Extracto
Antecedentes
A pesar de los recientes avances en el análisis del ADN circulante permiten la predicción de los genomas tumorales por medios no invasivos, subsisten algunas dificultades, lo que limita la introducción generalizada de cfDNA en el diagnóstico del cáncer. Se analizó la situación de los dos mejores del cáncer colorrectal caracterizado (CRC) alteraciones genéticas y epigenéticas en una cohorte de pacientes con CRC, y luego comparamos el grado en que los dos patrones se mueven a partir de tejido de plasma con el fin de mejorar nuestra comprensión de la biología de la modulación de la concordancia entre los tejidos y la metilación de plasma y perfiles de mutación.
Métodos
El plasma y los tejidos tumorales se obtuvieron de 85 pacientes (69 ± 14 años, 56 varones).
KRAS
y
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estado se evaluó alelo sistema de mutación refractaria PCR cuantitativa y PCR específica de metilación cuantitativa, respectivamente. Seis de las mutaciones puntuales más comunes en el codón 12 y 13 fueron investigados por
KRAS
análisis.
Resultados
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mutaciones y
SEPT9
la metilación del promotor estaban presentes en el 34% (29/85) y en el 82% (70/85) de las muestras de tejido tumoral primario. Ambos análisis genéticos y epigenéticos de cfDNA revelaron una alta concordancia y la especificidad en comparación con los análisis del tumor de los tejidos. Los pacientes que presentan alteraciones genéticas y epigenéticas tanto en muestras de tejido (31,8%, 27/85) se consideraron para análisis adicionales. Las tarifas de la mediana de metilación en los tejidos tumorales y muestras de plasma fueron 64,5% (12,2 a 99,8%) y 14,5% (0 a 45,5%), respectivamente. La mediana
KRAS
carga de mutación (mutaciones emparejados) fue del 33,6% (1,8-86,3%) en los tejidos y el 2,9% (0-17,3) en muestras de plasma. El plasma /tejido (P /T) relación de
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tasa de metilación fue significativamente más alta que la relación P /T de
KRAS mutación
de carga, especialmente en etapas tempranas del cáncer (p = 0,0108) .
Conclusión
Los resultados de este estudio muestran una tasa discrepante de epigenéticos frente a las alteraciones genéticas que se mueven a partir de tejido de plasma. Muchos factores podrían afectar el análisis de mutación cfDNA, incluyendo tanto la presencia de heterogeneidad clonal del tumor y la estricta compartimentación de
KRAS
perfil mutación. El presente estudio pone de relieve la importancia de considerar la naturaleza de la alteración en el análisis de cfDNA derivado del tumor
Visto:. Danese E, Minicozzi AM, Benati M, M Montagnana, Paviati E, Salvagno GL, et al. (2015) Comparación de las alteraciones genéticas y epigenéticas de los tumores primarios y las muestras de plasma compatibles en los pacientes con cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (5): e0126417. doi: 10.1371 /journal.pone.0126417
Editor Académico: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG
Recibido: 11 Febrero, 2015; Aceptado: April 1, 2015; Publicado: 6 Mayo 2015
Derechos de Autor © 2015 Danese et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La evidencia de que las alteraciones genéticas y epigenéticas tumorales específicos se pueden detectar en el ADN extraído de plasma de pacientes con cáncer de circulación se ha mostrado prometedora para mejorar el diagnóstico precoz, el pronóstico y seguimiento de la enfermedad. El objetivo general de la utilización de ADN libre de células como marcador biológico implica la optimización médica práctica, el desarrollo de la medicina personalizada, y la calidad de vida mejora debido a la mínima invasividad de las pruebas de sangre. Sin embargo, la autenticación de validez clínica real de diversas alteraciones de ADN libre de células (cfDNA) como biomarcadores de cáncer putativo en la práctica clínica sigue siendo un reto [1]. La cuestión principal está representada por el hecho de que los fragmentos de ADN que portan alteraciones específicas tumorales circulantes representan una fracción variable y generalmente pequeñas del ADN total circulante, generando así una alta variabilidad en la tasa de concordancia entre los patrones de alteración detectable en el tejido de los tumores primarios y las correspondientes plasma.
los factores que influyen en la cuantitativa, así como los cambios cualitativos de cfDNA con respecto a los tejidos de los pacientes con cáncer son muchas y aún no está totalmente explorado hasta ahora. Sin embargo, los esfuerzos realizados durante la última década han dado lugar a avances importantes.
