Extracto
Antecedentes
exudados de tejidos contienen bajos niveles de proteínas del complemento de suero, y sus efectos reguladores sobre el cáncer de próstata progresión son en gran parte desconocidos. Examinamos los componentes específicos del complemento del suero en la coordinación de la activación de los supresores de tumores p53 y WWOX (también designado por cuenta o WOX1) y quinasas ERK, JNK1 y STAT3 en células DU145 de próstata humanos.
Metodología /Principales conclusiones
células DU145 se cultivaron durante la noche en suero humano normal 1%, o en suero humano agotado de una proteína del complemento indicado. Bajo complemento C1q- o condiciones libres de C6, WOX1 y ERK eran principalmente presente en el citoplasma sin fosforilación, mientras que JNK1 fosforilado se acumulaba en gran medida en los núcleos. Exógenos C1q restaura rápidamente la activación WOX1 (con la fosforilación Tyr33) en menos de 2 horas. Sin complemento del suero C9, p53 se activó, y hialuronano (HA) invirtió el efecto. Bajo condiciones libres de C6, HA inducida por la activación de STAT3, un potenciador de la metástasis. Notablemente, exógeno C1q indujo significativamente la apoptosis de las células DU145 WOX1 sobreexpresan, pero no las células que expresan vehículo. Un mutante negativo y Y33R dominante de WOX1 bloqueó la apoptosis efecto. C1q no potenciar la apoptosis mediada por p53. Por microscopía de fluorescencia de reflexión total interna (TIRF), se determinó que C1q desestabilizó adherencia de las células DU145 WOX1 expresan separando parcial y la inducción de formación de microvellosidades agrupado para la adhesión focal en particular en entre las células. Estas células se sometieron a la contracción, formación de ampollas en la membrana y la muerte. Cabe destacar que, tal como se determina por inmunotinción, hiperplasia prostática benigna y cáncer de próstata se han mostrado a una expresión reducida de manera significativa de tejido C1q, en comparación con los tejidos de la próstata normales de la misma edad.
Conclusiones /Importancia
concluir que el complemento C1q puede inducir la apoptosis de las células del cáncer de próstata mediante la activación de la adhesión celular y desestabilizadora WOX1. Regulación a la baja de C1q mejora la hiperplasia de próstata y la formación cancerosa debido a un fallo de la activación WOX1
Visto:. Hong Q, Sze C-I, Lin S-R, Lee M-H, El R-Y, Schultz L, et al. (2009) Complemento C1q Activa supresor tumoral WWOX para inducir la apoptosis en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 4 (6): e5755. doi: 10.1371 /journal.pone.0005755
Editor: Nils Cordes, Universidad de Tecnología de Dresden, Alemania |
Recibido: 4 Enero, 2009; Aceptado: 5 Mayo 2009; Publicado: 1 de junio 2009
Derechos de Autor © 2009 Hong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue apoyado en parte por la Fundación Guthrie para la Educación y la Investigación, el Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC96-2320-B-006-014, 96-2628-B-006-041-MY3 & amp; 96-2628-B-006- 045-MY3), el Instituto Nacional de Investigación en Salud, Taiwán (NHRIEX97-9704BI), los Cheng Kung University Landmark Proyectos nacionales (c0167), y el Departamento de Defensa, EE.UU. (BC075692) a NS Chang. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el ácido hialurónico o hialuronano (HA) participa en una notablemente multitud de eventos celulares y fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la morfogénesis, la diferenciación, la inflamación, la cicatrización de heridas, la respuesta inmune, y la progresión del cáncer y la metástasis [1] - [ ,,,0],4]. HA está implicado en la iniciación y progresión de la inflamación en ambos niveles celulares y extracelulares [5], [6]. En los niveles celulares de la inflamación, HA recluta neutrófilos, activa los macrófagos y estimula la maduración de células dendríticas. Sin embargo, en el suero HA puede interactuar con las proteínas del complemento. de origen natural glicosaminoglicanos polisulfatados, como heparina, restringir la activación del complemento en suero a través de vías tanto clásica como alternativa durante la inflamación [7] - [10]. La potencia de los glicosaminoglicanos en la inhibición de la activación del complemento depende de su extensión y posiciones de polisulfatación. A menos que conformacionalmente alterada, no sulfatado de HA, incluso a altas concentraciones (1-5 mg /ml), no puede restringir la activación del complemento [7], [11] - [13]. La inducción de la activación del complemento en suero ha sido considerado como estrategias importantes en la eliminación de células cancerosas
in vivo
[14], [15]. inhibidores del cáncer derivado de células para el bloqueo de los componentes del complemento primeros son conocidos para mejorar el crecimiento del cáncer [16]. La expresión del inhibidor de la vía alternativa del factor H en las células de cáncer de pulmón parece ser crítica para su supervivencia [17]. Sin embargo, el papel funcional de cada componente del complemento individuales de suero en la regulación de la supervivencia de células de cáncer es en gran parte desconocida.
