Combinada La inhibición de IGF-1R /IR y Src quinasas de la familia mejora los efectos antitumorales en cáncer de próstata mediante la disminución de la supervivencia Activado Caminos. PLoS ONE 7 (12): e51189. doi: 10.1371 /journal.pone.0051189
Editor: Kaustubh Datta, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Julio, 2012; Aceptado: 30 Octubre 2012; Publicado: December 26, 2012
Derechos de Autor © 2012 Dayyani et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. F. D. recibió el apoyo de Estados Unidos Institutos Nacionales de Salud de subvención CA009666 T32; F.D., G.E.G., J.C.A., y C.J.L. fueron apoyados por 1 P50 CA140388-01; F.D., G.E.G., y C.J.L. También contaron con el apoyo de una beca de la Fundación del cáncer de próstata. Este trabajo también fue apoyado por el NIH subvención a través del Centro de Apoyo del Cáncer del MD Anderson, 5 P30 CA016672-35. S.N.M. fue apoyado por una beca del Programa de Investigación en Cáncer de Próstata UTMDACC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos. Ellos declaran que J. C. y M. G. son empleados por Bristol-Myers Squibb. Esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer de próstata metastásico (CaP) es responsable de un estimado de 28.000 muertes en 2012 [1]. En avanzado, metastásico resistente a la castración CaP (CRPC), existen pocas opciones de tratamiento. Hay solamente 3 son agentes quimioterapéuticos para el CRPC aprobado por la FDA: docetaxel y cabazitaxel [2], [3], los cuales muestran sólo una modesta ventaja de supervivencia para hombres con CRPC, y más recientemente, el acetato de CYP17 inhibidor de abiraterona, aprobado para su uso después del fracaso de docetaxel (ClinicalTrials.gov identificador: NCT00638690), la mejora de la supervivencia global de 3,9 meses [4]. Para CPRC metastásico mínimamente sintomática, un ensayo aleatorizado de fase 3 mostró una ventaja de supervivencia con la vacuna Sipuleucel-T [5] .Así, mientras que los agentes prometedores están mejorando la supervivencia de los pacientes con CaP, agentes terapéuticos adicionales son claramente necesarios para la enfermedad en estadio avanzado [6].
los recientes avances en la comprensión de las vías de señalización que regulan el crecimiento de las células de CaP en el hueso han dado lugar a numerosos ensayos clínicos con terapias dirigidas. Uno de los objetivos más prometedores en el CP son las quinasas de la familia Src (SFKs), una familia de no receptores tirosina quinasas de proteínas, la expresión y las actividades específicas de los cuales se incrementan en múltiples tipos de tumores humanos [7]. Los datos preclínicos en CaP muestran que la inhibición de SFKs disminuye la proliferación y, más fuertemente, la invasión y la migración [8], [9]. Además, la actividad Src es importante en el microambiente, lo que afecta la función de los osteoclastos. Por lo tanto, los inhibidores de Src bloque, en las interacciones parte, tumorales /microambiente que conducen al "círculo vicioso" de la metástasis ósea [10]. En los estudios que utilizan
in vivo
experimentos con ratones ortotópico, la inhibición de SFKs disminuyeron tanto el crecimiento del tumor de próstata y el desarrollo de metástasis en los ganglios linfáticos [11]. Basado en parte en estos hallazgos y algunos resultados prometedores de un ensayo de fase 1/2 [12], dasatinib, un pequeño inhibidor multi-quinasa molécula con la selectividad forSFK /Abl [8], ha sido probado en combinación con docetaxel en un ensayo aleatorizado de fase 3 de prueba para los pacientes con CRPC (ClinicalTrials.gov ID: NCT00744497).
los análisis del ensayo de fase 1/2 indican la inhibición SFK más docetaxel no produjo respuestas clínicas significativas en la mayoría de los pacientes, pero eran extremadamente prometedora para un subconjunto de pacientes [13]. Por lo tanto, la identificación de rutas de señalización adicionales que contribuyen al crecimiento metastásico de CaP y pueden aumentar los efectos de la inhibición de Src es probable que el rendimiento combinaciones prometedoras de los inhibidores que serán más eficaces para el tratamiento de CaP.
