Extracto
El factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la ciclooxigenasa-2 (COX-2) juegan un papel fundamental en la progresión de la enfermedad, la recaída y la resistencia terapéutica del cáncer de próstata avanzado (PCA). En este trabajo, se evaluó, por primera vez, el beneficio terapéutico de bloquear EGRF y /o la COX-2 (con gefitinib y NS-398, respectivamente) en términos de mejora de la eficacia del docetaxel fármaco quimioterapéutico clínica convencional in vitro y vivo. Hemos demostrado que el EGFR y la COX-2 expresión fue mayor en metastásico de tejidos y células no metastásicas CaP. Docetaxel, solo o en combinación con gefitinib o NS-398, dio lugar a una pequeña disminución en la viabilidad celular. La combinación de tres fármacos redujo la viabilidad celular en un grado mayor que docetaxel solo o en combinación con gefitinib o NS-398. Docetaxel resultó en un aumento modesto de la célula apoptótica en líneas de células metastásicas y no metastásicas. NS-398 notablemente mayor apoptosis de las células inducida por docetaxel. La combinación de los tres fármacos causó aún más marcada apoptosis y dio lugar a una mayor supresión de potencial invasivo que docetaxel solo o en asociación con gefitinib o NS-398. La combinación de los tres fármacos también resultó en una disminución más marcada en NF-kappa B, los niveles de VEGF MMP-9 y en las células PC-3M. Estos resultados in vitro fueron apoyados por los estudios in vivo que muestran que el docetaxel en combinación con gefitinib y NS-398 fue significativamente más eficaz que cualquier agente individual. Sobre la base de la investigación preclínica anterior, llegamos a la conclusión de que el bloqueo simultáneamente EGFR y la COX-2 por gefitinib y NS-398 sensibiliza a las células CaP avanzado a la citotoxicidad inducida por docetaxel.
Visto: Lin J, Wu H, H Shi, Pan W, Yu H, Zhu J (2013) Combinada de inhibición del factor de crecimiento epidérmico y la ciclooxigenasa-2 conduce a la actividad antitumoral mayor de docetaxel en Avanzada Cancer de prostata. PLoS ONE 8 (10): e76169. doi: 10.1371 /journal.pone.0076169
Editor: Wendy J. Huss, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Marzo, 2013; Aceptado 21 de agosto de 2013; Publicado: 14 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo ha apoyado por el proyecto de planificación de Ciencia y Tecnología de Nanjing, china (201 201 088). La URL de la página web del proveedor de fondos es http://202.127.12.44/XMSB/Show_JBXXB.jsp?XMBH=2012sc315043&DJXH=20121069. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia maligna más común, y es una de las principales causas de muerte entre los hombres de edad avanzada [1]. La tasa de respuesta a la terapia y la prostatectomía radical supresión hormonal es elevada en los pacientes con diagnóstico de cánceres localizados y andrógeno-dependientes. Sin embargo, la progresión de cánceres hormono-refractario de próstata (CPRH) y /o la metástasis ósea se asocia con recaída de la enfermedad y pobre supervivencia de los pacientes [2-4]. De hecho, la progresión del cáncer de próstata a la independencia de andrógenos sigue siendo un obstáculo principal para mejorar la supervivencia de los pacientes, ya que se asocia con cambios celulares subyacentes complejos.
Docetaxel se considera como el agente quimioterapéutico estándar para pacientes con CPRH y en aquellos con evidencia clínica de metástasis. Se ha informado de mejorar la calidad de vida y ofrece alivio del dolor, pero se asocia con un mínimo de una tasa de supervivencia media de sólo 12 a 19 meses desde el inicio del tratamiento. Esto pone de relieve la necesidad de ensayos que investigan cómo optimizar los regímenes quimioterapéuticos convencionales en pacientes con CPRH o CP avanzado.
La investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del CaP, ayudarán a identificar los supuestos genes diana terapéuticos implicados en la apoptosis. También ayudará a dilucidar el mecanismo responsable para el crecimiento y la señalización celular [5-8]. EGFR y la COX-2 han sido ambos demostrado que contribuyen al crecimiento sostenido de avanzada CaPHR en la ausencia o presencia de bajas concentraciones de andrógenos [9-11].
