Extracto
Antecedentes
La tecnología de microarrays normal aplicada a microARN (miARN) de perfiles es una herramienta prometedora en muchos campos de investigación; sin embargo, estudios independientes que caracterizan la misma patología a menudo han reportado resultados mal superpuestos. métodos de análisis de miARN han sido sólo recientemente comparación sistemática, sino sólo en algunos casos el uso de muestras clínicas.
Metodología /Principales conclusiones
Se investigó la reproducibilidad entre la plataforma de cuatro miARN plataformas de microarrays (Agilent, Exiqon , Illumina, y Miltenyi), comparando tejidos de colon nueve pares de tumor /normal. El miRNAs discordantes más concordantes y seleccionados fueron estudiados más a fondo por RT-PCR cuantitativa. A nivel mundial, se encontró un solapamiento entre los pobres miRNAs expresados diferencialmente identificados por cada plataforma. Sin embargo, se observó durante ocho miRNAs alto nivel de coincidencia en la expresión diferencial entre las cuatro plataformas y comparabilidad a QRT-PCR. Además, la mayoría de los conjuntos de genes miARN identificados por cada plataforma se enriquecen de manera coherente en los datos de las otras plataformas y la gran mayoría de cáncer asociado conjuntos miARN de colon derivados de la literatura fueron validados en nuestros datos, independientemente de la plataforma. la integración de cálculo de perfiles de expresión génica de los genes miARN y sugirió que anti-correlación predijo genes diana de miRNAs expresados diferencialmente son comúnmente enriquecidos en las vías relacionadas con el cáncer y en los genes implicados en el transporte de nutrientes y la glucólisis.
Conclusiones
Los desafíos técnicos y analíticos en la medición de miRNAs aún permanecen y se requiere más investigación con el fin de aumentar la coherencia entre las diferentes metodologías basadas en microarrays. Sin embargo, se encontró una mejor concordancia entre plataformas examinado miARN establece en lugar de miRNAs individuales ya través de un miRNAs - gen enfoque de integración de la expresión
Visto:. Callari M, M Dugo, Musella V, E Marchesi, Chiorino G, Gran MM, et al. (2012) Comparación de las plataformas de microarrays para medir la expresión diferencial de microARN en tejidos normales emparejados /cáncer de colon. PLoS ONE 7 (9): e45105. doi: 10.1371 /journal.pone.0045105
Editor: Yujin Hoshida, Mount Sinai School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 31, 2012; Aceptado: August 14, 2012; Publicado: 13 Septiembre 2012
Copyright: © Callari et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Fundación Cariplo (2007.1215 /10.4890 al mapa), Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC IG-10302 de 2010 y el SC y AIRC 5 × 1000 n. 12162 de Carolina del Sur) y el Ministerio de Salud (ACC subvención a la DGM), y por el apoyo de la Región de Lombardía. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
microRNAs (miRNAs) son pequeñas moléculas no codificantes de ARN de 18-24 nucleótidos de longitud que son ampliamente conservadas en todos los organismos eucariotas y sirven como reguladores de la expresión génica. miRNAs están involucrados en todos los principales procesos celulares y están implicados en un gran número de enfermedades humanas, incluyendo el cáncer [1] -. [3] |
Durante la última década, la tecnología de microarrays de ADN se ha convertido en una metodología cada vez más rentable que es capaz de generar rápidamente los datos de alto rendimiento, allanando el camino a escala del genoma análisis (GW) de la expresión de genes, las variaciones del número de copias del genoma, SNPs, y las alteraciones epigenéticas. Las técnicas basadas en microarrays se han utilizado ampliamente en varios campos de los ensayos de investigación y moleculares utilizando patrones de expresión génica y algoritmos matemáticos predeterminados, tales como MammaPrint®) [4], están todavía en fase de validación por estudios clínicos multicéntricos prospectivos en el cáncer de mama.
