Extracto
Hay una necesidad urgente de mejorar la terapia para el carcinoma de ovario avanzado, que puede cumplirse mediante la administración de anticuerpos monoclonales inmunomoduladores (mAbs) para generar una respuesta inmunitaria a un tumor destructivo. Usando el modelo de cáncer de ovario ID8 ratón, se investigó la eficacia terapéutica de varias combinaciones de mAb en los ratones con tumor intraperitoneal (i.p.), establecido mediante el trasplante de 3 × 10
6 células ID8 10 días previamente. Mientras que la mayoría de los mAbs ensayados eran ineficaces cuando se administran de forma individual o en conjunto, los datos confirman nuestra anterior conclusión de que el 2 por vía intraperitoneal inyecciones de una combinación de anti-CD137 con anti-PD-1 mAbs duplica la supervivencia global. Los ratones tratados con esta combinación de mAb tienen una frecuencia significativamente mayor y el número total de CD8
+ células T, tanto en el lavado peritoneal y bazos, y estas células son funcionales como se demuestra por la actividad citolítica y IFN-γ producción específica de antígeno. Mientras que la administración de anti-CD137 mAb como agente único asimismo, aumenta las células CD8
+ T, éstos no tienen actividad funcional, lo que puede atribuirse a la regulación de los co-inhibidor PD-1 y TIM-3 moléculas inducidas por CD137 . La adición del cisplatino medicamento contra el cáncer a la combinación 2 mAb aumentó la supervivencia global & gt; 90 días (y probablemente era curativo) por un mecanismo que incluye un CD8 sistémica
+ respuesta de células T con especificidad tumoral y la memoria inmunológica. Sorprendentemente, el tratamiento combinado de cisplatino y CD137 /PD-1 mAb también dio lugar a la supervivencia a largo plazo de ratones con tumores de pulmón TC1 establecidos. Una combinación similar de los 2 anticuerpos monoclonales y cisplatino debe ser considerado para la "traducción" clínica.
Visto: Wei H, L Zhao, Li W, Ventilador K, W Qian, Hou S, et al. (2013) Combinatoria PD-1 y CD137 bloqueo de activación tiene eficacia terapéutica en modelos murinos de cáncer y la sinergia con cisplatino. PLoS ONE 8 (12): e84927. doi: 10.1371 /journal.pone.0084927
Editor: Ramón Arens, Universidad de Leiden, Países Bajos
Recibido: 5 de Junio, 2013; Aceptado: noviembre 20, 2013; Publicado: 19 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81372528), Ministerio de Ciencia & amp; Tecnología de China "973" (Nº 2012CB917104), donaciones especiales de Ministerio de Educación de China y Shanghai Comisión de Educación para un excelente equipo de investigación en oncología y Shanghai KeyProject en oncología, así como por RO1CA134487 de EE.UU. Institutos Nacionales de Salud. Los organismos de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
epitelial (EOC) es la principal causa de muerte por tumores malignos ginecológicos en los Estados Unidos y es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en las mujeres [1]. Más del 70% de las mujeres con EOC se presentan con enfermedad en estadio avanzado y diseminación del tumor a lo largo de la cavidad peritoneal [2]. El tratamiento estándar para el cáncer de ovario es la citorreducción quirúrgica seguida de quimioterapia basada en platino-taxano [3]. El cisplatino y sus derivados de platino son agentes quimioterapéuticos de primera línea en el tratamiento de cáncer de ovario. El cisplatino induce apoptosis intercalando irreversiblemente ADN a través de aductos de ADN inter e intracatenarios, induciendo de este modo el daño del ADN y la activación de la maquinaria apoptótica [4]. La mayoría de los pacientes responden a la quimioterapia en un primer momento; Sin embargo, la mayoría eventualmente tendrá una recaída y morir de la enfermedad. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias complementarias para mejorar los resultados del cáncer de ovario.
Hay varias razones para esperar que la inmunoterapia para el EOC puede ser eficaz [5]. EOC células expresan antígenos asociados al tumor contra el que se han detectado respuestas inmunes específicas [6-10]. Los estudios por primera vez por Coukos indican que los mecanismos inmunológicos desempeñan un papel importante en el resultado clínico ya que existe una estrecha correlación entre la supervivencia y la infiltración tumoral con CD3
+ células T [11]. metástasis EOC son frecuentemente restringidos a la cavidad peritoneal, lo que facilita la administración local de agentes terapéuticos [12]. La mayoría de los pacientes con enfermedad avanzada se pueden poner en remisión clínica temporal donde la carga del tumor es pequeño y por lo tanto, más propensos a responder [9]. Sin embargo, el éxito clínico con inmunoterapias para el COE ha sido modesto [13].