Al evaluar el patrón de metilación del
PCDH10
génica en tejidos y plasma de pacientes con cáncer colorrectal (CCR) Recientemente hemos demostrado que la tasa de metilación detectado en el plasma aumenta con una mayor tasa de metilación en los tejidos tumorales solamente en los cánceres en etapa temprana, mientras que esta correlación fue aparentemente perdió en los cánceres avanzados. Por otra parte, hemos demostrado que el grado de metilación cfDNA se asoció con algunas características de cfDNA, tales como su concentración y la integridad, y que estas correlaciones variaron en fuerza y la dirección en paralelo con la etapa de tumor [2].
en los últimos dos años dos grupos de investigación independientes mostraron que la posibilidad de detectar cfDNA específica de tumor en el plasma de pacientes con CRC depende en gran medida de la sensibilidad del método basado en la PCR para las secuencias mutadas cortos [3-5], subrayando así la importancia de minimizar la longitud de ensayo en el análisis de muy fragmentado cfDNA, tal como en la fijación de los pacientes de cáncer.
heterogeneidad intratumoral y evolución clonal durante la progresión son más problemas que complican el uso de cfDNA como biopsia líquida para el cáncer, ya que ambos factores generan notable diferencias en la proporción y el patrón de aberraciones detectables en el tumor primario y ADN circulante [6,7].
de acuerdo con esta evidencia, los diferentes aspectos técnicos y biológicos deben ser considerados al analizar la variable de concordancia entre el tejido y plasma alteraciones en pacientes con cáncer, no menos importante la naturaleza de las alteraciones subyacentes.
aberraciones
son bien conocidos alteraciones Tanto epigenéticos y genéticos implicados en la carcinogénesis colorrectal. Dada su enorme potencial como biomarcadores en CRC diagnóstico, estadificación, pronóstico y respuesta al tratamiento, han sido ampliamente investigados en la última década. Sin embargo, una comparación crítica de su situación en el tejido y cfDNA es insuficiente. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo analizar el estado de las dos alteraciones genéticas y epigenéticas mejor caracterizados de CRC (es decir,
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mutación y
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metilación del promotor) en una cohorte de pacientes con CRC, con el fin de mejorar nuestra comprensión de los aspectos biológicos que modulan la concordancia entre los tejidos y la metilación de plasma y perfiles de mutación. Entonces, también comparamos el grado en que la genética y los patrones epigenéticos se mueven a partir de tejido de plasma.
Material y Métodos
Pacientes y muestras
El grupo de estudio incluyó 85 pacientes consecutivos sometidos a cirugía para la CRC en el hospital de la Universidad de Verona (Italia) entre enero de 2010 y diciembre de 2010. las muestras de sangre se recogieron antes de la resección quirúrgica. Se obtuvieron muestras de tumor durante la cirugía, inmediatamente congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. El diagnóstico histológico y el estadio tumoral se evaluó de acuerdo con el sistema de clasificación de 2000 Organización Mundial de la Salud (OMS) para los tumores del sistema digestivo y el Comité Conjunto sobre el Cáncer del sistema (AJCC) puesta en escena, respectivamente [8]. Sólo los pacientes con adenocarcinomas colorrectales primarios no tratados con neoadyuvante radio-quimioterapia se incluyeron en el estudio. Todos los sujetos dieron su consentimiento por escrito para inscribirlas en esta investigación. El estudio fue aprobado por el comité de ética local (Departamento de Ciencias de la Vida y reproducción, Universidad de Verona) y lleva a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki de 1975. La información clínica se obtuvo de los registros médicos.