Uno de tales vía desregulado en el CaP está mediada por el factor de crecimiento-1 del receptor de insulina (IGF-1R). IGF-1R está implicada en la proliferación y la supervivencia de muchos tipos de tumores [14] y se sobreexpresa en el CaP [15]. la señalización de IGF-1R se ha relacionado con el riesgo de PCa, y uno de sus ligandos, IGF-2, también se sobreexpresa en las metástasis CaP de hueso [16], en la que promueve la proliferación y la supervivencia de células de CaP [17], [18], [ ,,,0],19], [20], [21]. Los estudios con anticuerpos monoclonales frente a IGF-1R han implicado a este receptor como importante en la progresión de CaP en andrógeno-sensibles, así como modelos de tumores resistentes a [22]. Aunque la señalización de IGF-1R está mediada en parte por la vía de Src, otras vías de señalización corriente abajo de IGF-1R son Src independiente y no afectados por la inhibición de Src [14]; estas vías adicionales se han mostrado recientemente que desempeñar un papel importante en la supervivencia celular CaP [23]. La activación de Src y IGF-1R también activa Akt, un efector clave de la /Akt /mTOR vía PI3K, que se activa de forma aberrante en la mayoría de los tumores malignos, la promoción del crecimiento celular, la proliferación, y la supervivencia [24], [25] .Sin embargo, si estos inhibidores son igualmente eficaces en la inhibición de Akt1, 2 y 3 funciones no se conoce, y si la combinación de ellos producen mejores resultados en la inhibición de esta vía de supervivencia fue un objetivo de este trabajo. A continuación, se examinaron los efectos individuales y combinados de dasatinib, un inhibidor de la SFK, y BMS-754807, un inhibidor de molécula pequeña potente y reversible de IGF-1R [26] y el receptor de la insulina (RI) con actividad frente a diversos tumores sólidos
in vitro
así como en varios modelos de xenoinjerto [26]. Como inhibidores tienen efectos fuera de la meta, también fue empleado caída molecular de estas vías. Se demuestra que la inhibición de estas vías produce efectos biológicos complementarios
in vitro
y
in vivo
y que, en presencia de IGF-1, se requiere la inhibición de ambas vías para inhibir potentemente la fosforilación de Akt y mediadores abajo de la supervivencia de las células cancerosas.
Materiales y Métodos
los cultivos de células
p>
transfectantes estables
construcciones de ARN-GFP-puromicina Listos para transfectar horquilla corta (sh) contra humana IGF1-R (# SR302344) y Src (# SR304574) se adquirieron de OriGene Technologies. Un control negativo revueltos universales shRNA (# SR30004) fue proporcionado por el fabricante. Las células fueron transfectadas utilizando Fugene 6 reactivo (Roche) según las instrucciones del fabricante. clones estables fueron seleccionados con puromicina. Objetivo caída se verificó 3-4 semanas después de la transfección mediante transferencias Western, como se describe a continuación.
La proliferación celular ensayo
Las células (3 × 10
4per pocillo) se cultivaron en 6 pocillos platos de hasta 96 horas con y sin dasatinib (100 nM) o BMS-754807 (0,5-5 M). Para recuento de células en diversos puntos de tiempo, las células se lavaron una vez con PBS (Gibco), se incubaron con reactivo de disociación TrypLE (Gibco), y se contaron usando un analizador automático de la viabilidad celular (XR Vi-Cell; Beckman Coulter). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Anexina V tinción
La tinción de células apoptóticas se realizó utilizando un kit de detección de anexina V-PE (BD Pharmingen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se cultivaron las células durante 48 horas, seguido de tinción con anexina V-PE. Las células se analizaron en un BD FACS Canto citómetro de flujo, utilizando el software de la diva FACS (BD Biosciences).