Al igual que otros tejidos, la próstata está expuesto a los exudados de la sangre, que contiene bajos niveles de las proteínas del complemento circulante. Ya sea que las proteínas del complemento controlan el crecimiento celular y la hiperplasia de próstata con la edad es desconocida. Aquí, mediante la utilización de sueros con eliminación seleccionado de proteínas del complemento, se investigó si cada proteína del complemento individuo regula la activación de los supresores de tumores y proteínas de cinasa en las células DU145 de próstata humanos. Estas proteínas incluyen señal extracelular regulada quinasa /proteína quinasa activada por mitógeno (ERK o MAPK) [18], WW oxidorreductasa que contiene el dominio (WWOX, PARA, o WOX1) [19] - [21], p53 [22], c -jun
N-terminal quinasa
(JNK1), y el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) [23] - [25]. Se determinó que el complemento del suero sin C1q o C6, los niveles basales de la activación o la acumulación nuclear de ERK y WOX1 se redujeron significativamente, mientras que la activación constitutiva de JNK1 se produjo. WOX1 es un supresor de tumores y la proteína proapoptótico [19] - [21; comentarios]. Curiosamente, en ausencia de C9 complemento de suero, se produjo la activación de p53 constitutiva. tamaño molecular de alta HA induce significativamente la activación de STAT3 en DU145, sólo cuando C1q estaba ausente en el suero. STAT3 promueve la invasión del cáncer de próstata [23] - [25]. Finalmente, C1q solo fue capaz de activar WOX1 ectópico en matar las células de cáncer de próstata. Discutimos el escenario más probable para la circulación o pericellular HA y proteínas del complemento en la regulación del crecimiento celular del cáncer y la muerte a través de la activación de p53, WOX1, JNK1, y STAT3.
Resultados
Complemento C1q activa supresor de tumores WWOX /WOX1 en las células DU145 de próstata humano
determinamos si C1q activa WOX1 endógeno para la acumulación nuclear. La evidencia sustancial revela que WOX1 es un supresor de tumor [19] - [21], [26]. La fosforilación de WOX1 en Tyr33 (p-WOX1) es esencial para su actividad apoptótica tanto
in vitro
y
in vivo
[27] - [31]. Sin embargo, durante la hiperplasia inicial y etapas cancerosas, hay una regulación positiva significativa de la expresión y la fosforilación WOX1 Tyr33 en la próstata, piel y mama, y que la expresión se reduce drásticamente durante malignidad y metástasis
in vivo
[21] , [29], [32]. WOX1 murino /Wwox es crítico para la supervivencia post-natal, en la medida en que los ratones knockout podrían sobrevivir durante sólo un mes [20], [33]. Además, esta proteína es esencial para el metabolismo normal de los huesos [33]. Los mecanismos en relación con el control para WOX1 para ejercer prosurvival o funciones proapoptóticos aún no se han establecido.
células DU145 humana se cultivaron durante la noche en presencia de suero bovino fetal inactivado por calor (10%), seguido por inanición de 1 h sin suero. Estas células se trataron a continuación con C1q purificada para 1 hr. La localización de p-WOX1 se determinó por microscopía de inmunofluorescencia. Estas células de hambre tenían niveles muy bajos de p-citoplásmica WOX1 (Fig. 1A). Exógenos C1q inducida rápidamente acumulación de p-WOX1 en los núcleos (Fig. 1B). En comparación, cuando se cultivaron las células de hambre en agotado en C1q suero humano 1% (ΔC1q) durante 1 hr, p-WOX1 fue localizada principalmente en el citoplasma (Fig. 1C). Reconstitución de suero ΔC1q con purificada C1q inducida rápidamente acumulación p-WOX1 en los núcleos (Fig. 1D).