Más recientemente, la tecnología de microarrays se ha aplicado a miARN perfiles y se está convirtiendo en una técnica prometedora en muchos campos de investigación, como la investigación traslacional en oncología, y puede proporcionar información útil sobre el papel de los miRNAs tanto en la tumorigénesis y progresión del cáncer [2]. Sin embargo, estudios independientes que caracterizan la misma patología tienen resultados a menudo mal superpuestos. Esto podría ser debido al pequeño tamaño de la muestra, la variabilidad y heterogeneidad tumoral alta, sino también a razones técnicas. Una ventaja importante del enfoque de microarrays consiste en la detección de alto rendimiento simultánea de hasta miles de moléculas en un solo ensayo, pero esto requiere condiciones de hibridación que ser el mismo para todas las sondas en la matriz. Esto no es trivial para microarrays miARN debido a que el contenido de GC de miRNAs es muy variable y las opciones para el diseño de la sonda son más limitados que para el ARNm debido a su corta longitud. Para una revisión completa de los conceptos generales y los desafíos especiales que son relevantes para miARN perfiles se refiere a Pritchard et al [5]. Una multitud de plataformas para miARN perfiles están disponibles comercialmente, y cada fabricante ha desarrollado sus propios procedimientos técnicos para maximizar la sensibilidad y especificidad en la medición de los niveles de expresión de los genes miARN. Como resultado, se espera que señales de la sonda que difieren en gran medida entre las plataformas, y una comparación directa no es posible. A pesar de esto, los patrones generales de expresados diferencialmente (DE) miRNAs deben ser detectados de forma coherente por todas las plataformas. Sólo recientemente, la comparación de la reproducibilidad intra e inter-plataforma de microarrays miARN se ha analizado en más de tres plataformas diferentes (ver Tabla S1 para más detalles) [6] - [11]. Tomados en conjunto, estos estudios proporcionan evidencia de que las plataformas de microarrays miARN muestran una excelente reproducibilidad intra-plataforma, pero limitado concordancia entre plataformas. De hecho, la comparación de miRNAs identificados como DE dentro de cada plataforma, una variación significativa en el número total, así como en el factor de cambio de miRNAs se ha observado. Tres de estos estudios [6]; [8]; [9] basado sus conclusiones en la comparación de los tejidos y conjuntos de tejidos de origen completamente diferente. Sah et al. analizó la expresión de miRNAs siete sintéticos se disparó en una concentración conocida en un ARN de tejido de la placenta y se hibrida en cinco plataformas [11]. Para estar más cerca de una aplicación de microarrays miARN en la investigación del cáncer, Git y col. analizó un grupo de tejidos normales de mama y líneas celulares de cáncer de mama dos [7] y Dreher et al. en comparación queratinocitos humanos untrasfected y VPH-transfectadas [10]. Incluso si, los antiguos cuatro comparaciones representan un sistema útil para abordar cuestiones técnicas, y los posteriores dos estudios son, sin duda, más realista, el problema de la concordancia de las diferentes plataformas, cuando se utilizan muestras clínicamente, sin embargo, no ha sido dirigida.
En el presente estudio, se compararon los perfiles de expresión de genes miARN de nueve de cáncer colorrectal y mucosa normal del colon muestras de los mismos pacientes que usan cuatro plataformas comerciales diferentes (Agilent, Exiqon, Illumina y Miltenyi). A continuación, la expresión de los miRNAs discordantes más concordantes y seleccionados entre plataformas se evaluó con cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR). Por último, los análisis integrador de miRNAs en el contexto de la expresión de genes de datos y literatura se realizaron como una prueba de principio de la validez del análisis de microarrays miARN en la obtención de información sobre el papel biológico de estos miRNAs.
Resultados
Experimental Marco
Para poner de relieve la influencia del origen de la muestra y el diseño del estudio de los resultados obtenidos, se hizo una comparación computacional de los datos de expresión de cuatro estudios de microarrays. Se seleccionaron los datos obtenidos en una plataforma miARN común, es decir, Agilent, a partir de los dos estudios de comparación plataforma miARN (detalles en la Tabla S1), cuyos datos de expresión en muestras humanas están públicamente disponibles (GSE13860 [6] y E-MTAB-96 [7] ) y a partir de dos estudios elegidos como ejemplos de aplicaciones experimentales en un entorno clínico, es decir, perfiles asociados a la tumorigénesis de próstata [12] y el cáncer gástrico [13] (GSE21036 y GSE28700, respectivamente, los detalles en la leyenda Fig.S1). Como se muestra en la Figura S1, el número del documento DE miRNAs y los cambios veces asociados son considerablemente más altos en el análisis multi-plataforma que en los perfiles que buscan en la tumorigénesis. La imposición de un uniforme y umbral arbitrario (| log
2 veces el cambio | & gt; 1), 88,5% (GSE13860) y el 25,9% (E-MTAB-96) de miRNAs presentes en las matrices fueron expresados diferencialmente en la multiplataforma conjuntos de datos; por el contrario, sólo el 6,9% (GSE21036) y 6,7% (GSE28700) de miRNAs fueron identificados como DE al mismo umbral de los conjuntos de datos clínicos.