Cell ciclo
Las células fueron cultivadas durante 24 horas, se recogieron y se lavaron una vez en PBS, a continuación, se volvió a suspender en helado de etanol al 70% y se mantiene a -20 ° C durante 1 hora. Después, las células se lavaron de nuevo en PBS y se trataron durante 45 minutos con RNasa libre de DNasa (Invitrogen) a 37 ° C. El yoduro de propidio se añadió a una concentración final de 1 mg /ml, y se incubaron las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. El análisis se realizó en un BD FACS Canto citómetro de flujo, utilizando el software de la diva FACS.
Animales
/CNR ratones desnudos suizos nu-nu se compraron a la zona de producción animal del Departamento de Experimental Oncología Radioterápica en el MD Anderson. Todos los ratones fueron alojados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos según las directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo del MD Anderson. El Comité de Cuidado de Animales y el empleo MD Anderson Institucional (IACUC) revisó este estudio y específicamente aprobado.
xenoinjertos de tumores
injertos subcutáneos de MDA PCa 133 (un xenoinjerto de un paciente resistente a la castración derivan a partir de una metástasis ósea que expresa AR y PSA y crece sólo en ratones y no en el cultivo de células) se generaron como se describe anteriormente [30]. En resumen, los fragmentos de tumores se implantaron subcutáneamente en ratones inmunodeficiencia combinada severa (SCID) en un tamaño de menos de 1 mm
3. Los tumores se dejaron crecer hasta que alcanzaron el tamaño de 3 mm
3, y a continuación, los ratones (n = 4 para cada grupo) se trataron diariamente con dasatinib y BMS-754807, solo y en combinación, durante 26 días. Los tumores se midieron dos veces por semana, y el volumen se calculó utilizando la fórmula
V = W
2 × L /2
. En el día 26, los ratones fueron sacrificados, se recogieron los tumores, y la proteína lisados se prepararon como se indica a continuación para transferencias Western.
prostáticos ortotópico /inyecciones intratibial
inyección intraprostática del PC3 que expresan luciferasa Lg células se realizó según lo publicado anteriormente por nuestro grupo [31]. Brevemente, 40 /Ncr ratones desnudos nu-nu Swiss (8-12 semanas de edad) fueron anestesiados con 2% de isoflurano en una cámara de isoflurano en oxígeno y luego se coloca en una posición supina. Se hace una incisión en la línea media se hizo en el bajo vientre, y la próstata se exteriorizó como se describe por Park et al. [32]. Cincuenta microlitros de HBSS que contienen PC3-LG (en total, 5 × 10
5 células) se inyectaron ortotópicamente como se describe anteriormente [31] en un lóbulo lateral de la próstata. La herida se cerró con clips quirúrgicos de metal. Diez días después de la inyección de xenoinjerto, el injerto del tumor se determinó por
in vivo
bioluminiscencia de formación de imágenes (sistema de IVISTM 100; Xenogen Co.) con los ratones bajo anestesia con isoflurano 2% inhalación. Se seleccionaron treinta y dos ratones que muestran la actividad de luciferasa cerca del valor de la mediana y aleatorizados mediante el uso de un programa de Excel® (Microsoft) en 4 grupos (n = 8 para cada grupo): vehículo de control, BMS-754807 solo (12,5 mg /kg de peso corporal peso /día), dasatinib sola (12,5 mg /kg de peso corporal /día), y una combinación de BMS-754807 (6,25 mg /kg de peso corporal /día) y dasatinib (12,5 mg /kg de peso corporal /día). Estas concentraciones fueron elegidos deliberadamente a niveles en los que no se espera que la actividad de agente único. Todos los fármacos se administraron por sonda oral 6 días /semana. Los ratones se sacrificaron 4 semanas después de la inyección de las células. Los tumores primarios en la próstata se extirparon y pesaron
intratibial inyección de células PC3-MM2 se llevó a cabo como se describe anteriormente [28].; Brevemente, los ratones desnudos se anestesiaron como anteriormente, y 2,5 × 10
se inyectaron 5 células en la tibia como se describe [28]. Doce días después de la inyección, los ratones fueron tratados con solución salina (n = 10) dasatinib (n = 9), BMS-754807 (n = 9), o ambos (n = 8) a las dosis descritas anteriormente. Cuatro semanas después de la iniciación del tratamiento, se sacrificaron los ratones. Las radiografías fueron tomadas de todos los ratones, y de 4 ratones de cada grupo, las tibias fueron cosechadas y preparadas, y la tomografía computarizada se realizó según lo descrito anteriormente [32], [33].