Varios estudios recientes han demostrado eficacia terapéutica, tanto en modelos de ratón y pacientes humanos mediante la administración de mAbs que pueden modificar la respuesta inmune cuando se usa solo o en combinaciones. Por ejemplo, mAbs a CTLA4 tienen una eficacia antitumoral con la supervivencia global prolongada en pacientes con melanoma metastásico, y un anti-CTLA4 mAb está aprobado clínicamente por la FDA [14]. efectos terapéuticos beneficiosos se han demostrado en ratones con tumores establecidos [14,15], comprometiendo por CD137 (también conocido como el 4-1BB), utilizando anticuerpos agonistas, aptámeros de ARN dimérica o células tumorales que expresan un anticuerpo de CD137 contra de una sola cadena unido a la superficie [15, 16], y los datos preclínicos han llevado a ensayos clínicos con anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos contra CD137 [17]. Muerte programada de 1 (PD-1), la proteína es un receptor co-inhibidor sobre las células T con una estructura similar a la de CTLA-4, pero con una función y ligando biológico distinta especificidad [18]. El bloqueo de la interacción entre PD-1 y su ligando, PD-L1, potencia la respuesta inmune de células T in vitro y media la actividad antitumoral [19-21]. Los hallazgos preclínicos han conducido a ensayos clínicos recientemente comunicados que muestran que anti-PD-1 y anti-PD-L1 mAbs producen una actividad antitumoral impresionante en el cáncer no microcítico de pulmón, melanoma y cáncer de células renales con regresión completa logrado en algunos pacientes [22-24].
A pesar de la eficacia antitumoral prometedora de varios mAbs, muchos tumores son refractarios al tratamiento con solo anti-CD137, anti-PD-1 o anti-CTLA4 mAbs [25,26] y combinaciones de dos o más mAb puede ser necesaria. Recientemente hemos demostrado en todos los 4 modelos tumorales de ratón, incluyendo el clon ID8 del cáncer de ovario murino MOSEC, que repite la entrega al sitio del tumor de una combinación de mAbs a CD137 /PD-1 /CTLA4 causados regresiones tumorales a largo plazo e incluso curas y que una combinación mAb que también comprendía un mAb a CD19 fue aún más efectiva [27]. Si bien estos datos son importantes por lo que demuestra que el cambio de una respuesta inflamatoria tipo Th2, que es frecuente en los tumores [28-30], a una respuesta de tipo Th1 puede ser curativa, la entrega repetida de 3-4 mAb a los sitios tumorales no es práctico para la "traducción" clínica.
El problema asociado con la necesidad de la administración local se puede superar para el cáncer de ovario ya que crecen y se metastatizan principalmente en la cavidad peritoneal y son así accesibles. Además, el número de mAbs necesarios puede reducirse a dos, ya que ya han encontrado que una combinación de anti-CD137 y anti-PD-1 mAbs puede doblar la supervivencia de ratones con tumores ya establecidos ID8 aunque no es curativa [28]. Sobre la base de estos hallazgos que ahora han comparado los
in vivo
eficacia terapéutica, medida como la supervivencia global prolongada, de anticuerpos anti-CD137 /PD-1 combinación con la de los mAb indicados como agentes únicos, así como con otros anticuerpos monoclonales y combinaciones de los mAb. Además, investigó los mecanismos inmunológicos sistémicos y locales contratados por anti-CD137 /PD-1 mAb simples o combinadas. Es importante destacar, puso de manifiesto posteriormente que una combinación de anti-CD137 /PD-1 mAbs con el cisplatino medicamento contra el cáncer prolonga significativamente la vida y es probablemente curativa a 80% de los ratones con carcinoma de ID8 establecido por un mecanismo que implica CD8 funcional
+ células T y tiene la especificidad de antígeno de tumores, así como la memoria inmunológica. Un régimen similar también resultó en la supervivencia a largo plazo de 33,3% de los ratones con carcinoma de pulmón TC1 establecida. Un enfoque similar debería ser "traducible" a la clínica.
Materiales y Métodos
Ratones y líneas celulares
Para los experimentos llevados a cabo en China, de 6 a 8 -Semana C57BL fueron adquiridos desde el Centro Experimental Animal de la Segunda Médico Militar protocolos universitarios y animales fueron aprobadas por la Junta de Revisión Institucional de la Segunda Universidad médica Militar. Los experimentos con animales realizados en ratones utilizados Seattle comprados de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y los protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington.