(A, B) las células DU145 se cultivaron en cubreobjetos y cultivadas durante la noche en 10% fetal inactivado por calor de suero bovino. Después las células se mueren de inanición en condiciones libres de suero durante 1 hora, seguido de tratamiento con o sin C1q purificado (1 mg /ml) durante 1 hr. La localización de endógeno WOX1 fosforilados-Tyr33 (p-WOX1) se determinó por microscopía de inmunofluorescencia. (C, D) Además, las células de hambre fueron cultivadas en 1% de suero humano (suero ΔC1q) empobrecido en C1q durante 1 hora, en presencia o ausencia de C1q exógeno (1 mg /ml). (E) La presencia de p-WOX1 en los núcleos se muestra desde contando ~ 100 células en 3 experimentos (media ± desviación estándar).
Complemento C1q activa WOX1 ectópico para inducir la apoptosis de las células DU145
determinamos si C1q activa WOX1 ectópico para la inducción de la apoptosis. DU145 células fueron transfectadas con EGFP-WOX1 (etiquetadas con EGFP) o EGFP solo por electroporación. Estas células fueron cultivadas durante la noche (en 10% de suero bovino fetal inactivado por calor), seguido por tratamiento con C1q purificada durante 24 horas. C1q aumento de la apoptosis y el crecimiento supresión WOX1 inducida de las células DU145 de una manera relacionada con la dosis, como se reveló por una población aumento de células en la fase de subG1 y una población reducida a la fase G0 /G1 del ciclo celular (Figs. 2A y 2B y. complementario Fig S1). En los controles, C1q no indujo apoptosis en las células DU145 sobreexpresan EGFP vector solamente (Figs. 2A y 2B).
(A) células DU145 fueron transfectadas con EGFP-WOX1 (etiquetado con EGFP) o EGFP solo por electroporación , cultivó durante la noche, y después se trató con C1q purificado (1 mg /ml) durante 24 hr. C1q aumento de la apoptosis inducida por WOX1 de las células DU145 (ver aumentos en la fase subG1). En los controles de vector, C1q no aumentar la apoptosis en las células DU145 sobreexpresan EGFP. (B) A datos representativos establecidos de 3 experimentos se muestra en el gráfico de barras. Se observaron resultados similares transfectando células DU145 con diversas cantidades de WOX1, seguido por tratamiento con 1 mg /ml C1q durante la noche (ver complementaria Fig. S1). WOX1: EGFP-WOX1. Vector: Sólo EGFP. No ep: células sin electroporación. (C) se establecieron transfectantes estables de células de CCB para expresar EGFP o EGFP-hWOX1 (WOX1 humana /WWOX). Por microscopía de lapso de tiempo, C1q (1 mg /ml) inducida por la muerte de las células que expresan hWOX1, pero no las células EGFP-expresando. Estas células que expresan hWOX1 parecían experimentar apoptosis típico, ya que exhibieron la contracción celular y formación de ampollas en la membrana de una manera relacionada con el tiempo. Un dato representativo se muestra a partir de 5 experimentos.
El aumento de la apoptosis por C1q no era debido a su activación de la cascada del complemento en el suero bovino fetal, en la medida en el suero fue inactivado por calor. También, bajo condiciones libres de suero, exógeno C1q mejorada ectópico apoptosis WOX1 mediada (datos no mostrados). Estas observaciones sugieren que WOX1 es un efector aguas abajo de la apoptosis mediada por C1q, sin la participación de la activación del complemento.
En condiciones experimentales similares, demostramos que C1q aumento de la apoptosis en las células que sobreexpresan WOX1. Estos MCF7 incluido mama (Complementario. Fig S2), y neuroblastoma SH-SY5Y (Complementario. Fig S3) y las células SK-N-SH (datos no mostrados). Una vez más, no se observó efecto usando células que sobreexpresan únicamente EGFP.
En paralelo, los transfectantes estables de carcinoma de células basales de la piel (BCC) las células para la expresión de EGFP o WWOX humano /WOX1 (hWOX1 etiquetados con EGFP) se establecieron utilizando G418 selección. Por microscopía de lapso de tiempo, se demostró que las células que expresan EGFP BCC fueron resistentes a la muerte celular mediada por C1q, mientras que hWOX1 células que expresan eran sensibles a C1q (Fig. 2C). Estas células expresan hWOX1 parecían mostrar morfología típica de la apoptosis, incluyendo la contracción celular y la formación de ampollas en la membrana.