La destrucción ósea después de intratibial inyección de células PC3-mM2 en ratones nude se clasificó sobre la base de las siguientes puntuaciones: 0 = cambios mínimos; 1 = lesiones óseas líticas, la corteza intacta; 2 = destrucción de la corteza, no tejido blando significativa hinchazón; 3 = destrucción de la corteza, la participación significativa de los tejidos blandos.
inmunotransferencia
La inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente [34]. Brevemente, las células se lisaron y se aclaran, y las proteínas se separaron a través de 8% de SDS-PAGE, seguido de la transferencia a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Las membranas se incubaron con anticuerpos contra Src, Yes, Fyn, Lyn, IGF-1R, Akt, Erk1 /2, y S6 (todo comprado de Señalización Celular) y LC3 (Sigma), seguido por anticuerpos secundarios de rábano picante conjugada con peroxidasa (Bio -Rad).
inmunoprecipitación
para determinar la fosforilación de Akt1 y 2 específicamente, PC-3 células fueron suero de hambre hasta 48 horas y después se incubaron durante 2 horas con dasatinib (100 nm), BMS-754807 (5 mM), o ambos, seguido por la estimulación de 15 minutos con 50 ng /ml de rhIGF-1 (amp I +; D Systems). a continuación, se recogieron las células, y 500 g de proteína se utilizó para la inmunoprecipitación, tal como se describe anteriormente [35]. Las muestras se incubaron con anticuerpos específicos frente a Akt1 o Akt2 (Señalización Celular) durante la noche a 4 ° C. Tras la inmunoprecipitación, 50 l de proteína A se añadieron perlas de agarosa, y las muestras se incubaron de nuevo durante 2 horas a 4 ° C. Las muestras se centrifugaron a 5000 rpm durante 2 minutos. Se desechó el sobrenadante, y cada muestra se lavó con 500 l de tampón de lavado ensayo de quinasa del complejo inmune y se centrifugó 3 veces. Después, se añadieron 30 l de colorante de SDS a las proteínas precipitadas, y las muestras se realizaron por transferencias de Western y se incubó con fosfo-Akt (Señalización Celular) siguiendo el protocolo descrito anteriormente.
Los estudios histológicos
H & amp; e y tinción TUNEL se realizaron en MDA PCa 133 xenoinjertos de tumores después de la explantación como se describe anteriormente [36], [37]. En cada grupo, se examinaron 5 campos de alta potencia (HPF) diferentes, se contó el número de células TUNEL positivas, y se calculó el número medio de células TUNEL positivas /HPF. Hoechst tinción se utilizó para la tinción de los núcleos celulares.
ELISA
La determinación cuantitativa de la fosfatasa alcalina murino y N-telopéptido en suero de ratón se realizó mediante los respectivos kits de ELISA (TSZ ELISA) de acuerdo con el fabricante de instrucciones. Todas las curvas estándar tenían un R2 de ≥0.990. Los controles positivos para cada ensayo fueron proporcionados por el fabricante.