ID8 es un clon del carcinoma de ovario MOSEC de C57BL /6 origen [31] y TC1 es un clon derivado de células epiteliales de pulmón primarias de ratones C57BL /6 ratones co-transformada con el VPH-16 E6 y E7 [27]. Las células de linfoma de células T EL4 murinos son de C57BL 6 origen /[32]. células tumorales ID8 y TC1 se cultivaron en el medio DMEM completo suplementado con 10% FBS (Thermo Scientific, Rockford, IL), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina antes de suspensiones celulares se prepararon y se trasplantan a ratones. Las células EL4 y esplenocitos se mantuvieron en un medio completo de RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, HEPES 25 mM, glutamina 2 mM, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina.
Los siguientes anticuerpos monoclonales (mAb) utilizados en los experimentos con animales se adquirieron de BioXcell (West Lebanon, Nueva Hampshire): anti-CD137 (clon lob12.3), anti-PD-1 (Clon RMP1-14), anti- CTLA4 (Clon 9D9), anti-NK1.1 (Clone PK136), anti-CD8 (clon 2.43), anti-CD4 (clon GK1.5) y control (Clone 2A3). El anticuerpo anti-CD137 del clon 2A se preparó en nuestro laboratorio como se describe anteriormente [33].
Los estudios en animales
Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.) con 3 × 10
6 células ID8 en 0,1 ml de PBS. En los días 10 y 14 después de la inoculación del tumor, los ratones fueron inyectados i.p. con 0,5 mg de cada mAb total de 0,5 ml de PBS como se muestra en la figura de leyendas. En experimentos con mAb /cisplatino combinado terapia, grupo de ratones (10 ratones por grupo) de cojinete 10 días tumor ID8 establecido recibido dos dosis de control, anti-PD-1, anti-CD137 o anti-PD-1 /CD137 mAb (0,5 mg por dosis por ratón) a los 4 días de intervalo, con o sin cisplatino (10 mg /kg) la coadministración a su primer tratamiento. Los ratones se pesaron cada dos días y se comprueban todos los días para los vientres hinchados como indicativos de la información ascitis y para cualquier evidencia de toxicidad, tales como cambio del comportamiento, incapacidad para moverse, comer o beber. Siguiendo las directrices institucionales, los ratones fueron asesinados cuando desarrollaron ascitis y tuvo un aumento de peso & gt; 30%. La supervivencia de cada ratón se registró y se calculó la supervivencia global. Para los experimentos de terapia combinados en el modelo de tumor TC1, los ratones (6 por grupo) se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) con 5 × 10
5 células TC1 en 0,1 ml de PBS. En los días 5 y 9 después del trasplante del tumor, los ratones fueron inyectados por vía intratumoral (i.t.) con anticuerpos monoclonales y /o cisplatino utilizando la dosis /horario descrito arriba. Tres diámetros perpendiculares de s.c. tumores se midieron cada segundo día usando un calibre y se calcularon los volúmenes tumorales de acuerdo con la fórmula: 1/2 x (longitud) x (anchura)
2. Los ratones fueron sacrificados cuando parecían moribundos o su s.c. tumores alcanzaron 10 mm de diámetro.
Para evaluar el desarrollo de la memoria inmunológica, 15 de largo plazo los ratones que recibieron cisplatino /terapia anti-PD1 /CD137 combinado (agrupados de 2 experimentos independientes) o 5 ratones no tratados de edad similar (que sirvió como control) que sobrevive fueron desafiados ip o por vía subcutánea con 3 × 10
6 células ID8 o 1 × 10
6 singénicos pero antigénicamente diferentes células TC1. El crecimiento del tumor en ratones se evaluó como se describió anteriormente.
Para experimentos de reducción, un anti-CD4 (0,2 mg /ratón), anti-CD8 (0,2 mg /ratón), anti-NK1.1 (0,1 mg /ratón) o mAb de control (0,2 mg /ratón) se inyectó ip 48 y 72 horas antes del tratamiento y cada 3-4 días a partir de entonces durante la duración de los experimentos. El agotamiento de los subconjuntos de células apropiadas se confirmó por análisis de citometría de flujo (datos no mostrados).