aislamiento de ADN a partir de plasma y muestras de tejidos
Las muestras de sangre se recogieron en tubos de 7 ml de EDTA y procesadas dentro de 1 hora después de la recolección. Después de doble centrifugación (800 g durante 10 min de centrifugación, seguido de separación y una segunda 1600g durante 10 min centrifugación), se separó plasma, se almacenó en alícuotas y se congelaron a -80 ° C hasta su procesamiento. Se extrajo el ADN del plasma y las secciones de tejido fresco congelado utilizando el kit QIAamp DNA Blood midi y el Kit de Gentra Purgene (Qiagen, Hilden, Alemania), respectivamente.
cfDNA concentración e integridad índice
cfDNA fragmentación se evaluó mediante el cálculo del índice de la integridad del ADN como [2] se describe anteriormente. En breve, se determinó mediante el cálculo de la relación de mayor tamaño (247 pb) versus (115 pb) objetivos de la secuencia consenso de ALU humano repite más cortos. El resultado ALU-qPCR obtenido con los cebadores ALU115 también se utilizó para cuantificar el ADN total.
PCR específica de metilación (MSP)
DNA genómico purificado extraído de tejidos y el plasma se sometió a tratamiento con bisulfito y ADN purificación utilizando el kit Epitect bisulfito (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un protocolo detallado se ha informado anteriormente en otra parte [2].
bisulfito modificada-ADN se utilizó como molde para la PCR en tiempo real utilizando un MSP cuantitativa basada en SYBR Green. Los cebadores para MSP fueron diseñados para amplificar específicamente un, filamento no metilado bisulfito sensible o una, filamento metilado bisulfito resistente en el
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región promotora del gen. El MethPrimer software basado en web (http://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) se utilizó para seleccionar una isla CpG específico, que fue encontrado recientemente como los más vulnerables a los cambios de metilación en la secuencia adenoma-carcinoma [9] .
las secuencias de los conjuntos de cebadores fueron los siguientes:
M-Fo: TTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAAC
M-Rev: AAAATCCTCTCCAACACGTCCG
U Fo: TAGTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATG
U Re: CAAAATCCTCTCCAACACATCCAC (M: metilado, T: no metilado).
se utilizó el ADN metilado CpGenome universal (Chemicon, Millipore Billerica, MA, EE.UU.) como 100% metilado (positivo control), mientras que el ADN extraído a partir de células mononucleares de sangre periférica de individuos normales se utilizó como control no metilado (negativo)
La mezcla de reacción de PCR se preparó en un volumen final de 20 l, que consiste en las siguientes concentraciones:. 0.375 M de cebadores directos e inversos, 250 mM de cada dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), 1 × HotStart Buffer (Qiagen), MgCl2 2,5 mM, 1,5 unidades HotStart polimerasa (Qiagen), 2 M SYTO 9 (Invitrogen, vida Technologies, Carlsbad, CA), y 1 × ROX tinte de referencia (Invitrogen), 3 l de ADN modificado con bisulfito.
La amplificación por PCR se realizó con preciclar activación por calor de la ADN polimerasa a 95 ° C durante 10 minutos , seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 segundos, hibridación a 64 ° C para 30 segundos y extensión a 72 ° C durante 30 seg. Se utilizó un ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
El producto de PCR se llevó a cabo en gel de agarosa al 2% para confirmar el tamaño del producto y la especificidad de la PCR, y luego se visualizan en virtud de Luz ultravioleta. Una banda de 110 pb se consideró como de diagnóstico de estado de metilación, mientras que una banda de 114 pb fue considerado como diagnóstico de la condición de no metilación.