El EGFR se sobreexpresa frecuentemente en los cánceres humanos. Los datos preclínicos sugieren que las vías de señalización del EGFR activan los receptores de andrógenos en condiciones de privación de andrógenos clínica. Esto está relacionado con la transición del andrógeno-sensibles al fenotipo refractario a las hormonas, lo que resulta en un resultado clínico más agresivo [10,11]. EGFR es, por lo tanto, supone que es de importancia terapéutica primaria, debido a su sobreexpresión en el CaP avanzado y su papel como diana terapéutica. Estudios previos han demostrado que la activación de EGFR mejora la capacidad de los receptores de andrógenos para aumentar la proliferación CaP. Por el contrario, la inhibición de EGFR ha demostrado mejorar la eficacia de docetaxel en el tratamiento de CaP metastásico [12,13].
ciclooxigenasas catalizan la formación de prostaglandinas involucradas en la iniciación del tumor y /o la progresión. COX-2 se ha demostrado que promover la inflamación, lo que puede contribuir directamente al desarrollo del CaP [14]. También se ha demostrado que la inducida por la COX-2 PGE2 activa de señalización implicadas en la proliferación y promueve de este modo directamente el crecimiento de células tumorales de células. Otros estudios han demostrado que la COX-2 se sobreexpresa en el CaP y que su nivel de expresión se correlaciona con la puntuación de Gleason, la progresión del cáncer y la recurrencia [15,16]. En los últimos años, los inhibidores de la COX-2 en combinación con fármacos quimioterapéuticos han sido evaluadas en el tratamiento del CaP avanzado. Estos agentes aumentan significativamente la eficacia de la eliminación de andrógenos y promueven la resolución de las lesiones esqueléticas [17,18]. Se acepta generalmente que la COX-2 contribuye a la PCa y hay pruebas de montaje que sugieren que los inhibidores de la COX-2 puede ser beneficioso en el tratamiento del CaP.
Estudios previos han confirmado que la alta expresión de la COX-2 en el CaP se correlaciona con la resistencia a docetaxel, y que la inhibición de la COX-2 disminuye significativamente el crecimiento del tumor y mejora la eficacia de docetaxel [19,20]. Basándose en estas observaciones, es posible que la adición de inhibidores selectivos de EGFR y COX-2 puede representar un nuevo enfoque terapéutico para mejorar el tratamiento del CaP metastásico. En el presente estudio, la hipótesis de que el bloqueo simultáneo de EGFR y la COX-2 vías utilizando gefitinib y NS-398 podría mejorar los efectos citotóxicos de docetaxel en el CaP avanzado in vitro e in vivo. El anti-proliferativos, anti-invasivo, y de inducción de apoptosis efectos de los tres agentes, solos y en combinación, se determinaron in vitro e in vivo y los mecanismos moleculares subyacentes fueron investigados.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Nanjing. La investigación clínica fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Nanjing. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos antes de la participación en el estudio.
Las muestras tumorales y líneas celulares
muestras de PCA de 37 casos de adenocarcinoma primario se incluyeron el estudio. En todos los casos dos patólogos independientes revisaron los especímenes para excluir otros tipos patológicos. Todas las muestras se obtuvieron mediante la resección transuretral de la próstata, la prostatectomía radical o la aguja de biopsia en el Hospital de Nanjing y BenQ Primer Hospital de Nanjing, entre 2010 y 2012. La estadificación quirúrgica de los tumores se realizó de acuerdo a los criterios de Jewett-Whitmore. La edad media de los pacientes fue de 69 años (rango 58 a 79 años).
La próstata humano LNCaP líneas celulares de cáncer, PC-3M y DU-145 utilizados en el estudio fueron adquiridos de la American Type Culture Collection y se mantuvieron en medio de cultivo RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal 10%, 26 mmol /L NaH
2CO
3 (pH 7,4), 1% de L-glutamina, y antibióticos (100 UI /ml de penicilina-100μg /ml de estreptomicina) a 37 ° C en 5% de CO
2. RPMI 1640 y otros materiales de cultivo se suministraron por Gibco.
Reactivos y anticuerpos
Gefitinib, NS-398, docetaxel y MTT se adquirieron de Sigma. Anexina V-FITC fue suministrado por Gibco. Los anticuerpos contra el VEGF humano y MMP-9 se obtuvieron de amp I +; D System y Bioworld, respectivamente. monoclonal antihumano COX-2, EGFR monoclonal y los anticuerpos VEGF monoclonales se obtuvieron de Santa Cruz. Anticuerpo contra P65 NF-kappa B humana se adquirió de Abcam. Los anticuerpos monoclonales para GAPDH (Bioworld) y β-actina (Sigma) se utilizaron como controles experimentales.