Evaluación de subconjuntos de células inmunes en los bazos y los lavados peritoneales por citometría de flujo
Los ratones que habían sido trasplantados por vía intraperitoneal con células ID8 se sacrificaron los 7 y 14 días después de que habían sido inyectados con el anticuerpo anti-PD1, anti-CD137, anti-PD1 /CD137 o control como en los experimentos de terapia. suspensiones de células individuales a partir de los bazos se prepararon como se describe anteriormente [27]. Para obtener células inmunes peritoneales, se inyectaron 3 ml de PBS en la cavidad peritoneal de ratones con tumores ID8 inmediatamente después de la eutanasia, su vientre se masajea y se retiró el fluido, filtrados a través de un filtro de células de 70 m (BD Biosciences, San Jose, CA) , células lavadas e inmunes se aislaron mediante el uso de un tampón de aislamiento de linfocitos de ratón (Cedarlane, Burlington, Ontario) siguiendo las instrucciones del fabricante.
suspensiones de una sola célula se lavaron con tampón de tinción FACS y se incubaron con un inhibidor de unión al receptor de Fc de ratón durante 10 minutos antes de la tinción con anticuerpos de CD45 (clon 30-F11), CD3 (clon 145-2C11), CD4 (clon GK1.5), CD8 (clon 53 a 6,7), CD19 (clon eBio1D3), CD11b (clon M1 /70), GR-1 (clon RB6-8C5), TIM-3 (clon 8B.2C12) y PD-1 (J43 clon; todos de eBioscience, San Diego, CA) durante 30 minutos. Para la tinción intracelular de FoxP3 (clon fjk-16; eBioscience), IFN-γ (XMG1.2 clon; eBioscience), e IL-10 (clon JES5-16E3; eBioscience), se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron después de la instrucción del kit Cytofix /Cytoperm (BD Bioscience). Citometría de flujo se realizó usando FACSCalibur (BD Biosciences) y la población de linfocitos fue seleccionada por gating células CD45-positivas. Los datos fueron analizados utilizando el software Flow Jo (Árbol Star, Ashland, Oregón). Todo citometría de flujo experimentos se realizaron al menos 3 veces.
Evaluación de la respuesta inmune específica de antígeno
esplenocitos aislados de los ratones tratados se cultivaron en presencia de 10μg /mesotelina restringido-H-2Db ml péptidos derivados (mesotelina aminoácidos 406-414) o controlar péptido derivado de HPV-E7 (HPV-E7 49-57; todos de Shanghai Ciencia péptido Biológica Technology Co.Ltd, Shanghai.) durante 3 días. Posteriormente, IFN-γ en los sobrenadantes se detectó por el ratón IFN-γ Quantikine ELISA Kit (amp I +; D systems, Minneapolis, MN). Los resultados se analizaron después de la normalización según los números de células T.
Para los ensayos de CTL, las células efectoras se obtuvieron mediante cultivo conjunto 5 × 10
6 esplenocitos con 5 × 10
5 células ID8 irradiados con UV durante 4 días. células diana EL4 pulsadas con péptido se generaron mediante la adición de 10 mg /ml de péptido y se incubaron durante 4 horas. la actividad de CTL se midió usando el kit no radiactivo CytoTox96 Ensayo de citotoxicidad (Promega, Madison, WI) siguiendo las instrucciones del fabricante. En breve, las células diana se incubaron con diferentes cantidades de células efectoras durante aproximadamente 4 horas, y los sobrenadantes se analizaron después de la liberación de lactato deshidrogenasa. Los resultados se expresan como porcentaje de lisis específica, calculada como (liberación liberación espontánea Experimental /liberación total liberación espontánea) x 100. En algunos experimentos, las células efectoras se incubaron con anti-CD4 o anticuerpo CD8 (10μg /ml) durante 2 horas antes del ensayo CTL.
ELISA
Los ratones inyectados por vía intraperitoneal con 3 × 10
se inyectaron 6 células ID8 10 días antes dos veces en 4 días de intervalo con 0,5 mg de cada mAb en 0,5 ml de PBS. Dos semanas después de la última inyección de mAb, las células inmunes peritoneales (1 × 10
6 /pocillo) cosechadas de los ratones tratados fueron estimuladas in vitro con 50 ng /ml de PMA y 1 mg /ml de ionomicina durante 6 horas antes del análisis de IL-2 y la producción de IFN-γ en los sobrenadantes por ELISA de acuerdo con el manual (R & amp; D Systems). Los resultados fueron analizados después de la normalización de acuerdo con el número de células T en células inmunes peritoneales totales.
