Extracto
Preclínica modelos que imitan la condición humana son necesarios para responder a las realidades clínicas. pacientes con cáncer de próstata o de mama que hacen frente a las metástasis óseas experimentan dolor intratable, que afecta a su calidad de vida. por lo tanto se requiere una monitorización avanzada para aclarar los mecanismos del dolor del cáncer de hueso y refinar los tratamientos. En nuestro modelo de rata mamaria carcinoma femoral MRMT-1 implantación de las células, el inicio del dolor y el crecimiento del tumor se controlaron durante 21 días. El procedimiento quirúrgico realizado sin artrotomía permitido la grabación del dolor incidental en ratas que se mueven libremente. Junto con el desarrollo gradual de la alodinia y la hiperalgesia mecánica, no se detectaron signos de comportamiento de dolor ambulatoria a los 14 días mediante el uso de un aparato de soporte de peso dinámico. La osteopenia se revela desde el día 14 de forma concomitante con la desorganización de la arquitectura trabecular (μCT). Las metástasis óseas se visualizaron ya en el día 8 por resonancia magnética (T
1-Gd-DTPA) antes de la detección del dolor. PET (Na
18F) co-registro reveló actividad intra-óseo, como se determina por superposición anatómica más de MRI de acuerdo con hiperactividad osteoclástica (tinción TRAP). El dolor y la destrucción ósea se agravaron con el tiempo. El remodelado óseo estuvo acompañado por c-Fos (médula) y ATF3 (DRG) de activación neuronal, sostenida por los astrocitos (GFAP) y microglia reactividad (Iba1) en la médula espinal lumbar. Nuestro modelo animal demuestra la importancia de dolor y tumor de registro simultáneo de progresión y nos permitirá una mejor caracterización de las estrategias terapéuticas en el futuro
Visto:.-Doré Savard L, Otis V, K Belleville, Lemire M, M Archambault , Tremblay L, et al. (2010) Comportamiento, Imágenes Médicas y características histopatológicas de un nuevo modelo de rata de cáncer de hueso, dolor. PLoS ONE 5 (10): e13774. doi: 10.1371 /journal.pone.0013774
Editor: Pedro R. Lowenstein, el Centro Médico Cedars-Sinai y la Universidad de California en Los Angeles, Estados Unidos de América
Recibido: 5. Febrero 2010 ; Aceptado: 11 Octubre 2010; Publicado: 29 de octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Doré-Savard et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado por becas de la Sociedad de investigación del cáncer (PS) y de la CIHR /Rx & amp; programa de investigación colaborativa D en colaboración con la Sociedad canadiense del Dolor, AstraZeneca Inc., CIHR Instituto de Envejecimiento, CIHR Instituto de Trastornos musculoesqueléticos Salud y Artritis, CIHR Instituto de Neurociencias, Salud Mental y Adicción (PS) y la Red de Bio-Imaging Quebec. L.D.-S. sostiene CIHR Frederick Banting y Charles Best, FRSQ, la artritis y la Red Canadiense becas RSBO. PD CIHR es un investigador nuevo. L.G. es un FRSQ junior 1- nuevo investigador. P. S., M. L., L.G. R. L. y son miembros de la FRSQ financiado por el Centro de Investigación Clínica-Etienne Le Bel. PD y L.G son miembros de la Red de Investigación de Quebec Dolor, M. L. R. L. y son miembros de la Red de Bio-Imaging Quebec. M. L. es la Cátedra de Investigación en Imagen por Resonancia Magnética. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Astra-Zeneca Inc. proporcionó fondos a través de un programa de la Sociedad Canadiense del Dolor. Los experimentos no implican ningún producto de Astra-Zeneca o compuesto ni tampoco Astra-Zeneca juegan un papel en la elección de los premiados. Ninguno de los autores son empleados o propietarios de Astra-Zeneca. En consecuencia, esta fuente de financiación comercial no altera la adhesión de los autores a todos PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales que se detallan en Internet por la guía para los autores.