Estadísticas
Para las comparaciones estadísticas de los parámetros continuos, de Student
t-test fue utilizado
, y para valores discretos, se utilizó la prueba de chi-cuadrado; α & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
inhibición de IGF-1R afecta a la proliferación celular y la apoptosis
Hemos probado nuestra razón de ser para la inhibición combinada de la Src y de IGF-1R. vías mediante la determinación de los efectos sobre el crecimiento y la apoptosis luego transducción de señales, seguido por los efectos sobre el crecimiento del tumor en varios modelos animales pertinentes. Las células fueron cultivadas en FBS al 10%, suficiente para dar lugar a activado IGF-1R. En estas condiciones, la inhibición de Src y IGF-1R por la combinación de dasatinib y BMS-754807 disminución de la proliferación celular tanto en las células PC-3 y LNCaP, como se muestra en la Fig. 1A. En primer lugar, se confirmó la expresión de la SFKs Src, Yes, Fyn, Lyn y en todas las células de CaP examinados (Fig. S1 A). Para determinar si los inhibidores principalmente afectado Src y IGF-1R, se hicieron estables caídas mediadas por shRNA para
SRC
y
IGF-1R
, respectivamente. A & gt; 90% desmontables de las respectivas enzimas de señalización se logró (Figura S1B.). la inhibición SFK con dasatinib disminución de la proliferación de las células PC-3, en consonancia con los resultados anteriores [11]; desmontables de
IGF-1R
disminución de la proliferación a las 96 horas más de dasatinib hicieron (
P Hotel & lt; 0,05; S1C), y la combinación de la inhibición SFK y
IGF-1R
disminución de la caída mayor proliferación (
P Hotel & lt; 0,05). Estos resultados fueron confirmados por el ensayo de MTS de un cultivo de 96 horas (datos no mostrados). La inhibición de la proliferación observada con BMS-754807 fue más pronunciada en ambas líneas celulares que con shIGF-1R, lo que sugiere que el fenotipo observado con BMS-754807 es probablemente debido, en parte, a la capacidad de BMS-754807 para inhibir el receptor de insulina (IR) así como [26] .Para examinar específicamente los efectos de BMS-754807 en IGF-1 estimulación de IGF-1R, se determinó el efecto de dosis crecientes del inhibidor sobre la escisión de PARP. Como se muestra en la Figura S1D, la escisión de PARP era dependiente de la dosis. También se examinó la dependencia del tiempo de inhibición del crecimiento. En presencia de BMS-754807, la cinética de crecimiento se inhibió de una manera dependiente del tiempo en relación con las células no tratadas (Figura S1e). Estos resultados son consistentes con BMS-754807 afectar el crecimiento celular a través de aumento de la apoptosis
células PC-3 o LNCaP (A) se cultivaron durante 96 horas con y sin dasatinib. (DSA; 100 nm) y BMS-754807 ( BMS-807; número de células 2 M para PC-3 y 0,5 M para las células LNCaP), solo y en combinación, y se determinaron como se describe en los métodos. Se incubaron las células PC-3 y LNCaP (B) durante 24 horas con y sin DSA (100 nM) y BMS-754807 (5 M para PC-3 y 1 M para las células LNCaP), solo y en combinación, y el ciclo celular tinción después de 24 horas se llevó a cabo usando yoduro de propidio. Se incubaron (C) las células PC-3 durante 48 horas con y sin DSA (100 nM) y BMS-754807 (2 M), solos y en combinación, y el porcentaje de células apoptóticas se determinó mediante análisis de citometría de flujo de Anexina-V tinción. (D) Izquierda: tinción del ciclo celular con yoduro de propidio en células-shIGF-1R PC-3. Derecha: PC-3-shIGF-1R control de las células y se incubaron durante 48 horas con y sin DSA (100 nM), y el porcentaje de células apoptóticas se determinó mediante análisis de citometría de flujo de la tinción de anexina-V. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. *
P Hotel & lt; 0,05; N. S. no significativo.