Estadísticas
Los resultados se expresaron como media ± error estándar de la media (M ± SEM). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando se utilizó la prueba t de GraphPad Prism 5. Student para comparar la diferencia estadística entre los dos grupos y unidireccional ANOVA se utilizó para comparar tres o más grupos. Las tasas de supervivencia fueron analizados utilizando el método de Kaplan-Meier y evaluados con la prueba de log-rank. Las diferencias fueron aceptados como significativos valores de p. & Lt; 0,05
Resultados
efecto antitumoral sinérgico de anti-CD137 /PD-1 mAb
Se evaluó la eficacia antitumoral de diferentes combinaciones de ip mAbs agonistas o antagonistas contra moléculas co-estimuladoras o co-inhibitoria en ratones C57BL trasplantado 10 días antes con 3 × 10
6 células ID8. Sobre la base de la evidencia publicada que indica un potencial terapéutico en varios modelos tumorales analizadas mAb CD137, CD40, CTLA-4, PD-1, TIM-3 y LAG-3 [34,35], como agentes individuales y en combinaciones. ratones no tratados y los ratones que recibieron un control mAb desarrollado ascitis alrededor de 30 días después de la inoculación del tumor y tuvo que ser sacrificado. Como se muestra en la Figura 1, la mayoría de las combinaciones de mAbs ensayados tenían poco o ningún efecto sobre la supervivencia global de los ratones portadores de tumores, y ninguno de los mAbs era terapéuticamente eficaz cuando se utiliza solo. De acuerdo con nuestros resultados publicados recientemente [27], el tratamiento combinado de anti-CTLA4, PD-1 y CD137 mAb de supervivencia significativamente prolongada de los ratones con el tiempo medio de supervivencia cada vez mayores a 80 días (Figura 1A, B, P & lt; 0,05 en comparación con los controles) . El tratamiento combinado de anti-CTLA4, PD-1, TIM-3 y CD40 mAb también suprimió el crecimiento tumoral, pero fue menos eficaz con el tiempo de supervivencia media de 49 días. Otras combinaciones de mAb, incluyendo anti-CTLA-4 /PD-1, anti-CTLA-4 /PD-1 /CD40, anti-CTLA-4 /PD-1 /TIM-3, anti-CTLA-4 //LAG-3 y anti-CTLA4 PD-1 /PD-1 /LAG-3 /CD40 no tuvo efecto sobre el crecimiento del tumor.
Los ratones (5 /grupo) por vía intraperitoneal trasplantado con 3 × 10
6 células por vía intraperitoneal ID8 10 días antes fueron inyectados dos veces en 4 días de intervalo con las combinaciones indicadas de mAb (0,5 mg de cada mAb /ratón); Se midió la supervivencia (A, C) y el tiempo medio de supervivencia se calculó (B, D). El experimento se repitió una vez con resultados similares. E, ratones (8-9 /grupo) por vía intraperitoneal trasplantado con 3 × 10
6 células por vía intraperitoneal ID8 3 días antes se inyectaron dos veces a los 4 días de intervalo con 0,5 mg de control, anti-PD-1, anti-CD137 y anti-PD-1 /CD137 mAb y su supervivencia se registró. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, en comparación con los ratones tratados de control del AM.
A continuación repetimos los experimentos anteriores mediante el uso de dos clones diferentes de MAB contra CD137 (2A y lob12.3). Como se muestra en la figura 1C y D, aunque el tratamiento único mAb no prolongó la supervivencia general, la combinación de anti-PD-1 mAb, ya sea con anti-CD137 mAb supervivencia igualmente prolongado de ratones con el tiempo medio de supervivencia del doble (p & lt; 0,05 comparado con el control y grupos de mAb individuales), que se mejoró aún más por adición de anticuerpos anti CTLA4-mAb (p & lt; 0,01 en comparación con grupos de mAb solo control y). Una repetición del experimento dio resultados similares (datos no mostrados).
En particular, no se detectó ninguna expresión de CD137 y PD-1 moléculas y sus respectivos ligandos CD137L y PD-L1 /PD-L2 en la superficie de las células del cáncer de ovario ID8 (datos no mostrados), con exclusión de la posibilidad de que la inhibición de crecimiento del tumor ID8
in vivo
está mediada directamente por el anti-CD137 más anti-PD-1 mAb.
Curiosamente, ya sea anti-CD137 o anti-PD-1 mAb solos protegido contra la derivación de células ID8 en 3 días establecidos modelo ID8 con las respectivas del 66,7% y el 37,5% de los ratones que sobrevivieron 90 días en que se dio por terminado el experimento y los ratones sacrificados (Figura 1E). La cavidad peritoneal de estos ratones estaba libre de tumores. Es de destacar que el anti-CD137 mAb fue más eficaz que los anti-PD1 mAb y que una combinación de los dos fue modestamente más eficaz (77,8% ratones supervivientes) de anti-CD137 mAb solo.