N-terminal de dominio WW
fosforilada-Tyr33 de WOX1 es responsable de la apoptosis inducida por C1q de células DU145
Se determinó qué dominio (s) en WOX1 participa en la apoptosis mediada por células DU145 de C1q. Humana y murina WWOX /EN /WOX1 se compone de dos
N-terminal
dominios WW, una secuencia de localización nuclear, y un
C-terminal
alcohol deshidrogenasa de cadena corta /reductasa (DEG) dominio [19-21,34; comentarios]. A-WOX1 dominante negativo (dn-WOX1) fue diseñado previamente, con alteraciones en el
N-terminal
primer dominio WW [27]. dn-WOX1 se sabe que bloquea la función apoptótica de p53 y prevenir la fosforilación de WOX1 endógeno en Tyr33 [27]. Cuando las células DU145 se sobreexpresa transitoriamente con dn-WOX1 (tag EGFP), las células se resistieron la apoptosis inducida por C1q (Fig. 3). En los controles, las células fueron transfectadas con solamente un vector de EGFP, y las células no se sometieron a la apoptosis en respuesta a C1q (datos no mostrados o ver Fig. 2). En los controles positivos, las células no transfectadas fueron tratadas con estaurosporina para inducir la apoptosis de células DU145 (Fig. 3).
(A) se sometieron a electroporación con diversas cantidades de dn-WOX1 (tag EGFP) o EGFP solo, seguidos de cultivo durante 24 hr. dn-WOX1 que expresan las células fueron tratadas con C1q (1 mg /ml) durante la noche, se llevó a cabo y el análisis del ciclo celular. EGFP-expresando células fueron tratadas de manera similar (datos no mostrados). Además, las células de control no transfectadas se trataron con o sin estaurosporina (1 M) durante la noche. (B, C) A los datos representativos, creados tanto para subG1 y las fases G0 /G1 se muestra (de 3 experimentos).
Por lo tanto, sobre la base de las observaciones anteriores, el
N
es probable que sea responsable de la activación inducida por C1q de WOX1 para matar las células cancerosas-terminal de dominio WW de WOX1. DU145 células se transfectaron con el
N-terminal de dominio WW
de WOX1 (WOX1ww con una etiqueta EGFP) o EGFP solamente por electroporación y se cultivaron durante 24 horas. Por microscopía de lapso de tiempo de células vivas, C1q exógeno induce la apoptosis de las células que expresan los dominios WW (Fig. 4A). la contracción de la célula y la condensación nuclear se produjeron aproximadamente 100 a 130 min después de la exposición de las células a C1q. Este es un evento típico de apoptosis. Cuando las células DU145 se cotransfectaron con WOX1ww y dn-WOX1, la apoptosis inducida por C1q fue disminuida (fig. 4B). Tyr33 fosforilación en WOX1 juega un papel clave en la apoptosis tanto
in vitro
y
in vivo
[27] - [31]. Alteramos Tyr33 a Arg33 en el primer dominio WW [27], [35], y determinamos que C1q no mediar la apoptosis cuando las células expresan esta proteína mutante (Fig. 4C). En las células de control de vector, no se observó apoptosis (Fig. 4D). la muerte celular C1q mediada no se observó en estas células de control después de una incubación más larga durante más de 8 a 24 hr, que es similar a las observaciones anteriormente mencionadas (Fig. 2).
(A) En vivo DU145 células- expresando el
N-terminal de dominio WW
(WOX1ww; EGFP etiqueta) fueron tratados con C1q (1 mg /ml), seguido de registro de los cambios morfológicos por microscopía de lapso de tiempo automático (un cuadro por 10 min). la contracción de la célula y la condensación nuclear se produjeron aproximadamente 100 a 130 min después de la exposición de las células a C1q. (B) Cuando las células se cotransfectaron con WOX1ww y dn-WOX1, la apoptosis inducida por C1q se redujo significativamente. (C) La alteración de Tyr33 a Arg33 en WOX1 no causó la muerte celular mediada por C1q. (D) No se observó apoptosis en células que expresan EGFP solamente tras la exposición a C1q. En comparación con los experimentos anteriores, la concentración de C1q se aumentó para los experimentos de microscopía de lapso de tiempo. Un conjunto de datos representativo se muestra a partir de 5 experimentos. Aproximadamente 100 células fueron examinados al final de la microscopía de lapso de tiempo. Una foto resultante de la fusión de la célula que expresa la imagen de campo claro y fluorescencia verde se muestra (antes de la estimulación con C1q).