La inmunohistoquímica
Las secciones histológicas (4 M) fijados en formalina al 10% y embebidos en parafina se utiliza para la tinción inmunohistoquímica. Antes de una tinción de anticuerpo primario, los portaobjetos se trataron previamente con ácido cítrico o tampón de ácido etilendiaminotetraacético en una olla a presión para la recuperación de antígenos. Todos los anticuerpos primarios utilizados en el estudio fueron anticuerpos monoclonales biotinilados.
La actividad peroxidasa endógena se inactivó usando 3% H
2O
2 reactivo de bloqueo durante 10 min. Los portaobjetos se incubaron después con un anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche, antes de la inmunotinción con el complejo de peroxidasa de avidina-biotina (100: l). Los portaobjetos se tiñeron con diaminobenzidina de acuerdo con el protocolo del fabricante (DAKO, CA). Los portaobjetos se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato después de cada etapa de tinción. Las secciones se tiñeron con una dilución 1: del anticuerpo 200 contra EGFR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), y 1: dilución del anticuerpo contra la COX-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA 100, EE.UU.), respectivamente.
Los portaobjetos teñidos fueron evaluados cuantitativa o semi-cuantitativamente por dos patólogos independientes que eran ciegos a los datos clínicos. La mediana del número de células tumorales tinción positiva para la COX-2 y EGFR era 10% en cada caso. El porcentaje de células positivas teñidas con anticuerpo especial observado por dos patólogos fueron consistentes y se determinaron los valores medios.
Cultura y ensayos de viabilidad celular
Los efectos de los agentes individuales, y de combinaciones dobles y triples de los agentes sobre líneas celulares DU-145 PC-3M y se determinaron después de 48 h de exposición a 3- (4,5-dimetylthiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT). La reproducibilidad se confirmó en tres experimentos independientes. Para probar la viabilidad después de la exposición a gefitinib, NS-398 y solo o en combinación docetaxel, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de aproximadamente 5 x 10
4 /mL (en 100 l de medio por pocillo) y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Sobre la base de estudios previos, se optó por concentraciones de 20 mmol /L de gefitinib, 100 mmol /L) NS-398 y 0.01μmol /L docetaxel para todos los ensayos. Las células expuestas a DMSO se utilizaron como controles no tratados.
In vitro invasión ensayo
El potencial invasivo de las células de cáncer de próstata se estimó por su capacidad de penetrar en una cámara de invasión de Matrigel que comprende una membrana de tereftalato de polietileno tamaño 8 micras de poro, y una capa fina de Matrigel matriz. PC-3M y se utilizaron DU-145 células de control o células previamente expuestas durante 24 h a gefitinib (10 mmol /L), NS-398 (50 mmol /L), o docetaxel (0,005 mol /L) solo o en combinación en el ensayo de invasión celular. En cada experimento, 5 × 10
4 /ml de células por pocillo, en medio sin drogas (control) o que contiene los fármacos, se cargaron en la parte superior de la cámara de la invasión de células Matrigel o en la cámara de control de inserción sin Matrigel, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la incubación durante 24 horas a 37 ° C, las células invasoras que llegan a la cámara inferior se tiñeron con cristal violeta ,, y se contaron mediante microscopía de contraste de fase. El número de células invasoras se calculó como el número medio de invadir a través de la membrana de Matrigel insertar en cinco campos microscópicos al azar.