Con estas premisas, decidimos evaluar la reproducibilidad entre plataformas en un entorno clínico mediante la evaluación del tumor y de los perfiles normales contraparte miARN en muestras recogidas de nueve pacientes sometidos a resección quirúrgica de cáncer de colon (ver Tabla S2 por las características clínicas y patológicas). alícuotas de ARN a partir de estas muestras se hibridó en cuatro plataformas de microarrays Agilent: SurePrint G3 humana miARN microarrays, Array Exiqon miRCURY LNA microARN, Illumina Human_v2 microARN BeadChips de expresión, y Miltenyi miRXplore de microarrays. Principales características de las cuatro plataformas se describen en la Tabla 1.
Debe tenerse en cuenta que la plataforma de Illumina fue retirada desde marzo de 2010; Sin embargo, decidimos incluirlo en nuestra comparación debido a su amplio uso en laboratorios de todo el mundo, incluyendo los de nuestro Instituto. En consecuencia, los temas abordados en la presente investigación pueden ser de interés para los usuarios de la plataforma Illumina para interpretar mejor sus resultados y que permitan un interruptor más lógica a una plataforma diferente.
Las matrices de Agilent, Exiqon, y Illumina se llevaron a cabo en un solo color. Miltenyi se hibridó en dos colores: muestras de tejido se marcaron con HY5, y una referencia sintética comprado por Miltenyi con HY3. Dado que la referencia sintético fue diseñado en miRBase 9,2 y se cubre sólo una parte de los miRNAs presentes en las matrices diseñadas en miRBase 14.0, solamente se consideraron los datos hY5 y utilizados para la normalización con el fin de permitir una comparación más directa con los otros tres plataformas.
Las plataformas de Agilent, Exiqon, y Illumina contenían sondas diseñadas ya sea en secuencias de genes miARN virales o en miRNAs putativo aún no anotados en miRBase, derivados de la literatura y los estudios de secuenciación de próxima generación. Dado que estas secuencias están presentes sólo en una plataforma, que fueron excluidos de los análisis.
Base de datos miRBase es el repositorio principal para todas las secuencias de genes miARN y anotaciones utilizadas por todos los fabricantes para el diseño de las sondas. Sin embargo, la actualización frecuente de miRBase se traduce en problemas de anotación. Para evitar posibles sesgos, se seleccionaron las matrices diseñadas en una estrecha versiones miRBase y las sondas de las cuatro plataformas probadas fueron diseñados en ambos v12.0 o v14.0 miRBase. Verificamos que los nombres y las secuencias de miRNAs presentes en v12.0 no cambiaron en la versión más reciente miRBase, mientras que se añadió un conjunto de nuevos miRNAs. La diferencia en el número total de miRBase anotado miRNAs en las cuatro plataformas fue relativamente pequeña (6%).
Evaluación de la distribución de datos y la tasa de detección
intensidad de la señal no normalizada mostraron una plataforma dependiente distribución que refleja los métodos únicos desarrollados por los fabricantes para el marcaje, hibridación rigor y adquisición de datos (fig. 1A). Para todas las plataformas, las señales cubren la mayor parte de la gama dinámica disponible para los escáneres de 16 bits; Agilent, las distribuciones de señal Exiqon, y Miltenyi tendían a tener asimetría positiva (una cola larga lado derecho) y difiere de distribuciones Illumina donde muchos más sondas mostraron intermedio a altos niveles de expresión.
(A) Intensidad Global no normalizada distribución. (B) Representación gráfica de la detección de los genes miARN; azul = detectado, amarillo = no detectado, gris = no está presente. (C) Box-trama del porcentaje de contenido de GC en las secuencias de los genes miARN maduro; azul = detectado, amarillo = no detectado.