Introducción
Entre los cánceres con un mal pronóstico , los procedentes de mama, pulmón y próstata comúnmente metástasis en el esqueleto [1], [2]. Mientras que los cánceres óseos primarios son poco frecuentes, más del 70% de las personas hacer frente al cáncer de mama o de próstata avanzado desarrollará metástasis óseas [3]. El principal factor responsable de la disminución de la calidad de vida en metástasis óseas de soporte de pacientes es el dolor [4].
dolor del cáncer de hueso origina a partir de la compresión del nervio, isquemia y liberación de sustancias proinflamatorias por el tumor y las células de la hueso medio ambiente [5]. Por lo tanto, las células cancerosas líticas afectan a la homeostasis del hueso a través de la liberación de citoquinas que promueven la reabsorción patológica por los osteoclastos [6], [7]. Además de la destrucción ósea [8], la hiperactividad de los osteoclastos crea un ambiente ácido responsable para el alojamiento de dolor [9]. Compensativo y la formación de hueso por los osteoblastos anárquica comprime las terminaciones nerviosas libres terminales dispersos en la médula ósea, la matriz y el periostio [10], lo que lleva a la génesis y el mantenimiento de dolor. La asociación de estos fenómenos produce un inicio mecánica y neuroquímico único que va más allá de la combinación de dolor neuropático e inflamatorio [11].
características únicas del dolor del cáncer de hueso que sea terapéuticamente intratable [11]. eficiencia alivio De hecho, los enfoques típicos incluidos los medicamentos anti-inflamatorios y opiáceos han limitado [12]. Debido a su naturaleza progresiva, se requieren dosis crecientes para aliviar adecuadamente el dolor del cáncer de hueso [13], dando lugar a los efectos secundarios y en última instancia al cumplimiento abortiva [4], [14]. Por otra parte, la morfina se demostró recientemente para acelerar la pérdida ósea inducida por el cáncer en los cánceres osteolíticas [15], [16]. Del mismo modo, las terapias con bisfosfonatos antirresortivos prometedores [17], [18], [19], [20], [21], demostrado retrasar la progresión del cáncer e indirectamente aliviar el dolor, fueron la sombra de la osteonecrosis comorbilidad [22]. por lo tanto el dolor del cáncer óseo sigue siendo una preocupación, destacando la necesidad de acentuar nuestra comprensión de sus mecanismos neurobiológicos con el fin de desarrollar estrategias más efectivas.
Los modelos animales se elaboraron para imitar la condición humana en un intento de comprender el dolor del cáncer óseo . Los modelos de ratón de cáncer de calcáneo y el húmero [23], o los modelos de rata de cáncer de mama con la tibia MRMT-1 [24], 4T.1 [25] y Walker 256 [26], o de próstata AT-3.1 se desarrollaron [27] las células para caracterizar los cambios locales o plasticidad neural de las estructuras de la columna vertebral que se proyectan hacia el hueso. Desde un punto de vista clínico, el fémur, sin embargo, representa el hueso largo afectadas con más frecuencia [28]. se reportan los modelos de ratón que implican la implantación femoral intramedular de líneas celulares de cáncer de fibroblastos para inducir el dolor (por ejemplo fibrosarcoma [29], [30]). Sin embargo, estos modelos se basan en imitando cánceres óseos primarios. La mayoría de los cánceres óseos secundarios se originan a partir de los cánceres de mama o de próstata, conocidos por sus propiedades de hueso metástasis [31]. Sin embargo, para los modelos que implican estos tipos de células, la inducción es ya sea por vía intravenosa (que conduce a múltiples metástasis sitio [32], [33]) o sigue un procedimiento quirúrgico en el que un arthrotomia rotuliano y la alteración parcial de la articulación de la rodilla son susceptibles a la locomoción deteriorado , que a su vez empuja la evaluación de la conducta relacionada con el dolor. De hecho, la invasividad y procedimientos quirúrgicos necesitan permanecer mínimo con el fin de evaluar el dolor irruptivo sin interferencias. Esta última manifestación del dolor es la condición más refractarios a superar para individuos que se enfrentan con el dolor crónico oncológico y entre los más difíciles de evaluar en modelos animales.
Además de la evaluación del dolor, los medios para detectar y vigilar las patologías óseas han evolucionado incorporar de rayos X tomodensitometría micro-computarizada (μCT) y la gammagrafía ósea [34]. No obstante, la determinación preventiva de anidación y progresión del tumor tiene el potencial de mejorar posologías analgésicos y limitar la remodelación ósea. Avanzada no invasiva y de imágenes médicas radiación de baja, como la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (MRI) o la combinación de ambos, sería deseable permitir que los exámenes eficientes y repetidos para los ajustes terapia analgésica precisos y rigurosos [35] .