Flujo citofluorométrico
analiza
Las células fueron expuestas a gefitinib (20 mmol /L) , NS-398 (100 mmol /L), o docetaxel (0,01 mol /L), solo o en combinación. Después de 24 h de incubación, tanto el crecimiento como medio de lavado se salvaron, y las células se recogieron con tripsina. Se retiraron los sobrenadantes y los sedimentos se resuspendieron en 400 l de yoduro de propidio (PI) solución (50 mg /ml PI, 0.1% Triton X-100, y 0,1% de citrato de sodio en PBS). Las muestras fueron incubadas durante la noche a 4 ° C en la oscuridad antes del análisis. Citometría de flujo se cuantificó para determinar el porcentaje de células que contienen células apoptóticas, necróticas.
transcripción inversa y PCR en tiempo real
PC-3M y células DU-145 cultivadas en FBS al 1% fueron expuestos durante 24 h a gefitinib (20 mmol /L), NS-398 (100 mmol /L), o docetaxel (0,01 mol /L) solo o en combinación. Las células expuestas a DMSO como vehículo, se utilizaron como controles. El ARN total se aisló usando reactivo Trizol. Un microgramo de ARN se transcribió de forma inversa usando un sistema de transcripción inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se utilizó para cuantificar la expresión de ARNm. Las secuencias de los cebadores utilizados son los siguientes: MMP9 (adelante: 5'-TC GAACTTTGACAGCGACAAGA-3 'y revertir 5'-TCAGGGCGAGGACCATAGAG'-3), NF-kappa B (hacia adelante: 5'-3' y revertir TGGACCGCTTGGGTAACTCT-5'-GGCTATTGCTCATCA TGGCTAG-3 '), VEGF (adelante: 5'-3' y revertir CTATCAGCGCAGCTACTGCCAT-5'-GCACACAGGATGGCTTGAAGAT-3 '). GADPH se utilizó como un control interno para corregir la variación potencial en la carga de ARN. Objetivo y GAPDH genes se llevaron a cabo en las mismas condiciones. Todas las reacciones se llevaron a cabo en un volumen de 20 l que contiene el cDNA de la muestra, TaqMan PCR Universal rápidas mezcla maestra, cebadores y sondas. Las condiciones de PCR fueron de 40 a 45 ciclos a 95 ° C durante 15 s, seguido de 1 min ciclos de 59 a 65 ° C.
ensayo Western blot
células PC-3M y DU-145 expuesto a los medicamentos descritos anteriormente se recogieron por raspado de los pocillos y lavados dos veces con PBS frío. El sedimento celular se suspendió en 125 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), se sonicó durante 10 s antes de la adición de un volumen igual de 4% de SDS. Los lisados se hirvieron durante 10 min. La concentración de proteína se determinó usando un ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL).
Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa, bloqueada, y se incubaron con anticuerpos primarios de la siguiente manera: VEGF diluyó 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, EE.UU.), MMP -9 (4 mg /ml, R & amp; D Systems), NF-kB ((Abcam Ltd., Reino Unido).), y β-actina 1: 10000 (Sigma) /GAPDH 1: 10000 (Bioworld). A continuación, la membrana se lavó y se incubó con anticuerpos secundarios (Bioworld) conjugado con peroxidasa. la detección de proteínas se llevó a cabo utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia (Thermo).
Los experimentos con animales
Cuatro de 6 semanas de edad BALB /c nu /nu ratones se obtuvieron del SLAC Animales de Laboratorio Co Ltd (Shanghai, china). Los tumores se hicieron crecer de forma bilateral en ratones desnudos atímicos mediante inyección subcutánea de 5 x 10
4-10
5 células PC-3M (suspendidas en PBS) por animal. Los tumores de 0.2 cm
3 de diámetro fueron detectados después de 7 días bien establecidas. Los ratones fueron aleatorizados en los siguientes grupos de seis: los controles no tratados, gefitinib (50 mg /kg, qd, po), NS-398 (200 mg /kg, qd, po), docetaxel (0,05 mg /kg, qd, po), gefitinib y docetaxel, NS-398 y docetaxel, gefitinib, NS-398 y docetaxel.
