Extracto
se describe un nuevo enfoque de la patología y bioinformática translacional, gen Firma Buscador Algoritmo (NGAA) para identificar biomarcadores asociados con la supervivencia del cáncer colorrectal (CCR). Aquí un sólido conjunto de marcadores de CRC se selecciona mediante un método de conjunto. Mediante el uso de un conjunto de datos de 232 perfiles de expresión génica, NGAA descubre 16 pequeñas firmas de genes altamente significativos. Análisis de dicotomías generados por las firmas se traduce en un conjunto de 133 muestras de forma estable clasificadas en grupo de buen pronóstico y 56 muestras en grupo pobre pronóstico, mientras que 43 siguen siendo poco fiable clasificado.
AKAP12
,
DCBLD2
,
NT5E
y
¿Cuáles son SPON1 representado particularmente en las firmas y seleccionados para la validación
in vivo en
dos pacientes cohortes independientes que comprenden 140 tejidos tumorales y 60 tejidos normales emparejados. Su expresión y programas de regulación se investigan
in vitro
. Se demuestra que la expresión unida de
NT5E
y
DCBLD2
robusta estratifica nuestros pacientes en dos grupos (uno de los cuales con un 100% de supervivencia a los cinco años). Se demuestra que
NT5E
es un objetivo de la TNF-α señalización
in vitro
; el supresor de tumores PPAR actúa como una novela
NT5E
antagonista que regula positivamente y de forma concomitante
DCBLD2
de una manera dependiente del contexto celular de cáncer de
Visto:. Pagnotta SM, Laudanna C , Pancione M, Sabatino L, Votino C, Remo A, et al. (2013) Gene Conjunto de Firmas Identifica nuevos biomarcadores en el cáncer colorrectal activan a través de PPAR? Y TNF señalización. PLoS ONE 8 (8): e72638. doi: 10.1371 /journal.pone.0072638
Editor: Anthony W.I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 18 de abril de 2013; Aceptado: 11 Julio 2013; Publicado: 19 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Pagnotta et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministero della Ricerca e dell'Università en virtud de concesión (PRIN2008-20085CH22F) y por la Associazione Italiana per la Lotta ai linfomi e leucémie. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las neoplasias más comunes en todo el mundo y una causa frecuente de morbilidad y mortalidad. CRC supervivencia está estrechamente relacionada con el estadio clínico y patológico de la enfermedad al momento del diagnóstico; más de un tercio de los pacientes con CCR mueren dentro de cinco años desde el diagnóstico inicial y la mayoría de desenlaces fatales como resultado de metástasis hepáticas [1].
A pesar de la reciente introducción de agentes terapéuticos más eficaces, sólo hay unos biomarcadores pronósticos validados para evaluar la agresividad de la enfermedad y la probabilidad de recurrencia o muerte después de la cirugía. Estudios recientes proponen pequeñas firmas genéticas como señas de identidad de la etapa del tumor [1,2]. Hasta la fecha los estudios de integración descubrieron amplificaciones de
ErbB2
y
IGF2 Opiniones y genes mutados de manera significativa en el CCR como
APC, TP53, SMAD4, PIK3CA
y
KRAS
como potenciales dianas terapéuticas [3]. Por lo tanto, la identificación de marcadores predictivos y pronósticos precisos combinados con la creciente arsenal de agentes terapéuticos proporcionará tratamientos más eficaces relacionadas con el Perfil minimizan los efectos tóxicos que amenazan la vida del paciente moleculares [4].