En las células LNCaP PC-3 y, el tratamiento con la combinación de dasatinib y BMS-754807 incrementa la detención del ciclo celular y la muerte celular, ya sea en relación con inhibidor solo (Fig. 1B). Al examinar la contribución específica de cada compuesto, se encontró que la incubación de ambas líneas celulares con BMS-754807 aumentado la proporción de subG
1 células (Fig. 1B), en correlación con una mayor fracción de células anexina-V-positivos en 48 horas (cuando la muerte celular era principio- (Fig. 1C), así como correspondientes con PARP de escisión (Fig. S1F). en contraste, no hay aumentos en subG
1 fracción y las células anexina-V-positivas se observaron con el Además de dasatinib solamente. a la pantalla para la posible inducción de la autofagia, también a prueba si los fármacos inducen la conversión de LC3-I a LC3-II, un proceso indicativo de la actividad de autofagia. Como se muestra en la Fig. S1G, ninguno de los fármacos (solo o en combinación) produce cantidades significativas de LC3-II, lo que sugiere la autofagia no es una causa importante de muerte celular.
Dado que sólo BMS-754807 indujo apoptosis, que entonces lleva a cabo un experimento similar con las células shIGF-1R PC-3 a determinar si disminución de la expresión de IGF-1R aumento específicamente la apoptosis. en efecto, como se ve en la Fig. 1D, desmontables de
IGF-1R
en las células PC-3 aumentó la proporción de células subG
1, así como la anexina-V-positivas en comparación con las células de control de ARNhc. Desmontables de
SRC
tenido poco efecto (datos no mostrados).
La combinación de dasatinib y BMS-754807 como resultado más potente inhibición de Akt que hace cada fármaco por separado
Estamos próximos a prueba si la inhibición combinada de SFKs e IGF-1R afectada vías de señalización diferente a como lo hizo cada agente por separado. Examinamos primero potenciales intermedios aguas abajo de estas vías, Erk1 /2 y Akt. Los experimentos se realizaron en presencia y ausencia de IGF-1 porque IGF-1 es abundante en el microambiente de los pacientes CRPC. En condiciones privadas de suero (para suprimir la activación de IGF-1R línea de base), que confirmó la inhibición de destino con ambos fármacos después de IGF-1 estimulación (Fig. 2A). Erk1 /2 expresión o la fosforilación no se vio afectada por cualquiera de inhibidor solo o cuando se usa en combinación (Fig. S2). Por el contrario, la activación de Akt se inhibió parcialmente por cada inhibidor solo y completamente inhibida por la combinación. Para comprender mejor el mecanismo de inhibición de Akt, que primero demostrado la expresión de Akt1 y 2 (Fig. 2B, C), pero no Akt3 (datos no mostrados), a niveles detectables en las células PC-3. En ausencia de IGF-1, Akt2, pero no Akt1, está parcialmente activado (Fig. 2B, C). En presencia de IGF-1, Akt1 se activa y la fosforilación de Akt2 más aumentos. Como se muestra en la Fig. 2B, & gt; 80% de la fosforilación de Akt1 es inhibida por dasatinib, mientras que dasatinib es ineficaz en la inhibición de IGF-1 inducida por la fosforilación de Akt2 (Fig 2C.). Por el contrario, BMS-754807 parcialmente, pero no completamente, redujo tanto la fosforilación tanto de Akt1 y 2 en presencia de IGF-1. bloqueo dual de IGF-1R y SFK con combinado BMS-754807 y dasatinib inhibe completamente detectable Akt1 y 2 fosforilación en presencia de IGF-1 (Fig. 2B, C). Para investigar los efectos sobre una diana aguas abajo de Akt, se examinó la fosforilación S6. De acuerdo con los resultados de la inhibición de Akt, la inhibición parcial de la fosforilación de S6 se observó tanto con dasatinib y BMS-754807 solo, y la inhibición completa se observó con la combinación (Fig. 2D), lo que sugiere que la inhibición de las funciones de Akt requiere tanto dasatinib y BMS 754.807. Por lo tanto, la combinación de dasatinib y BMS-754807 disminuye la supervivencia en parte, debido a completar la inhibición de Akt.