P
-valores se calcularon mediante la prueba t de Student.
En las plataformas Agilent y Illumina, se han seguido los criterios de detección de llamada recomendadas por los fabricantes. El software de iluminación proporciona una detección
P
-valor que estima en qué medida una señal es mayor que el ruido representado por los controles negativos; Del mismo modo, el software de Agilent proporciona una bandera (gIsPosAndSignif) que estima si la señal característica es positiva y significativa en comparación con el fondo. Por el contrario, para las plataformas Exiqon y Miltenyi un criterio de detección de llamada no se ha definido; para estas plataformas, establecimos un porcentaje de umbral de píxeles para cada punto de la matriz cuya intensidad fue menor que el fondo. Teniendo en cuenta estos procedimientos de filtrado, 675 (78% de miRBase anotado miRNAs presentes en la matriz), 775 (87%), 808 (94%), y 376 (41%) miRNAs únicas fueron detectables en al menos una de las muestras en el Agilent, Exiqon, Illumina, y las plataformas de Miltenyi, respectivamente (Fig. 1B). Había 233 miRNAs que fueron compartidos por todas las plataformas, siendo fuertemente limitado por la baja tasa de detección en la plataforma Miltenyi
.
Con el fin de estimar en qué medida el contenido de GC impactó en la detección de llamada de cada plataforma, se calculó el porcentaje de GC de los miRNAs ensayó y se compara, para cada plataforma, el contenido de GC entre miRNAs detectados y no detectados. A pesar de que cada fabricante ha ajustado de diseño y de hibridación procedimientos de la sonda para superar las discrepancias en la estabilidad termodinámica de reconocimiento de sonda /diana, el contenido de GC fue significativamente mayor en el detectado que en los miRNAs no detectados en todas las plataformas, y esta diferencia fue particularmente evidente para la Miltenyi plataforma (Fig. 1C).
Normalización y Clase Comparación: Resultados de la
Varios procedimientos de normalización y de procesamiento de datos están disponibles, más traducido por estudios de expresión génica y con poco consenso entre los laboratorios. Teniendo en cuenta las características únicas de cada plataforma, es poco probable que el mismo procedimiento de normalización podría llevar a cabo por igual en todas las plataformas para corregir diferencias sistemáticas.
Con el fin de elegir la mejor normalización para cada plataforma, se evaluó la capacidad de la cuatro métodos diferentes (loess, cuantiles, rango invariante y robusta Spline normalización) para reducir la variabilidad intra-clase en muestras normales y tumorales mediante el uso de la expresión relativa de registro (RLE) (ver Fig. S2). Por otra parte, se esperaba que el mejor método de normalización debería aumentar los cambios veces y el número de miRNAs expresados diferencialmente entre el tumor y el tejido normal. De acuerdo con estos criterios, se optó por la RSN de Illumina y Agilent, loes para Exiqon y cuantil de Miltenyi.
En la Figura S3 tumor /comparaciones de clases normales en las 4 plataformas, expresado como histogramas de registro
P
-valor y FDR, se informó. La comparación identifica, en un umbral
P
& lt; 0,005, 29 miRNAs que fueron modulados en Agilent, 4 en Exiqon, 42 en Illumina, y 3 en la plataforma de Miltenyi, correspondientes a 4,3%, 0,5%, 5,2 %, y 0,8% de miRNAs detectado, respectivamente.