análisis de mutación KRAS
ADN extraído de muestras de tejidos y el plasma se sometidas a un sistema de mutación refractaria alelo qPCR (ARMS-qPCR) para la detección de seis de las mutaciones más comunes en los codones 12 y 13 de la
KRAS
gen (G12A, G12D, G12V, G12S, G12C, y G13A ). ADN se amplificó en una mezcla de reacción 25 l que contiene 0,25 M de cada cebador de amplificación, 200 mM de cada dNTP (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), 1 × HotStart Buffer (Qiagen, Hilden, Alemania), MgCl 2 mM
2, 2 unidades HotStart polimerasa (Qiagen, Hilden, Alemania), 2 mM SYTO 9 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA), 1 × colorante de referencia ROX (Invitrogen) y 25 ng de DNA. Las secuencias de los cebadores se han descrito previamente en otra parte [10], con la excepción del cebador inverso común que ha sido re-diseñado con el fin de acortar los amplicones tanto de codón 12 (90 pb) y el codón 13 (85 pb) (originalmente de 149 y 144 pb de longitud). La secuencia resultante fue la siguiente:. TGTTGGATCATATTCGTCCACA
La amplificación por PCR se realizó con preciclado activación por calor de la ADN polimerasa a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 sec, hibridación a 64 ° C durante 30 segundos y extensión a 72 ° C durante 30 segundos, en un sistema de detección ABI Prism 7500 Secuencia (Applied Biosystems y Foster City, CA, EE.UU.). El producto de PCR de las muestras mutadas se ejecuta en gel de agarosa al 2% para confirmar la presencia de las bandas específicas.
Análisis cuantitativo y el rendimiento analítico
ciclos umbral (Ct) se utilizaron para calcular la tasa de metilación y la carga de mutación en cada muestra, de acuerdo con la siguiente fórmula:% = 100 /[1 + 2 {Ct
Met /mut-Ct
insatisfecha /WT}] [2,11]. Ctmet y Ctunmet denotan umbral de los ciclos específicos para los estados metilados y no metilados, mientras Mut y WT se refieren a los alelos mutantes y de tipo salvaje, respectivamente. Las proporciones (%) de la tasa de metilación o la carga mutación detectada en el plasma en comparación con los detectados en los tejidos se expresaron como plasma /relación de tejido (/relación de p t).
Se calculó la media de al menos dos mediciones repetidas para cada muestra y, a continuación, se utiliza para el análisis estadístico. Se establecieron los criterios de calidad predefinidos, de manera que las mediciones con los valores Ct mayor que se excluyeron 38 ciclos.
Puesto que se ha observado que la sensibilidad de los ensayos cfDNA se puede aumentar acortando el tamaño de los amplicones [5,6] , cebadores para ambos análisis fueron diseñados para permitir la amplificación de productos más pequeños de 120 pares de bases. La imprecisión intra-ensayo para el ensayo de metilación fue del 9%. El límite inferior de detección de ADN metilado para los ensayos MSP (evaluada utilizando diluciones seriadas de ADN metilado universal) fue del 1,5%.
La imprecisión intra-ensayo para el
KRAS
análisis osciló entre 2% y 8%, dependiendo del tipo de mutación. aditivos línea celular de ADN que contienen la mutación de interés en un fondo normal de ADN se utilizaron para evaluar el límite de detección y se amplifican en el mismo instrumento se ejecuta para actuar como controles positivos. La sensibilidad analítica de ARMS-PCR cuantitativa fue inferior al 2%, como se informó anteriormente [12].