medidas de los tumores se realizaron a lo largo de periodos de tratamiento y observación. El volumen del tumor se midió usando la fórmula: π /6 x diámetro más grande
×
(diámetro más pequeño)
2. La cirugía se realiza bajo anestesia con ketamina /xilazina, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Análisis FODA
Estadística
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa SPSS versión 16.0. Los datos son medias y desviaciones estándar (± DE) presentan. El índice para el tratamiento de combinación en PC-3 M y las células DU-145 se calculó usando software Calcusyn. De acuerdo con este método, los valores de CI de & lt; 1, 1 y & gt; 1 representados, respectivamente, la sinergia, la aditividad y antagonismo [21]
in vitro e in vivo en se analizaron mediante la prueba t de Student.. la expresión de EGFR y la COX-2 en los tejidos de CaP no metastásicos y metastásicos se compararon mediante la prueba de chi-cuadrado de Pearson .. Los valores de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
EGFR. y COX-2 niveles de proteína en los tejidos de cáncer de próstata
expresión de EGFR fue positiva en siete tejidos con CaP no metastásico (43,8%) y en 18 (85,7%) muestras de tejido de pacientes con CaP metastásico (
P
& lt; 0,01). intensidad de la tinción para la COX-2 se observó en 18 metastásico (85,7%) y nueve tejidos CaP no metastásico (56,3%, p = 0,11). EGFR y COX-2 coexpresión positivo se encontró en 16 tejidos metastásicos (76,2%) y en cuatro (25,0%) los tejidos de CaP no metastásicos (P & lt; 0,01). Los resultados se muestran en la Figura 1 y Tabla 1.
Las secciones se examinaron bajo un microscopio, y inmunoreactividad se indican mediante tinción de color marrón oscuro. secciones representativas de muestras de tejido de cáncer de próstata obtenidos a ampliaciones de originales × 200 y 400 ×.
Etapa
n
Número (%) pacientes
EGFR + COX 2+
EGFR + COX-2-
EGFR-COX-2 +
EGFR-COX-2-
A + B164 (25,0%) 3 (18,8%) 5 (31,2%) 4 (25,0%) C + D2116 (76,2%) 2 (9,5%) 2 (9,5%) 1 (4,8%) Tabla 1. La expresión positiva de EGFR y COX-2 en el cáncer de próstata no metastásico y metastásico.
la estadificación patológica del CP se define de acuerdo con el sistema de estadificación de Whitmore-Jewett como followsA (dicho sea de paso descubrió CaP), B (CaP limitada), C (invasión de órganos adyacentes) D (metástasis a distancia o la afectación ganglionar) .Jewett fase a y B se define como C o D no metastásico y la etapa como metastásico. Descargar CSV CSV
expresión de línea de base y la activación de EGFR y la COX-2 de proteínas en PC-3M y células DU-145
El nivel basal del total de EGFR, p-EGFR y la COX-2 se midió en PC-3M y células DU-145. a continuación, se investigó si EGF se asoció con un aumento de estos niveles. Los resultados indicaron que la conexión /EGFR fosforilado (p-EGFR), EGFR y la proteína COX-2 se expresaron en ambas líneas celulares (Figura 2A). p-EGFR y COX-2 expresión se incrementaron significativamente en las dos líneas celulares mediante la adición de EGF, pero la expresión de EGFR se mantuvo sin cambios. El cambio en la relación de p-EGFR /EGFR era dependiente de la dosis (Figura 2B).
Las células cultivadas en FBS al 1% fueron expuestas a 0, 10 y 100 ng /ml de EGF durante 24 h como se describe en Materiales y Métodos. Las proteínas celulares resultantes se sometieron a SDS-PAGE y análisis de transferencia Western para determinar los niveles de proteína de p-EGFR, EGFR y COX-2 (Figura 2A). Western blot para β-actina se muestra como el control de carga. El nivel de proteína relativa para p-EGFR /EGFR y la COX-2 se muestra en la Figura 2B.