El /la apoptosis inducida por WOX1 C1q se confirmó adicionalmente mediante análisis de la fragmentación del ADN internucleosomal usando agarosa electroforesis en gel. Los resultados mostraron la escaleras de ADN escindidos como inducida por C1q en las células DU145 y SH-SY5Y que expresan WOX1 (Fig. 5 y complementario. Fig S4). En las células de control apropiadas que expresan EGFP o nada, C1q no indujo la fragmentación del ADN (Fig. 5 y Fig complementario. S4).
(A) células DU145 se sometieron a electroporación con construcciones de expresión de ADNc de WOX1, dn-WOX1 ( DN), y /o p53. 24 horas más tarde, las células fueron expuestas a C1q para 8 hr. En los controles adecuados, las células se sometieron a electroporación con medio (Sham) o sin electroporación (Cont). No fragmentación del ADN se muestra en estos controles. C1q aumentó la fragmentación del ADN en células que expresan WOX1, pero no p53. C1q suprimida p53 /fragmentación del ADN WOX1-aumentado. dn-WOX1 inhibe la muerte celular causada por p53. (B) La intensidad de la fragmentación del ADN se cuantificó por Photoshop, y un promedio de resultados que se muestran en el gráfico de barras eran de dos experimentos. El control "Sham" (sin tratamiento C1q) es considerado como 0%.
C1q no aumenta p53 mediada por apoptosis
Hemos demostrado que p53 supresor de tumores interacciona físicamente con WOX1 , y ambas proteínas pueden causar apoptosis de manera sinérgica [26], [27], [30]. Es importante destacar que, WOX1 estabiliza p53 y previene su degradación [30]. Se determinó el papel de p53 y WOX1 en la muerte celular regulada por el C1q. Cuando las células DU145 se sobreexpresa transitoriamente con p53, C1q no aumentó significativamente el grado de fragmentación del ADN (Figs. 5A y 5B). En combinación, tanto p53 y WOX1 aumentaron la fragmentación del ADN. Curiosamente, C1q suprimió la fragmentación del ADN en las células p53 /WOX1-expresión. De acuerdo con nuestras observaciones anteriores [27], dn-WOX1 inhibía la fragmentación del ADN mediada por p53 (Fig. 5A y 5B).
WOX1 ectópica induce la formación de microvellosidades agrupado en entre las células DU145 y mejora C1q la formación de agrupaciones
Hemos examinado las alteraciones morfológicas celulares causadas por la expresión ectópica con EGFP o EGFP-WOX1 en las células DU145, más el efecto de C1q. La microscopía de lapso de tiempo mostró que C1q contracción y formación de ampollas en la membrana de las células DU145 y BCC WOX1 que expresan inducida durante el tratamiento durante 2-4 horas o más largo (Fig. 2C y 4A). Cuando las células DU145 se sobreexpresa con EGFP y cultivadas durante la noche, estas células en reposo se adhirieron de plano sobre la superficie de cristal de la cubierta, como se determina por microscopía de fluorescencia de reflexión total interna (TIRF) (Fig. 6A). medidas de formación de imágenes TIRF las proteínas eventos dinámicos en la membrana celular y áreas del citoesqueleto [36], [37]. Curiosamente, transitoriamente sobreexpresa EGFP-WOX1 indujo la formación puntiforme en la superficie celular, y estas punctates, que contiene EGFP-WOX1, principalmente agrupados en entre las células (Fig 6B;. Ver puntas de flecha). En un aumento mayor, estos punctates eran de hecho microvellosidades, que son necesarios para la adhesión focal (Fig. 6C). Notablemente, muchas de estas células que expresan WOX1 adherido sobre la superficie de vidrio cubierta principalmente por microvellosidades pericellular, ya que sus áreas ventrales se separaron de la superficie. Durante el tratamiento de 1 hr, C1q aumentó significativamente la formación de microvellosidades agrupado en entre las células (Fig 6B;. Véase la flecha). Esta acción parece desestabilizar la adhesión celular para encogimiento posterior, formación de ampollas en la membrana y la muerte eventual. De acuerdo con nuestro informe reciente [38], WOX1 se puede asociar con hialuronidasa superficie celular Hyal-2.