Aumento del porcentaje de células T efectoras y la disminución de porcentaje de células inmunosupresoras inducida por anti-CD137 /PD-1 mAb
Para explorar si se combina /CD137 mAb 1 anti-PD-indujo una inmune sistémica respuesta, inyectamos ratones trasplantados 10 días antes con células ID8 (como en los experimentos de terapia), ya sea con una combinación de anti-PD-1 /CD137 mAbs o ya sea solo mAb. Siete días más tarde, se analizaron por citometría de flujo el porcentaje, número absoluto y la función efectora de subpoblaciones de linfocitos en los bazos de los ratones tratados. Como se muestra en la Figura 2A, los bazos de los ratones tratados con combinación anti-PD1 /CD137 mAbs muestran un aumento significativo de frecuencia y el número absoluto de células CD3
+ (p & lt; 0,01) y CD8
+ T (p & lt; 0,001) de las células y la disminución de los niveles de CD4
+ FoxP3
+ reguladora células T (Treg) (p & lt; 0,001) y el GR-1
+ CD11b
+ células supresoras mieloides derivados (MDSCs) (p & lt; 0,05 ); parcelas representativos se muestran en la (Figura 2B). Combinada anti-PD1 /CD137 mAb también eleva los niveles de CD44
+ CD62L
- efectoras /de memoria (p & lt; 0,01), CD44
+ CD62L
+ de memoria central (p & lt; 0,05), IFN -γ productoras de efector CD8
+ células T (p & lt; 0,01) y la disminución de
+ células T CD8 productoras de IL-10 (p & lt; 0,001) en los bazos (Figura 3A); parcelas representativos se muestran en la Figura 3B. Los datos indican que el anti-PD-1 terapia /CD137 mAbs genera una respuesta inmune sistémica dominado por el aumento significativamente CD8
+ células T efectoras y la disminución de las células inmunosupresoras.
Ratones (3 /grupo) por vía intraperitoneal trasplantado con 3 × 10
fueron inyectados por vía intraperitoneal 6 células ID8 10 días antes con 0,5 mg de control, anti-CD137, anti-PD-1 o anti-PD-1 /CD137 mAb y mAb de la inyección se repitió 4 días después. Siete días después de la segunda inyección, los bazos se recogieron y se prepararon suspensiones de células individuales y se tiñeron con anticuerpos de fluorescencia marcado contra marcadores de subgrupos de linfocitos antes del análisis por citometría de flujo. Los porcentajes y cantidad de células CD3
+, CD4
+, CD8
+, CD19
+, FoxP3
+ /CD4 y GR-1
+ CD11b
+ células en el bazo se muestran en (a) y gráficas de puntos representativos se muestran en (B). Los datos se presentan como M ± SEM de 3 ratones /grupo y son representativos de 3 experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0.001, los hallazgos con anti-PD-1 o CD137 mAbs individuales se comparan con mAb de control, y los resultados con los mAb anti-PD-1 /CD137 se comparan con el control y mAb sola.
Ratones (3 /grupo) que había sido trasplantado por vía intraperitoneal con 3 × 10
fueron inyectados por vía intraperitoneal 6 células ID8 10 días antes dos veces en 4 días de intervalo con 0,5 mg de control, anti-CD137, anti-PD-1 o anti-PD-1 /CD137 mAb. Los bazos de los ratones tratados se analizaron para fenotipos y funciones efectoras de CD8
+ linfocitos T por citometría de flujo 7 días después de la segunda inyección de mAb. Los porcentajes y números de CD44
+ CD62L
- efectoras /memoria y CD44
+ CD62L
+ de memoria central y el IFN-γ- e IL-10 de producción de células CD8 en el
+ población de células T se muestran en (a) y gráficas de puntos representativos se muestran en (B). Los datos se presentan como M ± SEM de 3 ratones en cada grupo y son representativos de 3 experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, PD-1 o CD137 mAb en comparación con el mAb de control, PD-1 /CD137 mAb en comparación con el control y mAb sola.