efecto anti-proliferativa inducida por docetaxel solo o en combinación con gefitinib y NS-398
ensayos de MTT se utilizaron para evaluar el efecto anti-proliferativo de los tres medicamentos solos o en combinaciones, en PC-3 M y las células DU-145. En experimentos preliminares, establecimos las curvas de concentración-respuesta para cada fármaco para determinar la concentración que produjo una inhibición del crecimiento de menos de 30% en las células de las líneas de CaP (datos no mostrados). Sobre la base de estas curvas, se determinó la que las concentraciones de docetaxel (0,01 mol /L), gefitinib (20 mmol /L), o NS-398 (100 mmol /L) eran apropiados para su uso en los experimentos de combinación. Co-incubación con gefitinib o NS-398 mejora ligeramente el efecto citotóxico del docetaxel. Sin embargo, la combinación de tres fármacos indujo un mayor que un efecto aditivo sobre el crecimiento celular de inhibición en ambas líneas celulares que fue mucho más marcada que la observada con cualquier uno o dos fármacos combinaciones (Figura 3). Análisis de tratamiento de combinación en PC-3 M y las células DU-145 indicaron que el índice de combinación para la combinación de tres agentes era & lt; 1 indica un efecto sinérgico (Tabla 2 y 3)
La respuesta de concentración-respuesta para. cada fármaco se utilizó para determinar la concentración que induce un efecto anti-proliferativo apropiado para su uso en la terapia de combinación (datos no mostrados). Las células se expusieron a docetaxel (0,01 mol /L), NS-398 (100 mmol /L) y gefitinib (20 mmol /L) solo o en combinación para 24 h. Los valores son medias ± DE de cuatro experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,005 ***, P & lt; 0,001 en comparación con los valores de control. líneas celulares
G (M)
D (nM)
Fa
CI
N (M)
D (nM)
Fa
CI
PC-3M1050.2151.1535050.2110.98220100.2801.049100100.3080.72640200.3631.118200200.3881.023DU-1451050.1861.8395050.2640.96620100.2651.114100100.3830.92440200.3251.092200200.5850.956Table 2. Efecto de gefitinib (G) o NS-398 (N) en combinación con docetaxel (D) en el PC-3M y células DU-145.
CSV Descargar líneas celulares CSV
G (M)
N (M)
Dl (nM)
Fa
CI
PC-3M105050.3020.74520100100.4650.71240200200.6610.699DU-145105050.2640.96620100100.4230.78340200200.6210.872Table 3. Efecto de gefitinib (G), NS-398 (N) y docetaxel (D) en combinación PC-3M y DU-145 células.
Tratamientos de combinación con gefitinib (10, 20, y 40 mM), NS- 398 (50, 100, y 200 mM), y docetaxel (5, 10, y 20 nM) en PC-3M y DU-145. Las líneas celulares se evaluaron mediante el ensayo de MTT. Fa: Fracción de crecimiento afectan a las células expuestos a las drogas en comparación con los controles. CI, índice de combinación. Fa y IC se calcularon usando el software Calcusyn. Descargar CSV CSV
Efecto citotóxico inducido por docetaxel, gefitinib, y NS-398
se utilizaron análisis de citometría
de flujo para determinar la apoptosis celular inducida por cualquier fármaco solo o en combinación. El número de células apoptóticas se cuantificó (Figura 4A y C). Tanto docetaxel y gefitinib, pero no NS-398, aumentó ligeramente el número de células apoptóticas en comparación con la observada en células de CaP no tratados (Figura 4B y D). Docetaxel en combinación con gefitinib o NS-398, se asoció con un aumento en el número de células apoptóticas en comparación con docetaxel solo (Figura 4B y D). La combinación de tres fármacos dio lugar a una significativamente mayor número de células apoptóticas que cualquier medicamento único o dos fármacos de combinación (Figura 4B y D).
Después de la incubación con diversos fármacos, se prepararon las células tal como se describe en Materiales y Métodos y la tasa de apoptosis se evaluó mediante análisis de FACS. A y C: gráficos de puntos representativos ilustran los datos cercanos a la media de los grupos en B y D. B y D. La apoptosis tasa se calculó a partir UR (no viable por apoptosis o necrosis celular tasa) y LR (velocidad de célula apoptótica temprana) asociación. Los resultados representativos de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,005 ***, P & lt;. 0.001 en comparación con los valores de control
Pérdida de la capacidad invasiva inducida por docetaxel, gefitinib, y NS-398
Un ensayo de invasión in vitro se utilizó para evaluar la capacidad invasiva de las células PC-3M y DU145. El potencial invasivo se determinó mediante el cálculo del número de células que penetraron una cámara de invasión de Matrigel. Como se muestra en la Figura 5A y C, las células que exponen a 0,005 mol /L docetaxel, 10 mmol /L gefitinib, o 50 mmol /L NS-398 inhibió significativamente su capacidad invasiva (Figura 5B y D).