Acuerdo Inter-plataforma de la Clase: Resultados de la comparación
Para evaluar la concordancia entre plataformas, se examinaron los miRNAs que estaban dE a
P
& lt; 0,005 en al menos una plataforma; mediante la combinación de estos miRNAs, se generó una lista de consenso de 68 miRNAs. Para poner de relieve la concordancia entre las cuatro plataformas, el
P
-valores y los factores de cambio de los miRNAs lista de consenso se muestran en una escala colorimétrica en la Figura 2A y B, respectivamente. La imposición de un
P Hotel & lt; 0,005 en las cuatro plataformas, no hay miRNAs eran comúnmente DE. En
P Hotel & lt; 0,05, hsa-miR-378, miR-HSA-375, HSA-miR21 *, hsa-miR-145 se detectaron como DE por todas las plataformas y otras 4 miRNAs (HSA-mir -96, HSA-miR21, HSA-miR147b, y hsa-miR-143) estaban dE sobre todas menos una plataforma; de hecho, en la plataforma Miltenyi, hsa-miR-96 y hsa-miR-147b no se detectaron, mientras que hsa-miR-21 y miR-HSA-143 no llegaron a un umbral significativo. No se encontraron doce, 2 y 25 miRNAs ser exclusivamente en las plataformas DE Agilent, Exiqon, y Illumina, respectivamente. Las 29 miRNAs restantes eran DE en al menos dos plataformas. Los cambios a veces son concordantes a través de plataformas con la única excepción de dos miRNAs (HSA-miR-218 y miR-HSA-302a) que estaban DE a
P Hotel & lt; 0,05 en Illumina y Exiqon, pero con doblez discordantes -cambios (figura 2B).
(a)
P-valores
de la comparación clase de tumor /normal de visualizar en un mapa de calor azul-blanco.; ver escala en la figura. (B) el registro
2 veces los cambios en la comparación clase de tumor /normal de visualizar en un mapa de calor rojo-verde; rojo = hasta reguladas; verde = las reguladas en los tumores.
Con el fin de verificar que el número limitado de comúnmente DE miRNAs no fue el resultado de los métodos de normalización, se calculó el número de miRNAs expresados diferencialmente en cada plataforma y para cada uno de los cuatro métodos de normalización. Para el 256 (= 4
4) combinaciones posibles, hemos identificado una lista de miRNAs DE compartida. La unión de todas estas listas se reunieron cuatro miRNAs (HSA-miR-378, hsa-miR-375, hsa-miR-145, hsa-miR-21 *), lo que sugiere que los diferentes métodos de normalización pueden ser peores que o, a lo sumo, igual a nuestra elección (Fig. S4A). Digno de mención, entre los 4 miRNAs comunes del hsa-miR-378 fue identificado en todas las combinaciones posibles (Fig. S4B).
La comparabilidad general de la plataforma en términos de precisión y capacidad de identificar DE miRNAs se evaluó centrándose respectivamente en los cambios veces y valores t obtenidos en la comparación de tumor /normal para los 233 miRNAs comúnmente detectados por las 4 plataformas. Después de análisis de agrupamiento, la mejor correlación entre log se observaron
2 veces los cambios entre Agilent y Exiqon (correlación de Pearson = 0,63), mientras que Illumina mostró el más diferente de patrones y cambios veces más anchas (Fig. 3A y la Fig. S5A). De la misma manera, sólo una similitud parcial en los valores de T (correlación de Pearson; rango = 0,28 hasta 0,48; media = 0,40) está presente entre las plataformas 4, pero esta vez Miltenyi mostró el comportamiento más divergentes (Fig 3B y Fig.. S5B)
la agrupación jerárquica (distancia = correlación de Pearson;. ligamiento = promedio) de log2 veces los cambios (a) y t-valores (B) obtenidos para cada plataforma mediante la comparación de muestras tumorales y normales en el subgrupo de frecuencia miRNAs detectado. t-valores se calcularon utilizando una prueba t con el modelo de variación aleatoria.
Acuerdo Inter-miARN plataforma usando Establece
Los estudios previos que comparan el rendimiento de las plataformas de microarrays de expresión génica sugirió que, a pesar de un solapamiento relativamente baja entre las listas de genes dE se obtuvo con diferentes plataformas, se encontró un buen acuerdo cuando se mira en conjuntos de genes relacionados biológicamente en lugar de los genes individuales [14]. Para probar si las mismas conclusiones se pueden extraer de las plataformas de microarrays miARN, se realizó un conjunto de enriquecimiento de análisis de miRNA en nuestra prueba de datos de dos series de miARN establece: 1) la DE miRNAs identificado por cada plataforma en nuestro estudio, para evaluar su enriquecimiento entre arriba o miRNAs en las otras plataformas de las reguladas; 2) miRNAs identificados como arriba o abajo regulados entre el cáncer de colon y la mucosa normal en otros estudios basados microarray de la literatura (Tabla S3). La mayoría de los conjuntos de genes miARN identificados por cada plataforma se enriquecen con coherencia en los datos de las otras plataformas, con el Miltenyi miARN set mostrando los enriquecimientos inferiores (Fig. 4A). Por otra parte, la gran mayoría de cáncer asociado conjuntos miARN de colon derivada de la literatura también se validaron en nuestros datos y, al menos en parte, independiente de la plataforma de prueba (Fig. 4B).