El análisis estadístico
La normalidad de distribución se comprobó con la prueba de Shapiro-Wilk y las variables continuas se informaron como mediana (rango) o media ± DE, cuando sea apropiado. Los análisis estadísticos y el trazado de los datos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc, San Diego, CA). El rendimiento diagnóstico de análisis cfDNA se comparó con el análisis del tejido tumoral (el actual estándar de oro) por su sensibilidad y especificidad para distinguir entre individuos metilados mutados /hypermethylated y no mutado /no. Los valores predictivos positivo y negativo de predicción también se calcularon con la prueba exacta de Fisher. La tasa de concordancia entre los perfiles de tejido y de plasma se determinó con la prueba de acuerdo (y los valores presenta como kappa ponderado (k) ± error estándar). Las diferencias entre las variables continuas se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Las correlaciones fueron probados con la correlación de Spearman. Los valores de p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativas
Resultados
Cincuenta y seis de los 85 pacientes evaluados inicialmente por su potencial inclusión en el estudio eran hombres, las mujeres restantes (edad promedio 69 ± 14 años. ). La distribución de la etapa del tumor fue el siguiente: 15 pacientes estaban en la etapa I (17,6%), 35 en la etapa II (41%), 24 en la etapa III (28,2%) y el 11 restante en la etapa IV (12,9%). Veinte nueve de cada 85 muestras de tejido tumoral (34%) fueron positivos para uno de los seis
KRAS
mutaciones que hemos probado. De éstos, 22 tejidos tumorales mostraron mutaciones en las muestras de plasma acertaron. En general, el análisis cfDNA mostró 89,4% (76/85) de concordancia para
KRAS
detección con el análisis del tejido tumoral (k = 0,753 ± 0,077, p & lt; 0,0001). Había nueve resultados discordantes entre las 85 muestras examinadas. Cinco resultados mostraron un genotipo WT para
KRAS mutaciones
-tested por análisis cfDNA, mientras que el análisis de los tejidos tumorales mostraron un
KRAS
mutación G13D (n = 2), un
KRAS
mutación G12D (n = 2) o un
KRAS
G12V mutación (n = 1). Dos pacientes (tanto en la etapa II) muestran un
KRAS
G12S y una mutación G12A por análisis de plasma, pero se determinaron como WT por pruebas de tejido tumoral. Por último, dos pacientes (tanto con CCR avanzado metastásico) mostraron mutaciones sin igual entre los tejidos y el plasma.
El
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la metilación del promotor estuvo presente en el 82,3% (70/85) de las muestras de tejido tumoral primaria . El análisis mostró 86% (73/85) de concordancia con el análisis cfDNA (k = 0,630 ± 0,092, p & lt; 0,0001). Los resultados discordantes sólo los pacientes afectados con la metilación aberrante de
SEPT9 Hoteles en muestras de tejidos y muestras de plasma no metilados (n = 12).
La distribución de muestras positivas y negativas en los tejidos y el plasma se muestra en la tabla 1, junto con el rendimiento analítico de los análisis cfDNA.
Tras la exclusión de dos pacientes con diferentes
KRAS
genotipo en el tejido y plasma, los 27 pacientes (81,5% varones) se presentan tanto alteraciones genéticas y epigenéticas en las muestras de tejido (31,8%, 27/85) fueron considerados para otros análisis cuantitativos. En estos pacientes, la tasa de concordancia entre los tejidos y el plasma fue del 93% (25/27) de la alteración epigenética y el 81% (22/27) para el
KRAS
análisis de la mutación (es decir, dos muestras resultaron negativas cfDNA para la metilación de
SEPT9 Opiniones y cinco eran negativos para la presencia de
KRAS
mutaciones). Entre las diferentes mutaciones de KRAS que hemos probado, la sustitución G12V fue el más representado (n = 11), seguido de G12D (n = 7) y G13D (n = 7). Por último, una muestra exhibió la mutación G12A, mientras que el G12S se encontró en otro. En general, el 74% y el 26% de los sitios de mutación se encuentra en los codones 12 y 13, respectivamente.
La mediana
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tasas de metilación en tejidos tumorales y muestras de plasma fueron 64,5% (12,2-99,9 %) y 14,5% (0 a 45,5%), respectivamente. La mediana
KRAS
carga de mutación fue de 33,6% (1,8-86,3%) en los tejidos y el 2,9% (0-17,3%) en muestras de plasma. Los datos cuantitativos de ambas alteraciones genéticas y epigenéticas de acuerdo con diferentes características patológicas clínicas se resumen en la Tabla 2. No se encontraron asociaciones significativas con el género, la localización del tumor primario y el estado de diferenciación en ambos tejidos tumorales y muestras de plasma. En cuanto a la clasificación de la etapa patológica, la tasa de metilación mediana de
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fue significativamente mayor en tejidos con cáncer en etapa avanzada que en los tejidos en fase inicial. Una correlación estadísticamente significativa se encontró entre los tejidos y el plasma
SEPT9
tasa de metilación (r = 0,407, p = 0,035), mientras que no se encontró asociación entre el tejido y plasma
KRAS
carga de mutación (r = 0,092, p = 0,651).