La rata sigue siendo las especies más estudiadas en los paradigmas del dolor [36]. Por lo tanto, se seleccionó una línea celular de carcinoma mamario de rata por sus propiedades hacen metástasis espontánea y trasplantables. La capacidad de MRMT-1 a la metástasis a órganos distantes es intrínseco a las células singénicas [37]. En el presente estudio, se describe una intervención en el fémur de ratas Sprague-Dawley, para implantar las células tumorales de mama utilizando un procedimiento quirúrgico luz en un esfuerzo por imitar el dolor clínico. Hemos utilizado una combinación de enfoques innovadores de formación de imágenes de comportamiento y médica, apoyado por observaciones de inmunohistoquímica y patológicos, para caracterizar el modelo. El estudio tiene como objetivo mejorar la relevancia clínica en relación con el modelo y las herramientas utilizadas para cribar nuevos compuestos de plomo, con el fin de caracterizar la progresión tumoral ósea, así como para dilucidar los mecanismos subyacentes a la génesis y el mantenimiento del dolor del cáncer óseo.
Métodos
cultivo de células
metástasis del tumor mamario de rata (MRMT-1) células (carcinoma) fueron amablemente proporcionados por el Centro de recursos para la célula Instituto de Investigación Biomédica de Desarrollo, Envejecimiento y cáncer (Universidad de Tohoku 4-1, Seiryo, Aoba-ku, Sendai, Japón) y se recogieron en medio RPMI 1640 (Gibco, Montreal, Quebec, Canada) suplementado con 10% de suero bovino fetal (inactivado por calor) y 2% de penicilina /estreptavidina (Gibco, Montreal, QC, Canadá). Las células fueron separadas por una breve exposición a 0,25% w /v de tripsina-EDTA (Gibco, Montreal, QC, Canadá) y se prepararon para preparaciones inyectables. Brevemente, las células se sedimentaron por centrifugación, se enjuagó con 1 ml de solución salina equilibrada de Hank exenta de calcio, magnesio o fenol (HBSS; Gibco, Montreal, QC, Canadá) (3 min a 200 x g.) Y además se centrifuga en el mismo condiciones. El sedimento se resuspendió en 1 ml de HBSS, y las células se contaron con un hemocitómetro. Las células se diluyeron para conseguir una concentración final para la inyección de 30.000 células en 20 l y se mantienen en hielo antes de la cirugía
Animales
ratas macho adultas Sprague-Dawley (200-225 g;. Charles river Laboratories, St.-Constant, Quebec, Canadá) se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz /oscuridad, con acceso a comida y agua
ad libitum
. procedimientos relacionados con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal Care y de la Université de Sherbrooke y llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones del Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA). Las ratas se aclimataron durante 4 días a las instalaciones de animales y durante 2 días a las manipulaciones y los dispositivos antes de los estudios de comportamiento. Tenga en cuenta que los animales analizados para el dolor y usados para los análisis inmunohistoquímicos fueron diferentes de los que están siendo fotografiada por resonancia magnética o MRI-PET, ya que la anestesia prolongada puede afectar a las respuestas de comportamiento.
Cirugía
Después de la anestesia completa con 5 % de isoflurano (Abbott Laboratories, Montreal, QC, Canadá), las ratas se colocaron en posición supina y sus patas derecha se afeita y se desinfecta con 70% v /v de etanol. La anestesia se mantuvo con 2,5% de isoflurano y los ojos de rata se protegieron con un gel líquido oftálmica (Tear-gel, Novartis, Mississauga, ON). Una incisión de la piel mínima (8-10 mm) expone los
cuádriceps femoral
. El
vasto lateral
es una incisión (5-8 mm de largo) para exponer el epicóndilo femoral, mientras que el ligamento rotuliano se mantuvo intacta y el mínimo daño fue infligido a los músculos y los vasos sanguíneos circundantes. El uso de un taladro de 0,8 A estereotáxica (Foredom, Bethel, CT, EE.UU.) conectado a una fresa de 1,75 mm de acero de carburo (Stoelting Co., Wooddale, IL, EE.UU.), una cavidad pequeña y superficial fue con rebabas entre el epicóndilo medial y el tubérculo del aductor (aproximadamente 1 mm de profundidad). En esa cavidad, una aguja de calibre 25 se inserta en un ángulo de 45 °, lo que permite que alcance el canal intramedular del fémur. La aguja fue sustituido con un extremo romo de la aguja de calibre 25 conectada a un 50 l Hamilton jeringa que contiene 20 l de la suspensión de células (grupo de cáncer) o de HBSS (grupo de tratamiento simulado). La jeringa se deja en su lugar durante 1 minuto para permitir la dispersión de células en la médula ósea. La aguja se retiró después y la cavidad se sella con amalgama dental (Prodigy A3, Kerr, Orange, CA) y se polimeriza con una lámpara de polimerización (QHL75, Dentsply, Milford, DE). El sitio se lavó a fondo con agua desionizada estéril. El músculo y el tejido conjuntivo se cerraron con una sutura discontinua hecho con suturas sintéticas absorbibles (Monocryl, Ethicon, Sommerville, NJ), y la piel se cerró con una sutura continua de sutura quirúrgica no absorbible (Prolene, Ethicon, Sommerville, NJ ). La herida se lavó finalmente con 3% de peróxido v /v y se rocía con una solución amarga (salud Aventix animal, Flamborough, ON).