Resumen de miARN conjunto enriquecimiento análisis realizado utilizando GSEA. Utilizando los datos de expresión obtenidos con los 4 plataformas diferentes, hemos probado el enriquecimiento de miRNAs DE (al comparar el cáncer colorrectal y mucosa normal) en nuestro estudio (A) o reportado en la literatura (B). miRNAs arriba-abajo o regulado fueron probados por separado. Para los conjuntos de genes miARN literatura derivados, el autor abetos y la plataforma utilizada se indica (véase también el cuadro S3). Los falsos descubrimiento tarifas de menos de 5% o 10% se consideraron significativos o marginalmente significativa, respectivamente.
Comparación con QRT-PCR datos
Microarray datos se validan periódicamente por QRT-PCR. Hay diferentes sistemas disponibles en el mercado y, como se ha señalado para las plataformas de microarrays, los fabricantes de QRT-PCR también tienen que lidiar con la actualización continua de las anotaciones miRBase. Como un método de validación, dependiendo de la disponibilidad de los ensayos seleccionados miARN en el momento en que se realizaron los experimentos, se utilizaron ensayos de SYBR Verde de LNA Exiqon o ensayos de Applied Biosystems Taqman.
Nos hemos centrado nuestro análisis de validación en 18 miRNAs que resumir las diferentes situaciones que se encuentran en la comparación plataforma (Tabla 2). El 8 DE miRNAs en al menos 3 de 4 plataformas de gama se validaron como significativamente DE por QRT-PCR. Para estos miRNAs 8, se observaron altas correlaciones entre los valores de expresión de matriz QRT-PCR y en y por pares contrastes de datos de la matriz (Tabla 3 y File S1) con dos excepciones; en el caso de hsa-miR-21 *, aunque los datos QRT-PCR confirmó la expresión diferencial que se encuentra en todas las plataformas de gama, su correlación con la matriz de datos fue limitado (intervalo de 0,27 a 0,44 del coeficiente R); para hsa-miR-21, los valores de Illumina no se correlacionaron con los demás valores obtenidos en matrices o por QRT-PCR. Esta última discrepancia es probablemente atribuible a los miR-21 los valores de expresión de Illumina que están cerca de la saturación en todas las muestras y, por esta razón, se concentró en un rango limitado.
Para comprender mejor la base de los pobres superposición de los resultados de la comparación de clases en las cuatro plataformas, que mide la expresión de miRNAs 10 adicionales (Tabla 3 y el archivo S1).
Seis de ellos (HSA-miR-136, miR-HSA -139-5p, hsa-miR-182, hsa-miR-30a, hsa-miR-497 y miR-HSA-93 fueron seleccionados) entre el 14 DE miRNAs (
P Hotel & lt; 0,05) de acuerdo tanto a Agilent y Illumina. Hemos validado los datos de la matriz de QRT-PCR para el 5 de estos 6 miRNAs, con la excepción correspondiente de hsa-miR-93. Los coeficientes de correlación entre los datos de Illumina QRT-PCR y, o bien Agilent o variaron de 0,65 a la 0,87 para hsa-miR-136, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-30a y hsa-miR-497; para hsa-miR-182, cuyas intensidades sonda sobre Illumina estaban en niveles intermedios y DE a
P Hotel & lt; 0,005 y en Agilent estaban cerca del fondo y DE a
P Hotel & lt; 0,05 , fueron 0,86 y 0,48, respectivamente.
otros dos miRNAs, hsa-miR-886-5p y hsa-miR-886-3p, seleccionado para la validación de QRT-PCR fueron concordantes en 2 de las cuatro plataformas. La expresión diferencial de hsa-miR-886-5p, DE, el plataformas Illumina y Miltenyi, fue confirmada por RT-qPCR, mientras que, la de hsa-miR-886-3p, DE, el plataformas de Miltenyi y Agilent, no parece ser dE por QRT-PCR.