se realizaron análisis adicionales de encendido /t relación de p
KRAS
carga de mutación y
SEPT9
tasa de metilación, para identificar posibles diferencias entre grado genética y epigenética de transición a partir de tejido de plasma. La relación P /T de
SEPT9
tasa de metilación fue significativamente más alta que la relación P /T de
KRAS
carga de mutación (24,2% vs 7,9%, p = 0,0228), ambos parámetros que muestran una amplio espectro de valores (rango de 0 a 72,9% para
SEPT9
relación P /T y 0-62,6% para
KRAS
relación p /t). Este hallazgo fue casi enteramente atribuible a la gran discrepancia entre las relaciones de P /T genéticos y epigenéticos detectables en etapas tempranas del cáncer (p = 0,0108), ya que la diferencia en los cánceres en etapa avanzada ya no fue significativa (p = 0,6806) (Figura 1). La concentración de cfDNA en las primeras etapas pacientes con CRC (mediana 30,6 ng /ml, 4,6 a 66,8) fue menor que en pacientes en etapa avanzada (80,2 ng /mL, 31,0 a 195,0; p = 0,0001). El cfDNA También se encontró que era más fragmentado (índice de integridad: 0,36, 0.0.7-0.85 vs 0,63, 0,33 a 0,95; p = 0,0163). No se encontraron asociaciones significativas entre los parámetros cfDNA y alteraciones genéticas o epigenéticas, a excepción de una débil correlación entre el índice de integridad cfDNA y
KRAS
carga de mutación en los cánceres avanzados (r = 0,572, p = 0,040).
Discusión
a pesar de que el uso de cfDNA como potencial sustituto del genoma del cáncer se ha sugerido originalmente hace más de 30 años [13], y el papel de la biopsia líquida ha sido evaluada por su predictivo y pronóstico valor en un número de configuraciones, con resultados prometedores, pruebas de cáncer basados en cfDNA no se han desarrollado para su uso clínico hasta ahora.
el alto grado de fragmentación junto con la concentración sanguínea baja cfDNA hacer un analito difícil en virtud de un técnico perspectiva. Por otra parte, la cinética de liberación todavía inciertos cfDNA relacionada con el tumor en el torrente sanguíneo y los cambios en la composición genética durante la progresión de ambos contribuyen a hacer cfDNA un "difícil de leer" analito, incluso bajo el punto de vista biológico.
Los resultados de nuestro estudio, que no sea confirmando que la biopsia líquido predice alteraciones de los tejidos tumorales, son consistentes con la hipótesis de que pueden existir algunas diferencias entre la velocidad a la que las alteraciones genéticas y epigenéticas se mueven a partir de tejido de plasma.
con el fin de hacer resultados menos vulnerables a la interferencia técnica y hacer que los datos genéticos y epigenéticos fiable y directamente comparables, adoptamos una serie de expedientes metodológicos adaptados de publicaciones recientes. En primer lugar, el análisis se realizó en el plasma ya que esta matriz biológica representa una mejor fuente de cfDNA que el suero [1, 6]. A continuación, se utilizó amplicones cortos relativos de ambas determinaciones, y esto fue debido al hecho de que la longitud del fragmento puede influir en la sensibilidad de la detección de la mutación y la metilación [5, 14, 15]. También hemos asegurado un alto nivel de sensibilidad del ensayo epigenética por la orientación de una isla CpG específico, que se ha encontrado recientemente para mostrar la mayor susceptibilidad a los cambios de metilación en la secuencia adenoma-carcinoma [9]. Por último, según la Sociedad Americana de Oncología Clínica y National Comprehensive Cancer Network (NCCN), un alto nivel de tasa de detección se ha obtenido de
KRAS
análisis de mutaciones por la orientación puntos de acceso en el codón 12 y 13, que son conocidos para dar cuenta de aproximadamente el 95% de todas las mutaciones [16].