respuesta de CTL antígeno-específica inducida por anti-CD137 /PD-1 mAb
Nuestro estudio anterior demostró que combinados mAb /PD-1 /CD137 anti-CTLA4 inducen un antígeno potente respuesta inmune tipo Th1 específicos de en los bazos de los ratones portadores de ID8 [27], cuyo esplenocitos producido altos niveles de IFN-γ a la estimulación por el péptido derivado de ID8 mesotelina-célula que expresa, un antígeno de tumor de ovario bien caracterizada [9]. Del mismo modo, se detectó la producción de IFN-γ por esplenocitos de ratones tratados con anti-PD-1 combinado /CD137 mAbs en respuesta a la estimulación por la mesotelina pero no un péptido derivado de HPV-E7 utilizado como control (datos no mostrados). Hemos determinado, además, si los esplenocitos tenían actividad citolítica. Los esplenocitos de los ratones tratados con anti-PD-1 /CD137 mAbs se volvieron a estimular con células ID8 irradiados con UV durante 4 días antes de los ensayos de CTL se realizaron utilizando células EL4 pulsadas con HPV-E7 o péptido mesotelina derivado como células diana. Como se muestra en la Figura 4A, los esplenocitos de anti-PD-1 /CD137 ratones tratados muestran actividad citotóxica sobre células EL4 pulsadas con mesotelina pero no con el péptido HPV-E7. Pre-incubación con anticuerpo CD8 suprimió la actividad de eliminación (Figura 4B). Concluimos que combinan mAbs anti-PD-1 /CD137 provocó una respuesta CTL específica de antígeno tumoral mediada por las células CD8.
Ratones (/grupo 3) trasplantado i.p. con 3 × 10 por vía intraperitoneal
se inyectaron células ID8 6 10 día antes dos veces en el intervalo de 4 días con 0,5 mg de anti-PD-1 /CD137 mAb. Siete días después de la segunda inyección de mAb, agrupado esplenocitos (5 × 10
6) a partir de 3 ratones se incubaron con 5 × 10
5 células ID8 irradiados con UV durante 4 días. Los esplenocitos resultantes se evaluaron a continuación para la actividad de CTL específica de antígeno por CytoTox 96 ensayo de citotoxicidad no radiactivos utilizando células EL4 pulsadas con mesotelina restringido-H-2Db o péptido HPV-E7 como células diana (A). También se evaluó la actividad de eliminación en presencia de anti-CD4, anti-CD8 o anticuerpo de control (B). Los datos se expresan como M ± SEM de los pocillos por triplicado.
Local tipo Th1 respuesta inmune promovido por anti-CD137 /PD-1 mAb
Para analizar el cambio en las células inmunitarias locales, ratones portadores del tumor de 10 días establecido ID8 fueron tratados ya sea individual o combinada /CD137 mAb y sus lavados peritoneales 1 anti-PD-se recogieron 7 días después de la última inyección de mAb. Que confirma nuestros resultados anteriores [27], el tratamiento de anti-PD-1 /CD137 mAb inducida aumentado significativamente la infiltración de células CD3
+ (p & lt; 0,01) y CD8
+ (p & lt; 0,01) células, así como la disminución de la infiltración de CD19
+ (p & lt; 0,001) de las células en comparación con el control o tratamiento de mAb solo (Figura 5A). Un análisis más detallado de la expresión de CD44 y CD62L mostró que la mayoría de las células CD4
células de + T anti-PD-1 /CD137 mAbs
+ y CD8 ratones tratados eran CD44
+ CD62L
- efector /T de memoria células y sus porcentajes fueron mucho más altos (p & lt; 0,01) que la de los ratones de control o mAb individuales tratadas (Figura 5B); dotplots representativos se muestran en la Figura S1. También confirmó la disminución de los niveles de células T reguladoras y MDSCs como se informó anteriormente (datos no mostrados; ref 27).
Ratones (3 /grupo) por vía intraperitoneal trasplantado con 3 × 10 por vía intraperitoneal
se inyectaron células ID8 6 10 día antes dos veces en 4 días de intervalo con 0,5 mg de control, anti-CD137, anti-PD-1 o anti-PD-1 /CD137 mAb. Dos semanas más tarde, el lavado peritoneal de ratones tratados se analizó por citometría de flujo para el porcentaje y el fenotipo de los linfocitos peritoneales. Los porcentajes de células CD3
+, CD4
+, CD8
+ y CD19
+ linfocitos en el lavado peritoneal y CD44
+ CD62L
- efectoras /células de memoria en las células CD4
células CD8 + y
+ T se muestran en (a) y (B), respectivamente. El porcentaje de PD-1
+ TIM-3
-Tim-3
+ células
+ y PD-1 en peritoneal CD4
+ y CD8 + se muestran las células T
en (C) con gráficas de puntos representativos en la figura S2. Los datos se presentan como M ± SEM de 3 ratones de cada grupo y son representativos de 2 experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, PD-1 o CD137 mAb en comparación con el mAb de control, PD-1 /CD137 mAb en comparación con el control y mAb sola.