Finalmente, se seleccionaron dos miRNAs (HSA-miR-218 y miR-HSA-302a) que estaban dE, el Exiqon y plataformas Illumina pero con los cambios veces opuestos. hsa-miR-218 la reducción de expresión en los tumores en Illumina fue confirmada por qRT-PCR mientras que la de hsa-miR-302a no fue validado usando QRT-PCR.
tiempo real de datos de PCR generalmente se utilizan para determinar la sensibilidad y la especificidad de los datos obtenidos con microarrays. Para este objetivo, se compararon los resultados con los obtenidos en un estudio publicado QRT-PCR independiente, en el que 70 de los 665 miRNAs únicas Se han encontrado concentraciones expresadas diferencialmente en 40 pares de muestras de cáncer de colon normal [15]. Para cada plataforma se seleccionaron miRNAs presentes en el conjunto de datos qPCR (527 de Agilent, 596 para Illumina, 545 y 278 para Exiqon de Miltenyi) y se calcula curvas ROC utilizando diferentes umbrales de
P-valor
. (Fig. 5). Los valores de área bajo la curva ROC (AUC) mostraron que Agilent y Illumina son muy similares y son las plataformas más precisos, mientras que Miltenyi es el menos eficaz.
Considerando como patrón oro los miRNAs identificados como diferencialmente expresado en una qPCR estudio en 40 muestras de tumores normales emparejados, se evaluó el rendimiento de cada plataforma de cálculo de sensibilidad y especificidad en diferentes umbrales de
P-valor
y trazando los valores resultantes en el espacio ROC.
Biológica Insight
Cuando el 68 miRNAs dE a
P Hotel & lt; 0,005 en al menos una de las cuatro plataformas se compararon con datos de la literatura, se encontró que el 25% de ellos fueron concordantemente descrito en la literatura como desregulado en el cáncer colorrectal en comparación con la contraparte no tumor (Tabla S4). Por otra parte, encontramos que 12 miRNAs pertenecen a grupos familiares co-expresó conocidos. Se presentan los principales datos biológicos asociados a los cuatro grupos de genes miARN en la tabla 4. En cuanto a su expresión se observó que: para el conglomerado de miR 25-106b, solamente hsa-miR-25 y miR-HSA-93 están presentes en la lista de los 68 miRNAs en los umbrales hemos aplicado; el cúmulo de miR 182-96 es particularmente evidente en Illumina donde hsa-miR-182, -182 *, -183 y -96 son de los más miRNAs hasta reguladas en esta plataforma (cruzar los cambios tumoral vs normales que van desde 4,42 hasta 2,65 ); el cluster miARN 143-145 está desregulado coherentemente en todas las cuatro plataformas de nuestro estudio, siendo hsa-miR-143 el más reducido regulado miARN en los tejidos tumorales en la plataforma Exiqon (doble cambio tumoral vs tumor normales = 0,30; p = 0,036) y hsa-miR-145 el más reducido regulado en Agilent y Miltenyi (doble cambio tumoral vs normales = 0,30 y 0,35; p = 0,0027 y 0,018, respectivamente).
perfiles de expresión génica de las mismas muestras analizada por miARN arrays de expresión estaban disponibles. Por lo tanto, se consideró que un enfoque de integración para evaluar si la información biológica similar podría ser recuperada a partir de los cuatro plataformas, independientemente de la superposición en el documento DE miRNAs. Para este objetivo, utilizando la herramienta de MAGIA, una correlación negativa genes diana putativos de DE miRNAs fueron identificados en cada plataforma (S2 Archivo) y un enriquecimiento de análisis se realizó mediante el software IPA. Para poner de relieve la concordancia entre las cuatro plataformas, enriquecimiento
P
-valores para todas las vías relacionadas con el cáncer enriquecido significativamente en al menos una plataforma se muestran en una escala colorimétrica en la Figura 6A. Se identificaron concordantemente vías relacionadas con la regulación del ciclo celular y la señalización de PTEN. Cuando nos fijamos en objetivos validados por el software TarBase, el número de interacciones miARN-mRNA correlacionó negativamente a p & lt; 0,05 fue muy limitado (Agilent = 35, Exiqon = 2, Illumina = 45 y Miltenyi = 0) se opone a una comparación entre las cuatro plataformas .