PC 3-células (A) se mueren de inanición de suero durante 72 horas y luego se pre-incubaron durante 2 horas con BMS-754807 a los 2 M o 5 M, con dasatinib a 100 nM, o con ambos agentes. Después de 2 horas, las células se estimularon con 50 ng /ml recombinante humano IGF-1 (rhIGF-1) durante 3 minutos. A continuación, la proteína se cosechó y la (fosfo) -proteínas IGF-1R, Src, y Akt se determinó por Western Blot (WB). Vinculina se utilizó como control de carga. (B y C) de las células PC-3 fueron estimuladas con DSA (100 nM) y BMS-754807 (5 mM) como anteriormente, y luego se recogieron las células y se inmunoprecipitaron de Akt1 (B) o Akt2 (C), seguido de inmunotransferencia de fosfo-Akt. (D) las células PC-3 fueron tratados como en (A), y Western Blot se realizó durante S6 y fosfo-S6.
El tratamiento de xenoinjertos de tumores humanos primarios con dasatinib y BMS-754807 es eficaz ratones
in vivo
e induce la apoptosis tumoral
Para determinar el efecto de la inhibición combinada de Src y el IGF-1R en un xenoinjerto directa de células de CaP humanos en crecimiento en modelos de ratón, que primero trataron que llevan el xenotrasplante humano primario MDA PCa 133 tumores (resistente a la castración, AR positivo) con dasatinib y BMS-754807 solo y en combinación (n = 4 para cada grupo). Como se muestra en la Fig. 3A, a las 3 semanas, se produjo un aumento en el tamaño del tumor en el grupo de control, así como los grupos de un solo fármaco, mientras que la tasa de crecimiento tumoral se redujo significativamente en el grupo de combinación. Este efecto fue aún más pronunciado en el día 26, momento en que se sacrificaron los ratones.
(A) MDA PCa 133 (derivado de las metástasis óseas) las células se implantaron subcutáneamente en ratones desnudos tal como se describe en Métodos. Una vez que los tumores alcanzaron un volumen de 3 mm
3, los ratones fueron tratados con dasatinib y BMS-754807 solo y en combinación (n = 4 para cada grupo). Los tumores se midieron dos veces a la semana. Se muestra el aumento relativo en el tamaño del tumor con el tiempo en cada grupo. *
P Hotel & lt; 0,05. (B) Los ratones fueron sacrificados 16 días después del inicio del tratamiento, se recogieron las tumores, y transferencias de Western se realizaron para los -proteínas indicado (total y fosfato). Se demuestran los resultados representativos de un tumor en cada grupo de tratamiento. (C) Cuantificación de la tinción de TUNEL para detectar la apoptosis. Se muestra la media (± SEM) número de células apoptóticas por campo de gran aumento (CGA) en cada grupo.
Las inmunotransferencias sobre los tumores de flash-congelados capturados en el único agente de los ratones tratados demostró la inhibición de la src fosforilación por dasatinib y la fosforilación de IGF-1R por BMS-754807, lo que demuestra que estos fármacos alcanzaron sus objetivos principales. Exactamente como observamos en el
in vitro
estudios, Akt y fosforilación S6 se inhibió sólo parcialmente por cada fármaco por separado. En contraste, se observó una inhibición robusta de Akt y fosforilación S6 en el grupo de combinación (Fig. 3B). Además, la apoptosis se incrementó, como se determina por tinción TUNEL de los tumores tratados con BMS-754807 y aumentado aún más en el grupo de combinación (
P
= 0,01; Fig. 3C). Estos resultados sugieren que la inhibición combinada de Src y el IGF-1R es eficaz en xenoinjertos humanos primarios, mediada en parte por la inhibición casi completa de la fosforilación de Akt.