Los estudios de comportamiento
La alodinia mecánica
se evaluó utilizando un estesiómetro plantar dinámica (Ugo Basile, Stoelting, IL, EE.UU.), una versión automatizada del pelo de von Frey. Los animales fueron colocados en recintos sobre una malla de alambre elevada y las respuestas a la estimulación mecánica puntiforme se evaluaron utilizando el estesiómetro. Un filamento de metal recta (0,5 mm de diámetro) se orientó por debajo de la almohadilla hasta que tocó la superficie plantar de la pata trasera y comenzó a ejercer una fuerza hacia arriba. La fuerza requerida para provocar una respuesta de retirada se midió en gramos y registrado automáticamente cuando la pata se retira o se alcanzó el punto de corte predeterminado (50 g). Cinco valores se tomaron alternativamente sobre las dos patas traseras ipsilaterales (lado operado) y contralateral a intervalos de 15 s.
mecánicas retirada respuestas nociceptivas
se midieron utilizando un analgesiameter (Ugo Basile, Stoelting, IL , EE.UU.) que se aplica una presión linealmente creciente (16 g /s) a través de un lápiz acrílico. El lápiz se colocó sobre el dorso medial de la pata trasera, entre el 1º y 2º articulaciones tarso y la media de cuatro medidas consecutivas que comienzan con la pata trasera izquierda o derecha, alternativamente, se registró como el umbral de retirada en gramos. El punto de corte se estableció en 200 g. Comparación para cada día de la prueba se realizó restando el peso ipsilateral (g) a partir del valor de peso contralateral (g) para determinar el umbral de retirada de la pata diferencia (PWT).
peso estático teniendo
era medido utilizando el medidor de Incapacitance (CITI Ciencias de la vida, Woodland Hills, CA, EE.UU.). El animal fue colocado con las extremidades traseras en descanso en las dos almohadillas de plataforma peso de promedio. La unidad registró el peso medio de poner en cada almohadilla durante un periodo de 2 s. La medición se repitió 3 veces. Los resultados obtenidos con el metro incapacitance se utilizaron como un control para una segunda prueba con carga de peso, la prueba de rodamientos dinámicos Peso (Bioseb, Boulogne, Francia). El dispositivo consistía en una caja de plexiglás sin fondo (25 × 25 × 24 cm
3) y un sensor (1936 captores individuales). El sensor se coloca en el suelo del recinto, cubriendo toda su superficie. La rata se le permitió moverse libremente dentro del aparato durante 5 minutos y la información de soporte de peso fue transmitido en vivo a un ordenador portátil a través de una interfaz USB. Los datos en bruto se analizaron con el software DWB 1.1.0.6 (Bioseb). Una pata se detecta cuando un captor registró un peso de al menos 4 g y un mínimo de 2 captores adyacentes grabado un peso de al menos 1 g. La pata tenía que ser estable durante un mínimo de 0,5 s para ser incluidos. El uso de un sincronizado de grabación de vídeo de la prueba y el mapa a escala de las zonas detectadas, cada presunto pata fue validado por un observador y se identificó como un izquierda o derecha y delantera o la pata trasera. Otras zonas detectadas, lo que representa la cola u otra parte del cuerpo, también se incluyeron en el análisis.