En el presente estudio, la PCR cuantitativa para la metilación y un métodos basados ARMS-PCR cuantitativa se utilizaron para
SEPT9
metilación y
analiza KRAS
mutación, respectivamente. Debido a importantes avances tecnológicos, nuevos métodos tales como PCR digitales [17], Inteplex qPCR [14] la tecnología de haz [18], MethyLight cuantitativa o MethyLight digital de PCR [19] y las nuevas secuencias de profundidad se aproxima [20] ya están disponibles, lo que permite cuantificación absoluta de los alelos mutantes o metilados en frecuencias muy bajas y con imprecisión inferiores a los descritos aquí. Sin embargo, los ensayos que hemos utilizado en este estudio son más ampliamente disponibles en los laboratorios clínicos, y también se caracterizan por una sensibilidad óptima, siendo capaz de detectar la alteración% al menos 2 en un fondo normal [21]. Aún más importante, el rendimiento analítico de los ensayos genéticos y epigenéticos fueron muy similares en términos de sensibilidad y precisión, lo que permite la comparación directa de los datos de diferentes alteraciones.
La primera parte del estudio, realizado en toda la cohorte de 85 pacientes con CRC, confirmó sustancialmente evidencia previa de que el análisis de los
KRAS
y
SEPT9
en el plasma puede ser visto como una alternativa fiable al tejido. El estado de
KRAS
se utiliza generalmente como marcador predictivo de la respuesta a epidérmico establecido receptor del factor de crecimiento (EGFR) inhibidores debido al hecho de que mutante
KRAS
se asocia con la resistencia a monoclonal anti-EGFR la inmunoterapia de anticuerpos con agentes tales como centuximab o panitumumab [22,23]. Por el contrario, la metilación aberrante de la región promotora del
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gen se ha propuesto de manera convincente como biomarcador sensible y específico para el diagnóstico no invasivo precoz del CCR [24].
Siguiendo las sugerencias recientemente propuesto por Wasserkort y coautores [9], y por lo tanto dirigidas a una isla CpG en el promotor específico de la
SEPT9
gen, encontramos un número muy elevado de muestras de tejidos hypermetylated (82%), en un grado mayor que se informó anteriormente en la literatura (por lo general oscila entre el 78 y el 81%) [25]. Los resultados obtenidos en las muestras de plasma emparejados revelaron alta concordancia global (86%) y especificidad (100%) en comparación con el análisis del tejido del tumor. En la misma muestra, un
se detectó KRAS
mutación en el 34% de los pacientes, de acuerdo con los datos obtenidos en otras cohortes de pacientes con CRC no seleccionados [10,26]. El correspondiente análisis de las muestras de plasma también reveló un alto grado de concordancia (89,4%) y especificidad (93%) en comparación con el tejido. La mayoría de los estudios que comparan los resultados de un ensayo de cfDNA con el análisis de los tejidos tumorales reportaron un rendimiento diagnóstico mucho más baja, con valores de especificidad constantemente inferior al 80% [27-29]. Como excepción, sólo dos estudios recientes informaron valores de especificidad comprendidos entre el 95,3% [30] y 98% [14].
En la segunda parte del estudio, se analizó la tasa de concordancia entre el tejido y plasma a continuación, se compararon carga mutación y la tasa de metilación, y los resultados obtenidos con los dos ensayos. En el subgrupo de 27 pacientes portadores de alteraciones genéticas y epigenéticas de tejido, el
KRAS
carga mutación variarse de 1,8% a 86,3% (casi 48 veces), lo que muestra una heterogeneidad interindividual más alto que el
SEPT9
tasa de metilación, que varió de 12,2% a 99,9% (es decir, aproximadamente 8 veces). En la transición de tejido a plasma, cinco muestras se convirtieron en WT para el estado de la mutación y dos fueron ya no hypermethylated. El grado de metilación en movimiento a partir de tejido de plasma era casi 3 veces mayor que la tasa de carga de mutación como resultado de la comparación de las relaciones de dos p /T (24,2% frente a 7,9% para la relación de p /t de
SEPT9
tasa de metilación y
KRAS
carga de mutación, respectivamente). De acuerdo con informes recientes, este hallazgo podría explicarse por la heterogeneidad intratumoral del tumor primario, que preferentemente se deteriora genética en lugar de análisis epigenéticos [7, 31]. Sin embargo, puesto que la diferencia que observe entre las dos relaciones P /T es atribuible exclusivamente a los datos obtenidos en etapas tempranas del cáncer mientras que la evolución clonal se produce normalmente cuando la metástasis está desarrollando, la clonalidad del tumor explicaría sólo parcialmente nuestros resultados [32].