Para examinar la inhibición de tumores, PC-3 células ortotópico LG (elegido por su receptor de andrógenos [AR] estado -negativa y el crecimiento robusto en modelos ortotópico) se inyectaron en las próstatas de ratones desnudos y se trató como se describe en la sección Métodos. Cuatro semanas después de la inyección de células, los ratones fueron sacrificados y los tumores se extirparon y se pesaron (Fig. S3A). tumores representativos de los 4 grupos de tratamiento (n total = 8 para cada grupo) se muestran en la Fig. S3 B. No hubo diferencia significativa en el peso del tumor entre el control, dasatinib, y BMS-754807 grupos en las concentraciones utilizadas (como se esperaba), pero los ratones tratados con la combinación de fármacos tenían tumores significativamente menores (
P & lt
; 0,03; Fig. S3 a, B): perfil
inhibición inducida por el PC3-MM2 destrucción ósea dasatinib y BMS-754807 y disminuir los marcadores de recambio óseo
in vivo
a. investigar si el dasatinib y BMS-754807 recambio óseo inducida por CaP reducida, se inyectaron células PC3-MM2 intratibialmente en ratones desnudos. Dos semanas después de la inyección, los ratones se trataron durante 4 semanas con cualquiera de los fármacos solos o en combinación (control, n = 10; dasatinib, n = 9; BMS-754807, n = 9; combinación, n = 8). En este momento, se tomaron rayos X y los ratones se desangraron después de la eutanasia. Los huesos involucrados fueron cosechadas por tomografía computarizada. CaP celular inducida por el crecimiento tumoral y la destrucción ósea, medida en las radiografías de fricción, se obtuvo en forma ciega como se describe en Métodos. Considerando que, como se esperaba, el tratamiento con dasatinib solo exhibió algo de inhibición de la destrucción ósea, la combinación de dasatinib y BMS-754807 inhibe de manera más eficaz el crecimiento del tumor intratibial en el hueso (Fig. 4A, B). Sin embargo, sólo la combinación de fármacos redujo significativamente los niveles séricos de los marcadores de recambio óseo (Fig. 4C, D), lo que indica la modulación tanto de las células de CaP y su microambiente de la médula, lo que interfiere con el ciclo vicioso [10]. Considerando que la modificación de murino N-telopéptido, un sustituto de la actividad de los osteoclastos, es indicativo de la inhibición de la línea celular osteolítica PC3-MM2, la disminución observada en la fosfatasa alcalina murino (que representa la actividad osteoblástica) pone de relieve la interdependencia de estas células en el proceso de el recambio óseo. El dasatinib solo se ha mostrado para inducir la maduración de osteoblastos [38]; por lo tanto, posiblemente, el aumento de la secreción de RANKL, que a su vez activa normalmente los osteoclastos. Sin embargo, como se muestra en la Src - /- de ratón [39], Src es también un importante regulador de la función de los osteoclastos, y esto se confirma por la conservación del hueso en las células tratadas (Fig 4B). Dasatinib independiente. Sin embargo, en los modelos usados, dasatinib como agente único en la concentración más baja utilizada es insuficiente para inhibir el crecimiento del tumor, lo que sugiere que en estas condiciones, la expresión de RANKL activa al menos parcialmente función de los osteoclastos, pero que la adición de BMS-754807 a dasatinib probablemente inhibe la maduración de osteoblastos, disminuyendo aún más actividad de los osteoclastos. Este resultado parece ocurrir en cada modelo, y por lo tanto es una característica constante de esta combinación de fármacos. Se inyectaron
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P Hotel & lt; 0,05 vs combinación única de dasatinib. (B) las exploraciones de TC representativos (arriba) y rayos X (abajo) de los ratones en cada grupo.