El efecto de la morfina subcutánea
se evaluó en los días 11, 14, 18 y 21 en nuestro modelo . La morfina-sulfato de solución madre (50 mg /ml) se diluyó en solución salina estéril para lograr la concentración de inyección (3 mg /ml). Las ratas se inyectaron s.c. de con 3 mg /kg (1 l /g) y devueltos a su jaula. Pruebas de comportamiento Se llevaron a cabo 30 minutos después de la inyección como se describe anteriormente.
Inmunohistoquímica
Las ratas fueron profundamente anestesiados con 5% de isoflurano y transcardially perfundieron con 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón fosfato (0,1 M , pH 7,4). La médula espinal y ganglios de la raíz dorsal (DRG) fueron post-fija durante 30 minutos en 4% de paraformaldehído y luego se transfirieron a sacarosa al 30% (48 h) para crioprotección. secciones de cuerda en serie congeladas espinales, 35 m de espesor, se cortaron usando un micrótomo de deslizamiento, recogidos en PBS y se procesó como secciones de libre flotación. Frozen DRG fueron incorporados en OCT Tissue-Tek, cortado en un criostato con un espesor de 12 micras, recogido y tratado en las diapositivas.
Las secciones de tejido se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente en una solución de bloqueo de 5% suero normal de cabra en PBS con 0,5% de Triton X-100 y 2% de albúmina y después se incubaron durante 30 min en una solución 0,1 M de glicina para reducir la autofluorescencia. Las secciones fueron incubadas con el antisuero primario durante la noche a 4 ° C. secciones de la médula espinal se immunostained con anticuerpos contra los marcadores de la microglia, unión de calcio ionizado adaptador molécula 1 (Iba1, anticuerpo policlonal de conejo anti-Iba1, 1:1000, Wako, Richmond, VA, EE.UU.), astrocitos, proteína ácida glial fibrilar (GFAP, monoclonal clon GA5 ratón anti-GFAP, 1:500, Sigma, Oakville, Ontario, Canadá) y la proteína c-Fos (c-Fos, conejo policlonal anti-Fos, 1:20 000, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.) y en el GRD contra el factor activador de la transcripción 3 (ATF-3 (C-19), policlonal de conejo anti-ATF-3, 1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.). Después de la incubación, las secciones de tejido se lavaron dos veces durante 10 min en PBS y se incubaron en la solución de anticuerpo secundario durante 2 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios conjugados con marcadores fluorescentes Alexa Fluor ® 488 y Alexa Fluor 647® se utilizaron a 1:500 (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Las secciones fueron montadas entonces con Aquamount. La ausencia de reactividad cruzada entre los anticuerpos secundarios se verificó omitiendo el anticuerpo primario durante la incubación durante la noche.
proteínas Fos y el factor de ATF-3 fueron también detectadas por inmunohistoquímica, usando el método de avidina-biotina-peroxidasa. Las diapositivas DRG y secciones de la médula espinal se trataron con peróxido de hidrógeno 0,5% durante 30 min para inhibir la actividad de peroxidasa endógena y se incubaron durante 30 min en una solución de bloqueo de 5% de suero normal de cabra, 2% de albúmina, y 0,5% de Triton X-100 en PBS. Las secciones se incubaron a continuación durante la noche a 4 ° C en el anticuerpos ATF-3 (DRG) primaria c-Fos (médula espinal) y, que se diluyeron en 1% NGS con 0,1% Triton X-100. Después de la incubación, las secciones se lavaron y se bloquearon con 3% NGS para 15 min y se incubaron durante 2 h en el anticuerpo secundario, IgG de cabra biotinilado anti-conejo (de cabra anti-conejo de H + L, 1:500, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.), seguido de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante con el método de avidina-biotina durante 1 h (peroxidasa de rábano picante estreptavidina, PK-6100, vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) a temperatura ambiente. Las secciones fueron incubadas durante 3 minutos con 0,02% de diaminobencidina con 0,01% de peróxido de hidrógeno, después se deshidrata y se cubrieron con Permount® medio de montaje (SP15-500, Fisher Scientific, Nueva York, EE.UU.).