(A) Cuando las células DU145 fueron transfectadas con EGFP y cultivadas durante la noche, estas células se adhirieron de plano sobre el cristal de cubierta superficie, como se determinó por microscopía TIRF para la medición de la fluorescencia verde en la membrana celular y las zonas del citoesqueleto (600 aumentos). Epi: epifluorescencia. (B) En contraste, transitoriamente sobreexpresa EGFP-WOX1 indujo la formación de punctates, como aparecido en grupos, en la superficie celular (ver puntas de flecha; 600 aumentos). C1q aumentó significativamente la formación puntiforme, en particular en entre las células (véase la flecha). Los aumentos en el número de puntúa son aproximadamente 3-6 veces. (C) Los punctates agrupados, que son ricos en la expresión de EGFP-WOX1, son de hecho microvellosidades en la superficie celular (600 × ampliación por microscopía y ampliación digital 3x).
C1q se expresa en el archivo y muestras de tejido de próstata es significativamente regulados a la baja en los tejidos y la hiperplasia de la próstata cancerosa
Las observaciones anteriores sugieren que el complemento de suero o derivado de tejido C1q puede inducir la activación WOX1
in vivo
, restringiendo así la progresión cancerosa. Mientras que las alteraciones de origen humano
WWOX
gen ocurren con mayor frecuencia en la próstata y de mama [20], [21], [34], se analizó la expresión de C1q en los tejidos de la próstata de archivos de pacientes post-mortem. Por microscopía de inmunofluorescencia, se determinó que en comparación con tejidos de la próstata de la misma edad, C1q es downregulated significativamente en la hiperplasia prostática benigna (BPH) y el cáncer de próstata (Figs 7A y 7B;. 100 aumentos). En un aumento mayor, C1q se demostró para expresar en las células basales y epiteliales de las muestras de tejido de próstata de archivo, y C1q se colocalized con p-WOX1 en estas células (Fig. 7C).
(A) de próstata tejidos, incluyendo la próstata normal, BPH y cáncer de próstata, se tiñeron con anticuerpo específico contra C1q y luego con anticuerpo fluorescente secundario. Los núcleos se tiñeron con DAPI (100 aumentos). (B) C1q es downregulated significativamente en BPH y cáncer de próstata, en comparación con tejidos de la próstata de la misma edad (
p
& lt; 0,0001, n = 5;
t
prueba de Student). Cuando se utilizó suero no inmune como la fuente para el anticuerpo primario, no se observó señal (datos no mostrados). (C) C1q se expresa en la basal y las células epiteliales de las glándulas normales de la próstata de archivo (400 aumentos). Tanto C1q y p-WOX1 se colocalized en estas células. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se observaron resultados similares con las células de la glándula de archivo de BPH. En comparación con los tejidos normales de la próstata, se aumentó el tiempo de exposición para tomar las imágenes para BPH. Barra de escala, 100 micras.
complemento del suero C1q y C6 son esenciales para apoyar la fosforilación basal de ERK y WOX1 en las células DU145
Hemos investigado si la regulación a la baja de C1q
in vivo
puede reducir la activación de los supresores de tumores
in vitro
, proporcionando de esta manera una mejor supervivencia de las células del cáncer de próstata. células DU145 se cultivaron durante la noche bajo condiciones libres de suero, en presencia de 1% de suero humano normal, o suero humano 1% con el agotamiento de C1q, C6, C7, C8, C9 o. Por Western Blot, se determinó que tanto ΔC1q y sueros ΔC6 no podían apoyar la expresión constitutiva de WOX2 (una isoforma de WOX1) y p-ERK en células DU 145 (Figs. 8A y 8B), lo que sugiere que los componentes de C1q y C6 suero son esenciales para la expresión de estas proteínas. En comparación, el componente C7, C8 y C9 no apoyaron la expresión de WOX2 y p-ERK (Figs. 8A y 8B). La expresión de ERK, WOX1, MEK1, y p53 no se vio afectada significativamente por las condiciones antes mencionadas cultivo (figuras 8A y 8B;. Datos no mostrados) para MEK1.