Individual CD137 mAb ratones tratados también mostraron aumento de la infiltración de células CD3
+ (p & lt; 0,05), CD8
+ (p & lt; 0,05) y CD44
+ CD62L
- efectoras /de memoria CD8
+ T (p & lt; 0,05) en las células de la cavidad peritoneal a pesar de que era ineficaz en la prolongación de la supervivencia global (Figura 1D). Para explorar los mecanismos que subyacen a la falta de protección tumoral inducida por anti-CD137 mAb solos, hemos examinado la expresión de moléculas co-inhibidor PD-1 y el regulador inmunológico T mucina inmunoglobulina celular (TIM-3) en las células T, los cuales han sido reportados estar estrechamente asociado con el agotamiento funcional de las células T [36,37]. Como se muestra en la Figura 5C, anti CD137-mAb hasta reguladas la expresión de PD-1 y TIM-3 en peritoneal CD4
+ y CD8
+ células T y único anti-PD-1 mAb tenía pequeños efectos en TIM-3 de expresión a pesar de que atenuó la expresión de PD-1 en células CD8
+ células T en comparación con el mAb de control. Cabe destacar que, concomitante PD-1 bloqueo impidió significativamente la sobre regulación de PD-1 y TIM-3 en las células T inducida por la activación de CD137; gráficas de puntos representativos se muestran en la (Figura S2). De acuerdo con la regulación al alza de PD-1 y TIM-3, las células T peritoneales aislados de contra CD137-mAb tratados ratones produce niveles más bajos de IL-2 e IFN-γ (Figura S3).
De larga duración efecto antitumoral inducida por anti-CD137 combinados /PD-1 mAb y cisplatino
Los estudios anteriores han informado de que los anticuerpos anti-CD137 mAb sinergia con cisplatino, un fármaco quimioterapéutico usado comúnmente para el ovario cáncer, para inducir la regresión de la murino CT-26 de cáncer de colon en 60% de los ratones [38]. Para explorar la eficacia de /CD137 mAbs 1 anti-PD-más cisplatino en el modelo de cáncer de ovario ID8, que primero trataron ratones portadores de tumores con i.p. inyección de una dosis de cisplatino seguido por 2 dosis de anti-PD-1 /CD137 mAbs en 4 días de intervalo. Como se muestra en la Figura 6A, combinada anti-PD-1 /CD137 /tratamiento con cisplatino produjo un efecto antitumoral significativo en comparación con solo mAb, ambos mAbs o cisplatino solo, lo que resulta en la supervivencia a largo plazo de 80% (8 ratones de 10 ) ratones; no había beneficio en la supervivencia de cisplatino solo o en combinación con cualquiera de anti-PD-1 o anti-CD137 mAb. Se obtuvieron resultados similares a partir de un experimento repetido. La eliminación de CD8
+ células T abrogó completamente el efecto antitumoral (Figura 6B), lo que demuestra un papel fundamental de estas células en la protección del tumor. Los supervivientes a largo plazo desarrollaron una respuesta inmune sistémica con la memoria y tumor-especificidad como se demuestra por su resistencia a desafiar con células ID8 pero no a desafiar con células TC1 antigénicamente no relacionadas (Figura 6C). Control, los ratones ingenuos sucumbió a desafiar, ya sea con o ID8 células TC1 que tuvieron tasas de crecimiento similares (Figura 6D).
Los ratones (10 /grupo) por vía intraperitoneal trasplantado con 3 x 10
6 células ID8 10 días fueron inyectados por vía intraperitoneal anteriormente con dos dosis de control, anti-PD-1, anti-CD137 o anti-PD-1 /CD137 mAb (0,5 mg por dosis por ratón) a los 4 días de intervalo, con o sin la administración conjunta de cisplatino (10 mg /kg) en la primera se evaluó el tratamiento y su supervivencia (A). Los ratones (10 /grupo) tratados con anti-PD-1 combinado /CD137 /cisplatino se agotaron de subgrupos de linfocitos mediante la inyección de anti-CD4 (0,2 mg /ratón), anti-CD8 (0,2 mg /ratón), anti-NK1. 1 (0,1 mg /ratón) o mAb de control (0,2 mg /ratón) 48 y 72 horas antes de la primera tratamiento y cada 3-4 días a partir de entonces durante la duración de los experimentos. ratones portadores de tumor no tratados eran como controles negativos (grupo UNT). Se registró la supervivencia de los ratones (B).