Cuantificación
el uso de un microscopio Olympus Imagen confocal y el software Olympus Fluoview FV1000, las secciones de la médula espinal lumbar fueron tomadas con idénticos parámetros de adquisición (ganancia, tiempo de exposición) y se analizaron por microscopía confocal para caracterizar inmunofluorescencia (IF). Epifluorescencia y de campo brillante imágenes fueron tomadas por un microscopio Leica DM4000 equipado con una Leica y una cámara DFC350FX InfinityX para inmunofluorescencia.
núcleos Fos-inmunorreactivas se contaron al tener pequeña, redondeada u ovoide, manchas oscuras, en comparación al control. delimitación láminas se realizó con un cable de médula plantilla histo-arquitectura de rata [38], de conformidad con el segmento lumbar L1 /L2 /L3 de la sección. En el presente estudio, las células c-Fos-inmunorreactivas se contaron como láminas combinado I-II, III-IV, V-VI y VII-VIII, respectivamente. Ocho de 35 micras secciones de la médula espinal sobre el segmento L1 /L2 /L3 de cada animal (n = 3) fueron elegidos al azar por animal por condición para determinar el número total de c-Fos.
La cuantificación de ATF-3 neuronas positivas en DRG secciones 12-m de espesor se llevó a cabo mediante el recuento del número de neuronas con ATF-3 núcleos inmunorreactivos de 20 aumentos, usando un microscopio Leica DFC350FX. GRD correspondientes a los niveles de la médula espinal lumbar L1 /L2 /L3 fueron seleccionados como los principales sitios de proyección de las fibras aferentes primarias que inervan el fémur [39], [40]. El recuento de ATF-3 células positivas se realizó una vez en tres series, cada 36 micras. Este recuento se expresó como número medio de ATF-3 inmunorreactiva células por sección (n = 24). Sham y el cáncer de animales a partir de 3 experimentos independientes se utilizaron para ATF-3 determinación.
tinción Glial para GFAP y Iba-1 en la médula espinal L1 /L2 /L3 se analizó cuantitativamente por densidad óptica con la versión software Image J 1.6. Image J se calibró primero con una imagen de un animal de control usando la función de calibración. Los ajustes fueron luego conservados para todos los análisis posteriores. Tres secciones seleccionadas al azar de la médula espinal L1-L3 en cada animal (n = 3) fueron analizados. Las densidades ópticas de nueve secciones (tres secciones /animal) fueron promediados para proporcionar un número promedio para cada condición.
El análisis radiográfico
Las radiografías se realizaron en los huesos disecados utilizando un Faxitron MX-20 ( faxitron, Lincolnshire, IL). Fotos fueron tomadas a 26 kV, tiempo de exposición: 10 s; aumento: 2X. La tomografía computarizada micro-análisis se realizaron en las extremidades diseccionados de ratas ensayadas con un sistema microTC 1072 (SkyScan, Kontich, Bélgica). Los parámetros fueron: fuente: 80 kV, 124 mu; Zoom: 20X; tamaño de píxel: 14,06 m; tiempo de exposición: 3,0 s; rotación: 0,9 °. Bone volumen /volumen total (BV /TV) determinación: el volumen de hueso cortical + trabecular (BV) dividido por cualquier tipo de tejido (TV) en el intervalo de 5,626 mm correspondiente a 201 secciones transversales (volumen de interés; VOI), a partir de la placa de crecimiento del fémur distal. Trabecular BV /TV se define por el volumen trabecular del hueso dividido por el televisor de la VOI. Los análisis se realizaron con el Analizador de CT 1.10.0.1 (SkyScan, Kontich, Bélgica).