(A, B) las células DU145 se cultivaron durante la noche bajo condiciones libres de suero (SF), o en 1% suero humano normal (NHS) o NHS empobrecido con C1q (ΔC1q), C6 (ΔC6), C7 (ΔC7), C8 (ΔC8), o C9 (ΔC9). se observó una reducción significativa de la expresión de la isoforma WOX2 en las células DU145 cuando se cultivan en ΔC1q o suero ΔC6 (frente a los controles SF;
p Hotel & lt; 0,001;
t de Student
), mientras que ΔC7, ΔC8, o suero ΔC9 fue menos eficaz. La activación o la fosforilación de ERK (p-ERK) era dependiente de la presencia de C1q o C6 en el suero (SF frente a los controles;
p
& lt; 0,001;
t
prueba de Student). Se muestra un conjunto representativo de datos de 3 experimentos. Los gráficos de barras muestran la media de 3 experimentos. (C) Las células anteriores también se cultivaron en cubreobjetos bajo condiciones idénticas en suero. Por microscopía de inmunofluorescencia, suero sin C1q o C6 no podía soportar la expresión constitutiva de WOX2 (
p Hotel & lt; 0,0001, ya que frente a SF o NHS;
t de Student
). Aproximadamente 200 células fueron cuantificados individualmente bajo microscopía de fluorescencia, y se restó la medida de la fluorescencia (o normalizada) de los controles negativos (células teñidas con el anticuerpo secundario solamente). Los núcleos se tiñeron con DAPI. (D, E) Las mismas células, como se indica en (A), se tiñeron con anticuerpo p-WOX1 y se cuantificó la extensión de la expresión de la proteína. (F) Una vez más, los experimentos idénticos se llevaron a cabo por Western Blot. En condiciones libres de suero (C1q ΔC1q), la activación basal de WOX1 se redujo significativamente (~ 50% de reducción;
p Hotel & lt; 0,001 frente de SF y NHS;
t de Student
; n = 3).
Para confirmar las observaciones antes mencionadas, microscopía de inmunofluorescencia se llevó a cabo. Las células de la experimento anterior se hicieron crecer sobre cubreobjetos de vidrio en condiciones de suero idénticos, a continuación, fija, y se tiñeron con anticuerpos de fluorescencia específicos. Una vez más, se determinó que en ausencia de suero C1q y C6, expresión WOX2 se downregulated significativamente en las células DU145 (Fig. 8C). Además, cuando las células DU145 se cultivaron en suero sin C1q o C6, los niveles de p-WOX1 se redujo significativamente en las células DU145, en comparación con otras condiciones de cultivo, como se determinó por microscopía de inmunofluorescencia (Figs. 8D y 8E). Estas observaciones se confirmaron posteriormente por Western Blot, que reveló regulación a la baja de p-WOX1 bajo condiciones libres de C1q (Fig. 8F). En estas condiciones, p-WOX1 estaba presente principalmente en el citoplasma de las células DU145. No se observó apoptosis en estas células durante 24 h en cultivo, tal como se determina por la morfología de los núcleos teñidos con DAPI.
Complemento C9 agotamiento promueve la acumulación nuclear p53, y hialuronano estimula la exportación nuclear
WOX1 interacciona físicamente con p53 tanto
in vitro en
y
in vivo
, y puede inducir la apoptosis de manera sinérgica [21], [26], [27], [30]. Aunque exógeno C1q no pudo aumentar la apoptosis mediada por p53 (Fig. 5), se examinó el efecto del complemento del suero C1q y C6 en el aumento de los niveles basales de p53 acumulación nuclear o activación. Cuando se cultivaron células DU145 en el suero normal 1% o en el suero sin C1q o C6, la acumulación de p53 en los núcleos se redujo, en comparación con condiciones libres de suero (Fig. 9A y 9C). Sorprendentemente, sin C9 suero, p53 se acumula en los núcleos (Fig. 9B y 9C), lo que sugiere que el complemento del suero C9 es capaz de restringir la activación de p53. En condiciones C9-deficientes, exógeno de alto peso molecular HA induce la exportación nuclear de p53 en el citoplasma (Fig. 9B y 9C). Por el contrario, HA restauró la acumulación nuclear de p53 en condiciones de libre-C6 condiciones (Fig. 9A y 9C).