(a) Pathway análisis enriquecimiento de anti-correlacionados predijo genes diana de miRNAs expresados diferencialmente en función de cada plataforma de microarrays. (B) de red entre los 8 mejores miRNAs expresados diferencialmente y su objetivo genes anti-correlacionados. Las 250 primeras interacciones fueron utilizados para generar la red utilizando la herramienta MAGIA.
Por otra parte, teniendo en cuenta los datos de QRT-PCR de los 8 miRNAs más concordantes y los perfiles de expresión génica, el mismo enfoque de integración identificó una total de 803 miARN-gen negativamente correlacionada (se prevé como objetivos miARN) interacciones (S2 archivo). La representación gráfica de las 250 interacciones destacó que muchos genes que son regulados hasta en los tumores son dianas de dos o más miRNAs-regulado (Fig. 6B) predijeron. En detalle, hay 70 genes co-dirigidos por al menos dos miRNAs y el 84% de ellos están regulados por el miR 143-145 clúster (cuadro S5). Entre estos genes los relacionados con la glucólisis y el transporte de nutrientes vías parecía excesivamente representados.
Discusión
A pesar de su descubrimiento relativamente reciente, existe un interés creciente en el estudio del papel de los miRNAs en muchos procesos patológicos, incluyendo el cáncer. En consecuencia, tecnologías de alto rendimiento, desarrollado inicialmente para GW evaluación de la expresión génica, se adaptaron rápidamente a la medición GW de miRNAs. Sin embargo, como se destaca en revisiones recientes [5]; [dieciséis]; [17], varios factores, incluyendo la longitud corta miARN, alto grado de homología de los genes miARN familias, la alta tasa de nueva identificación de los genes miARN (el número real de miRNAs en miRBase 18, publicado en noviembre de 2011 se acerca a dos mil) y el relativamente alto por ciento (aproximadamente 10%) de miRNAs artefactual no confirmado por experimentos de resecuenciación, complican considerablemente su análisis. El impacto de estos factores sobre las diferentes metodologías aplicadas por los fabricantes de las diferentes plataformas disponibles se debe considerar en los estudios de comparación entre plataformas.
Los problemas de reproducibilidad plataforma de microarrays intra e inter han sido principalmente dirigida usando parámetros experimentales donde los tejidos o líneas celulares de diferente origen se comparan, con la suposición de que, debido a la amplia gama de esperados modulaciones de expresión de dicha comparación, el ruido técnica puede llegar a ser insignificante. Este tipo de enfoque refleja el seguido en su primer estudio de fase por el consorcio de Control de Calidad de microarrays (MAQC), con el objetivo de evaluar la inter-plataforma y la reproducibilidad entre laboratorios de los datos de microarrays de expresión génica utilizando dos ARN diferentes (cerebro humano y una referencia universal humana) [18]. Este enfoque fue fuertemente cuestionado en 2007 por su falta de coherencia con los ajustes reales de investigación [19]. Sin embargo, en la mayoría de los estudios de comparación entre miARN-plataforma, citadas en Aldridge & amp; Hadfield [16] y se informa en la Tabla S1, el diseño experimental fue un sesgo hacia el uso de muestras con una fuerte diferencia de origen. Digno de mención, sólo dos estudios [7]; [10] comparó el perfil de miARN de muestras significativas biológicos en, al menos, tres plataformas diferentes, pero incluso en estos casos, las muestras son líneas celulares. Por lo tanto, nuestro estudio representa el primer intento de comparar el rendimiento de la plataforma de miARN en un entorno clínico, donde se espera que la variabilidad entre muestras dentro de la misma clase a ser mayores que en las líneas celulares.
La mayoría de los estudios de perfiles de uso muestras clínicas destinados a revelar diferencias sutiles en la expresión aun pero que están asociados a un contexto clínico específico. En esta configuración, repeticiones técnica frecuentemente no son factibles debido a la cantidad de ARN y las consideraciones económicas. Por lo tanto, en el presente estudio hemos abordado la cuestión de la comparación entre plataformas utilizando muestras que pertenecen a dos clases de tumores (emparejado y tejidos normales del colon) que teóricamente podría conducir a nuevos conocimientos de la biología del tumor y aplicaciones clínicas. [25].