Imagen de Resonancia Magnética y Tomografía por Emisión de Positrones
estudios de resonancia magnética se llevaron a cabo en el
Centre d'imagerie moléculaire de Sherbrooke
con un pequeño animal escáner 7T 210 mm (Varian Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.) y un volumen de bobina de RF 63 mm. ratas Sprague-Dawley fueron colocados en la posición supina en una cuna con capacidad para un MRI equipado con un soporte de construcción casera pata diseñada para posicionar ambas extremidades de forma estable y reproducible. Los animales fueron anestesiados con 3% (inducción) y 1,5% de isoflurano (estabilización) en oxígeno. Un animal de sistema de calefacción de aire caliente retroalimentación controlada se utiliza para mantener la temperatura corporal del animal a niveles fisiológicos y la tasa de respiración se monitorizó continuamente (SA Instruments Inc., Stony Brook, Nueva York, EE.UU.). El protocolo de RM incluye la adquisición de axial (sagital) pre-contraste y 10 minutos después de contraste
T
1 potenciadas en imágenes, utilizando una secuencia eco de gradiente con TR: 210 ms, TE: 3.35 ms , ángulo de inclinación: 30 °, matriz: 256 × 256, FOV: 60 × 60 mm
2, NA: 8 (30 sagital), 1,5 mm de espesor. Un bolo de 600 l de medio de contraste (Gd-DTPA, Magnevist, Berlex) se inyectó en la vena de la cola. Animales Se obtuvieron imágenes antes y 6, 8, 10, 13, 15 y 18 días después de la implantación. Para evaluar la invasividad del tumor, una región de interés (ROI), incluyendo toda la corteza del hueso y el canal medular del fémur, se definió. Este retorno de la inversión se obtuvo un histograma voxel intensidad de ambas patas traseras. Las intensidades máximas de voxel contralateral se utilizan para fijar el umbral patológico. Cada voxel ipsilateral restante era de color en función de su intensidad con una escala de color amarillo-rojo. Mathlab versión 7.1 (Mathworks Inc., Natick, Massachusetts, EE.UU.) se utilizó para analizar los datos y realizar los cálculos.
La tomografía por emisión de positrones se realizó utilizando el LabPET4 Sherbrooke con núcleo de control de temperatura. Diámetro del anillo: 162 mm; FOV: 37,5 mm; Cristales: 3072; Resolución espacial: 1,35 mm FWHM campo de visión; los recuentos de ruido equivalente: 37 KCP a 245 MBq (250-650 keV). Inmediatamente después de la resonancia magnética, los animales se mantuvieron bajo anestesia en la misma posición y la cuna se transfirió al escáner PET. El colimador se alineó a las articulaciones de la rodilla traseras; 9,25 MBq de Na
18F se inyectó por vía i.v. (200 l a 500 l /min). La distribución del radiotrazador se monitorizó durante 30 min y toma de muestras de doble volumen se realizó durante 30 min. La respiración y la temperatura corporal del animal fueron controlados en todo momento durante el procedimiento.
El análisis histológico y la medición de la actividad de los osteoclastos
Veintiún días después de la inyección del tumor, las ratas se sacrificaron y se extrajeron los fémures . Fémures fueron fijadas en paraformaldehído al 4% durante 72 horas, descalcificadas en 10% de EDTA (pH 7,4) durante 2-3 semanas, y finalmente embebidos en parafina. Los bloques de parafina se cortaron en secciones de 3 ó 5 micras de espesor con un micrótomo equipado con una cuchilla de carburo y las rodajas se tiñeron con hematoxilina y eosina de Harris para determinar la infiltración de células cancerosas y la destrucción ósea. Para identificar los osteoclastos activados, se realizó fosfato ácido de (TRAP) tinción resistente al tartrato. El uso de los leucocitos (TRAP) Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos), las rodajas se expusieron al sustrato durante 1 hora y la tinción se visualizó con un Leica DM4000B (Leica, Toronto, ON, Canadá). En total, 3,5 campos se contaron con un aumento de 250X para una superficie total de 1 mm
2. osteoclastos marcadas se contaron a lo largo del hueso mineralizado tumor o las interfaces de médula ósea de hueso y se analizaron 4-7 rebanadas para cada animal, a partir de grupos de 4 animales.
análisis estadísticos
Von Frey DWB y datos se analizaron mediante un ANOVA de dos vías seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni y Randall-Sellitto se analizó con el de Student
t-test
para la comparación de las patas traseras y contradicciones ipsilaterales para cada día. Se determinaron c-Fos, ATF-3 y Iba1 /GFAP contar las diferencias con un ANOVA de medidas repetidas seguido por una prueba de comparación múltiple de Bonferroni. La normalidad se evaluó con las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilks. gráficos BV /TV se analizaron con un ANOVA de una vía y los recuentos de trampa con la prueba t de Student. P £ 0,05 fue considerado como el nivel de significación estadística.