DU145 células se cultivaron durante la noche en cada suero se indica con el agotamiento de una proteína del complemento específico. localización de p53 en las células se determinó por microscopía de inmunofluorescencia. (A) En ausencia de C6 complemento (suero ΔC6), p53 estaba presente principalmente en el citoplasma. tamaño molecular de alta HA (50 mg /ml) indujo la acumulación nuclear de p53 durante el tratamiento de 1 hr. (B) En ausencia de C9 suero (suero ΔC9), p53 se localizó principalmente en los núcleos, y HA (50 mg /ml) indujo la exportación nuclear en 1 hr. (C) Para determinar la localización nuclear de p53, se contaron aproximadamente 200 células. Se muestra en el gráfico de barras es un promedio de los resultados del formulario dos experimentos. (D) En los controles negativos, las células se tiñeron con anticuerpo secundario solamente Texas Red conjugado. SF, libre de suero; NHS, suero humano normal.
complemento del suero C1q y C6 agotamiento induce la activación de JNK1 constitutiva
Hemos demostrado que JNK1 interacciona físicamente con WOX1, y que la unión se incrementa tras la estimulación de células con luz UV o anisomicina (activador de JNK1)
in vitro
[27]. Curiosamente, dopaminérgicos neurotoxina 1-metil-4-fenil-piridinio (MPP
+) reduce la unión de WOX1 con JNK1 en el cerebro de rata [31]. JNK1 bloques de la función apoptótica de WOX1
in vitro
[27], mientras que el antagonismo funcional
in vivo
es desconocida. JNK1 y isoformas están involucradas en el estrés y las respuestas de apoptosis, proliferación celular, y muchos tipos de enfermedades [39]. Aunque los resultados anteriores demostraron que complemento C1q y C6 apoyaron la activación de WOX1 (Fig. 8), estas proteínas se predice para bloquear la activación de JNK1, y el agotamiento de C1q y C6 a partir de sueros causará la activación de JNK1. En condiciones experimentales similares, cuando se cultivan células DU145 en ΔC1q o ΔC6 suero, se produjo la activación de JNK1 constitutivo, tal como se determina tanto por transferencia Western (Fig. 10A) y microscopía de inmunofluorescencia (Fig. 10B).
(A) DU145 células fueron cultivadas bajo condiciones libres de suero (SF), o en el 1% del NHS, ΔC1q o ΔC6 suero durante 16-24 horas. En ausencia de C1q y C6, la activación de JNK1 espontánea ocurrió (frente a los controles SF;
p Hotel & lt; 0,001;
t de Student
), según se determinó por Western Blot. Un conjunto representativo de datos se muestra de 3 experimentos. (B) Se observaron resultados similares por microscopía de inmunofluorescencia, que muestra la activación de JNK1 significativa o acumulación nuclear bajo suero C1q- y condiciones C6-libres (frente SF;
p
& lt; 0,001; de Student
t
prueba, n = 3). ΔC9 suero no tuvo ningún efecto. Aproximadamente 200 células fueron contadas a partir de cada experimento. (C, D) No hubo activación de STAT3 en células DU145 bajo todas las condiciones indicadas en suero. En condiciones C1q-libres, HA (50 mg /ml) indujo la fosforilación de STAT3 eficazmente en las células durante el tratamiento de 1 hr. Aproximadamente 200 células fueron contadas a partir de cada experimento (n = 3).
A falta de C1q, HA induce la fosforilación de STAT3 en células DU145
activación de STAT3 desempeña un papel crítico en la próstata la invasión de células del cáncer [23] - [25]. HA también participa en la invasión del cáncer, lo que sugiere que el HA activa STAT3 para la promoción de la metástasis del cáncer. Del mismo modo, las células DU145 se cultivaron durante la noche bajo diversas condiciones libres de suero o -Presentar. Estas células fueron entonces expuestos a HA durante 1 hora. No se observó activación de STAT3 usando normal o empobrecido en complementar los sueros (Fig. 10C y 10D). Cabe destacar que, en ausencia de C1q, HA induce la activación de STAT3 en células DU145 (Fig. 10C y 10D), lo que implica que HA puede aumentar la metástasis de células de cáncer de próstata C1q deficientes upregulating fosforilación de STAT3 y la supresión de la activación de p53 y WOX1. Todos los experimentos anteriores se realizaron con HA de grado médico de Lifecore. Se observaron resultados similares usando grado médico Healon (datos no mostrados). Estas preparaciones de HA están libres de contaminación de proteínas.
Discusión
La cascada del complemento en suero humano es considerado tradicionalmente como un sistema inmune humoral poderosa que protege contra los microorganismos invasores. Sin embargo, las propiedades funcionales de cada componente del complemento individual son en gran parte desconocidos. En este estudio, hemos demostrado por primera vez que C1q se expresa en la próstata. Sorprendentemente, la expresión de C1q se reduce significativamente en la hiperplasia prostática benigna y cáncer de próstata.