La las células se dejaron sin tratar (control) o se expusieron durante 24 h a 0,005 mol /L docetaxel (D), 10 mmol /L gefitinib (G) o 50 mmol /LNS-398 (N), solos o en combinación durante los ensayos de invasión in vitro, realizado utilizando transwell cámaras bicamerales como se describe en Materiales y Métodos. Al final del ensayo de 24 h, las células invasoras se tiñeron y se contaron mediante microscopía de contraste de fase (x 200). Los resultados representativos muestran el número medio de células invasoras a través del Matrigel insertar membrana en cinco campos microscópicos aleatorios. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,005, ***, P & lt;. 0,001 en comparación con los valores de control
La exposición a docetaxel en combinación con gefitinib o NS-398 redujo notablemente el número de las células DU-145 que penetran en el Matrigel en comparación con docetaxel solo (Figura 5D), pero no se observaron diferencias en las células PC-3M (Figura 5B). La combinación de tres fármacos mostró un efecto inhibidor supra-aditivo en la capacidad de invasión de células, que era más fuerte que cualquier combinación de dos fármacos (Figura 5B y D).
NF-kappa B, MMP-9 y la expresión del VEGF cambios inducidos por docetaxel, gefitinib, y NS-398
las proteínas y ARNm y se cuantificaron para investigar si NF-kappa B, MMP-9 y VEGF, estaban involucrados en las respuestas celulares a docetaxel, gefitinib o NS-398. Los resultados en la Figura 6A y 6B, muestran que docetaxel, gefitinib y NS-398 cada downregulated separado NF-kappa B, MMP-9 y la expresión de ARNm de VEGF en ambas líneas celulares de CaP. NF-kappa B la expresión de ARNm era más marcadamente reducido regulado cuando las células fueron expuestas a combinaciones de fármacos. Las tres combinaciones de fármacos mostró un efecto inhibidor más fuerte que las dos combinaciones de fármacos (Figura 6A y B).
Las células cultivadas en FBS al 1% fueron expuestos a 0,01 mol /L docetaxel (D), 20 mmol /L gefitinib (G) or100 mol /LNS-398 (N), solo o en combinación, o con DMSO como control para 24 h. NF-KB, MMP-9 y mRNA de VEGF (A y B) y los niveles de proteína (C y D) se midieron como se describe en Materiales y Métodos. Los valores se expresan como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Ni gefitinib ni NS-398 tuvo ningún efecto aditivo sobre la regulación a la baja de docetaxel inducida por la expresión del ARNm de la MMP-9 y VEGF (Figura 6 A y B ). Sin embargo, la co-incubación con los tres agentes se tradujo en más marcada inhibición de los niveles de VEGF MMP-9 y en comparación con la combinación de una o dos fármacos en las células PC-3M (Figura 6A) pero no en DU-145 células (Figura 6B),
transferencia de Western se realizó para estimar los niveles de proteína de NF-kappa B MMP-9 y VEGF después de la exposición a cada uno de los fármacos. Como se muestra en la Figura 6C y 6D, la adición de docetaxel a gefitinib y /o NS-398 en combinación doble y triple cambió NF-kappa B, MMP-9 y los niveles de proteína VEGF en ambas líneas celulares. Estos resultados son generalmente consistentes con los cambios de ARNm a excepción de los cambios en la proteína NF-kappa B después de la exposición a una combinación de docetaxel y NS-398, (Figura 6C y D). En conjunto, estos resultados sugieren que la respuesta beneficiosa de las células PC-3M a la exposición al docetaxel, gefitinib y NS-398 de combinación, es influenciado por una reducción de NF-kappa B, MMP-9 y VEGF (Figura 6C).
Efectos de gefitinib, NS-398 y docetaxel en el crecimiento del tumor de próstata in vivo
docetaxel en combinación con gefitinib o 398 NS-inhibió el crecimiento tumoral y a un grado significativamente mayor que en los controles no tratados o los animales tratados con un solo fármaco (Figura 7). En estos grupos de combinación dual sólo un modesto aumento en el tamaño del tumor se registró al final del experimento 6 semanas después de la inyección de células tumorales y 2 semanas después de interrumpir el tratamiento. El tratamiento combinado con cualquiera de los dos fármacos o con los tres fármacos fue bien tolerado; Se observaron ninguna pérdida de peso u otros signos de toxicidad aguda o retardada. Se inyectaron
Los ratones en el flanco dorsal con células PC3M. Después de 7 días (el tamaño del tumor promedio: 0.2 cm
3), los ratones fueron tratados como se describe en la sección Materiales y Métodos. Cambio en el volumen del tumor se evaluó después de la exposición a Doc, gefitinib y NS-398 solo o en combinación. Los datos se muestran como media ± desviación estándar.