Resultados
La implantación de células de carcinoma de mama en el fémur induce al tacto y el dolor evocado ambulatoria
En el intento de imitan el dolor del cáncer óseo clínica, se realizó una inyección local de las células directamente en el fémur entre el epicóndilo medial y el tubérculo del aductor. El impacto de la cirugía se minimizó mediante la implantación en este sitio anatómico, lo que reduce las posibilidades de ligamento rotuliano o daño en las articulaciones. En consecuencia, según la evaluación de von Frey y el peso dinámico cojinete (DWB), animales de simulación no mostraron signos de la alodinia mecánica o deterioro locomoción durante todo el período de prueba de comportamiento (Figs. 1A, C), incluso en los primeros días después del procedimiento quirúrgico (no datos mostrado). ratas macho portadores de cáncer inoculados con 30.000 células MRMT-1 muestran un umbral de retirada de la disminución en la dinámica de prueba de von Frey de día 14 (36,7 ± 2,0 g; p & lt; 0.05; Fig. 1A). Después de eso, la alodinia progresó rápidamente hasta el día 21, cuando era máxima (23,3 ± 1,5 g, p & lt; 0,001). Las células de cáncer inoculados en la pata trasera derecha no provocan la alodinia mecánica en el lado contralateral (Fig. 1A). De forma concomitante a la alodinia, hiperalgesia mecánica desarrollada progresivamente en ratas portadoras de tumor. Como medida con la prueba de Randall-Selitto, se observó una diferencia significativa entre los umbrales de retirada de la pata ipsilateral y contralateral del día 18 (30,9 ± 10,8 g, p & lt; 0,001) a día 21 (25,7 ± 7,6 g, p & lt; 0.01; Fig 1B. ). Estos resultados demuestran que medibles tacto evocado comportamientos de dolor se desarrollan después de la inyección de células de carcinoma en el fémur, como se ha demostrado previamente con MRMT-1 implantación de células en la tibia [24]. Después de la detección del dolor en día 14, la administración subcutánea de morfina (3 mg /kg) no invirtió la alodinia mecánica inducida por la progresión del tumor en ratas portadores de cáncer (Figura S1).
(A) La alodinia se determinó utilizando el von Frey prueba después de la implantación del tumor. El umbral de retirada disminuye progresivamente a partir de 11 días en respuesta a la nocicepción alojamiento en los animales portadores de cáncer (n = 10). La pata contralateral no se ve afectado, al igual que el miembro ipsilateral simulada tratados (n = 10). (B) Evaluación de la hiperalgesia se realizó mediante la prueba de Randall-Sellitto. Los resultados se expresan como la diferencia umbral de retirada de la pata (PWT) entre las patas traseras ipsi y contra-lateral. se observó hiperalgesia Significativo al día 18 y 21 (n = 10). (C) Cuantificación de dinámica de soporte de peso en los animales implantados, expresado como un porcentaje del peso del animal. Una diferencia significativa en la distribución de peso en cada pata es observable a partir de día 15. (D) Análisis dinámico de la superficie de contacto entre la pata trasera y el sensor presenta resultados similares en el día 15, 18 y 21 cuando las patas ipsi y contralateral son comparación en grupos de cáncer (n = 7 en cada grupo). Los datos son la media ± E.E.M, *: p = 0.05; **: P≤0.01 ***:. P≤0.001
molestias extremidad se evaluó por primera vez por carga de peso estática. De día 15, la mitad del peso ipsilateral se redistribuyó a la pata contralateral (datos no mostrados). Con el fin de evaluar una redistribución de peso representativo a través de todo el cuerpo del animal, sin restricción, hemos realizado evaluaciones DWB. La cinética de la transferencia a las patas traseras fueron similares a los observados en cojinete estático, comenzando alrededor de 12 días y el aumento de hasta 21 días (Fig. 1C). Sin embargo, es de destacar que la compensación de peso se hizo principalmente en partes del cuerpo distintas de la pata trasera contralateral, tales como la cola, el abdomen o patas delanteras inferior. De hecho, en el día 21, aproximadamente el 50% del peso fue llevado en otra parte de las patas traseras, en comparación con 33% antes de la aparición del dolor (datos no mostrados). De acuerdo con ello, la superficie de la pata en contacto con el suelo también se vio afectada significativamente de día 15, en comparación con la pata contralateral (Fig. 1D). Estos comportamientos de dolor reflejan la observación clínica del dolor irruptivo, que se experimenta después del movimiento de las extremidades portadores de tumores en pacientes con cáncer de hueso.
neuronal y plasticidad glial en animales portadores de cáncer
proliferación Metástasis en el fémur de ratas induce la activación neuronal y glial cambios a lo largo de las fibras aferentes que se proyectan hacia L1-L3 segmentos de la columna lumbar. Agradecemos a los Dres.