Para la
KRAS
análisis, se obtuvieron valores comparables de carga de mutación entre los cánceres tempranos y avanzados tanto en el tejido (26,9% frente a 34,7%) y las muestras de plasma (1,9% frente a 4%), de modo que el p análisis /t no reveló diferencias significativas de acuerdo con las fases del tumor (8,6% vs 7,3%). Por el contrario, se encontró una diferencia estadísticamente significativa para el
SEPT9
análisis de metilación entre p cociente /t en los cánceres tempranos y avanzados (33,8% vs 19,0%, p = 0,0108). Esta variación fue principalmente atribuible a una discrepancia en la tasa de metilación detectado en los tejidos (57,2% vs 80,8%, p = 0,0009), ya que no se encontraron diferencias en las muestras de plasma (15,8% frente a 12,9% para principios vs etapas avanzadas). Por lo tanto, la transición de ADN que alberga la alteración epigenética en la circulación en etapas tempranas del cáncer es aparentemente más consistente que la transición de ADN que alberga un
KRAS
mutación. De acuerdo con los datos más recientes de la literatura, esta evidencia podría interpretarse como el resultado de las diferencias en los tipos de afectación de los tejidos observados previamente para CRC firmas genéticas y epigenéticas [33]. En particular, mientras que el
SEPT9
metilación aberrante se origina en las células epiteliales y luego se transfiere rápidamente a las células del estroma [9], el
KRAS mutaciones
albergadas por compartimento epitelial no son compartidos por las células del estroma [ ,,,0],34]. En consecuencia, la diafonía molecular entre el epitelio y el estroma tumoral se producen para el
SEPT9
alteración epigenética podría facilitar la transición de ADN aberrante de los tumores primarios para la circulación.
Además, el total más bajo grado de carga de mutación con respecto a la tasa de metilación detectado en los tejidos de CRC (26,9% vs 57,2% en etapas tempranas del cáncer) puede haber contribuido a aumentar el efecto de dilución de la naturaleza de tipo
ADN KRAS
en la circulación .
En conclusión, los resultados del presente estudio confirman que el análisis cfDNA representa una estrategia adecuada para el análisis exhaustivo de los perfiles genéticos y epigenéticos tumorales, incluso utilizando métodos de rutina. Lo más importante, proporcionamos primera evidencia de que la tasa a la que tumor derivado cfDNA puede detectarse en la circulación no sólo depende de la sensibilidad de los métodos utilizados y la complejidad de la cinética de liberación, sino también de la naturaleza de la única alteración. En una época caracterizada por el uso creciente de estudios de expresión génica completa de los tumores sólidos para dilucidar la complejidad de los tejidos tumorales y la heterogeneidad de los fenotipos celulares, nuestro estudio pone de relieve la necesidad de una mejor caracterización de patrones genéticos y epigenéticos específicos del cáncer de acuerdo a los distintos compartimientos tumorales, por lo que el valor de significación clínica y de la evaluación de cfDNA puede ser en última instancia mejorado.
estudios de confirmación adicionales pueden apoyar la hipótesis ya se ha sugerido por algunos autores, según la cual el análisis de cfDNA representa una valiosa alternativa a análisis de tejidos, pero puede también convertirse la primera opción tanto para su caracterización genética y epigenética del tumor, proporcionando una mejor retrato global de las enfermedades malignas [5, 14, 29, 30].