Discusión
El docetaxel juega un papel importante en el tratamiento del CaP avanzado. Sin embargo, el tratamiento a largo plazo con frecuencia resulta en efectos secundarios y la resistencia a la quimioterapia, lo que resulta en la recurrencia de la enfermedad y la supervivencia de los pobres. En un intento de superar la resistencia a fármacos, estudios recientes se han centrado en docetaxel baja dosificación en combinación con otros fármacos o en el silenciamiento de algunos genes [22-25].
EGFR y COX-2 son sobre-expresado en una serie de tumores malignos incluyendo CaP. Un creciente cuerpo de evidencia demuestra que la COX-2 actividades de señalización del EGFR y juegan un papel crucial en el desarrollo de enfermedades malignas. Ambas vías, por lo tanto, proporcionan dianas atractivas para la terapia contra el cáncer y la quimioprevención [5-8,26,27]. En consecuencia, EGFR y los inhibidores de la COX-2 han sido investigados por la quimioterapia y la prevención del cáncer [28-31].
La sobreexpresión de EGFR y COX-2 y la interacción entre la señalización de EGFR y la actividad de la COX-2 han sido implicados como factores causantes de cáncer [32,33]. En nuestra in vitro e in vivo, hemos demostrado importantes sobre regulación de EGFR y la COX-2 expresión en tejido CaP avanzado (Tabla 1) y en los correspondientes líneas celulares (Figura 2). Previamente se ha informado de que la activación o sobreexpresión de EGFR [12,13] y la COX-2 [20] se correlaciona con la resistencia a docetaxel. Esto nos llevó a especular que al mismo tiempo apuntando EGFR y la COX-2 pueden ser una estrategia terapéutica más eficaz para superar la resistencia de docetaxel orientación ya sea vía de señalización separado.
Nuestros resultados muestran que el bloqueo de EGFR simultáneamente con gefitinib y COX-2 con NS-398 en células de CaP sometidos a docetaxel en dosis baja dio lugar a un efecto beneficioso en la inhibición del crecimiento celular (Figura 3). análisis de la mediana del efecto utilizando el método de CI de Chou y Talalay confirmó una interacción moderadamente sinérgica entre estos tres fármacos en ambas líneas celulares de CaP (Tabla 2 y 3). En la apoptosis de las células y ensayos de invasión el efecto combinado de los tres fármacos fue ligeramente mayor que aditivo en las dos líneas celulares. Estos resultados son consistentes con los hallazgos de la prueba de proliferación de MTT, lo que sugiere que esta nueva combinación de fármacos puede ser eficaz en la prevención de crecimiento tumoral y la metástasis a distancia.
También se demostró que la combinación de tres fármacos se asocia con la apoptosis celular marcada (Figura 4) y la pérdida de la capacidad invasiva (Figura 5). En un estudio anterior gefitinib tenido actividad como agente único, pero su combinación con docetaxel se asoció con la misma tasa de respuesta en el CaP avanzado como monoterapia con docetaxel [7]. También se ha demostrado que la inhibición de la ciclooxigenasa-2 aumenta docetaxel inducida apoptosis [17], que es coherente con los resultados de nuestro estudio. Sin embargo, a largo plazo, la terapia de dosis alta con esta combinación está asociada con la toxicidad y los efectos secundarios que impide su uso en la práctica clínica. Altas dosis de docetaxel se asocia con lesiones del sistema nervioso, hematopoyético la represión y la quimio-resistencia que hace que sea la ONU conveniente para muchos pacientes con enfermedad avanzada
Es importante destacar, que mostró que la adición de un inhibidor de EGFR y la COX-2 inhibidor específico de dosis baja regímenes de docetaxel puede proporcionar una estrategia para reducir los efectos secundarios relacionados con la dosis. Al mismo tiempo la orientación EGFR y COX-2 parecen sensibilizar a las células de CaP a los efectos de docetaxel en vitro. Nuestros resultados en vivo fueron consistentes con estos resultados in vitro, lo que indica que el tratamiento combinado es superior a la terapia única o doble agente. La combinación de cualquiera de los dos fármacos, o los tres fármacos, fue bien tolerado. No toxicidad aguda o retardada se observó en ninguno de los animales.