Hemos desarrollado un nuevo enfoque computacional , gen Firma Buscador Algoritmo (NGAA) para generar varios pequeños conjuntos de genes, que estratifican los pacientes en términos de supervivencia. Nuestra estrategia hace uso de la disponibilidad de grandes conjuntos de datos de expresión génica para seleccionar candidatos que pueden ser validados en las bibliotecas independientes de los tejidos. Nos acercamos al problema de la extracción de características adecuadas a partir de la expresión génica global que mejor se correlacionan con la información clínica para crear firmas de pronóstico. La mayoría de los procedimientos actuales se basan en el conocimiento experto para seleccionar, entre los miles de genes, marcadores moleculares que pueden estar asociados con el pronóstico [5]. Recientemente, nuevos métodos, basados en la minería de datos, aprendizaje automático [6] y [7] para "Firma de aprendizaje '' se han propuesto regresión estadística. Este es un tema interesante en Biología Computacional y puede ser modelado como un problema de la selección óptima función [8]. A continuación, se adoptó como criterio de optimalidad la significación de la prueba de log-rank entre las curvas de supervivencia de los grupos inducidos por las características seleccionadas y utilizamos un procedimiento novedoso que integra varias firmas generadas mediante un algoritmo codicioso básica. firma genes se clasifican sobre la base de algunas métricas de puntuación que miden la contribución del gen a las firmas que pertenece.
A partir de un conjunto de datos pública de doscientos treinta y dos perfiles de expresión génica de CRC, nuestro algoritmo seleccionado, entre otros, los biomarcadores relacionados con la supervivencia como
AKAP12, DCBLD2, NT5E
y nuevos marcadores de CRC-específicas, tales como
SPON1
. Hemos examinado los genes candidatos en dos cohortes independientes de 140 pacientes con CCR esporádicos primaria mediante el uso de técnicas de inmunohistoquímica sobre microarrays de tejidos (TMA). Las variaciones en la expresión génica se ensayaron posteriormente en un
sistema de células in vitro Windows que confirmó los datos
in vivo
. En conjunto, nuestros datos proporcionan un nuevo método para identificar nuevos biomarcadores y robustos como un paso importante hacia una mejor estratificación pronóstica y tratamiento de los pacientes.
Material y Métodos
microarrays de datos
aplicamos
NGAA gratis (descrito más adelante) a bases de datos públicas para identificar un conjunto de biomarcadores. Los datos tomados en cuenta son los de las colecciones reportados en [9] y está disponible como GSE17536 y GSE17537 conjunto de datos en la expresión de genes de Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Ambos conjuntos de datos son perfiles de expresión génica obtenido utilizando el Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 de Array. GSE17536 cuenta 177 muestras de 54613 genes de sondas, mientras GSE17537 tiene 55 muestras en las mismas sondas. Los 232 archivos de células primas fueron descargados de ambas colecciones, a continuación, la corrección de fondo, la normalización cuantil y resumen se aplicaron.
Las muestras tumorales
Se analizaron muestras de CRC de cohortes independientes dos de los pacientes que comprenden una serie de pruebas y una serie de validación (I y II), respectivamente. Cohorte I comprende noventa y ocho casos de CCR y 60 pares de mucosa aparentemente normal eliminado durante la misma cirugía. Este conjunto de datos incluye tanto especímenes congelados de nitrógeno incluidos en parafina y líquidos, según ha informado [10,11]. Cohorte II consta de 42 casos de CCR esporádico recogidos en el Departamento de Patología y Oncología, Hospital de Legnago Verona, Italia, durante el período 2005-2007. Los tumores se clasifican y se clasifican de acuerdo con los criterios de los estadios TNM y tumorales sistemas de clasificación I-IV; la edad media de los pacientes fue de 71,2 ± 18,21. Ninguno de los pacientes tenía un historial familiar de la disfunción intestinal o CRC, había recibido quimioterapia o radiación antes de la resección, ni había tomado fármacos anti-inflamatorios no esteroideos sobre una base regular. tratamientos post-operatorios convencionales fueron proporcionados a todos los pacientes, dependiendo de la severidad de la enfermedad. Longitud total de la supervivencia se calculó a partir de la primera cirugía. Los pacientes fueron seguidos durante una media de 55 meses o hasta la muerte.
El análisis inmunohistoquímico y la evaluación de la tinción
Para el análisis inmunohistoquímico, las secciones de tejido fueron deparaffinized, hidratado clasificado en el alcohol, y tratado por microondas 20 min a recuperación del epítopo inducida por calor 750 W. se llevó a cabo mediante el calentamiento de las diapositivas TMA inmersos en citrato de tampón de recuperación (pH 6,0). Las secciones fueron incubadas con peróxido de hidrógeno al 3% durante 20 minutos a temperatura ambiente y, posteriormente, con los anticuerpos específicos: AKAP12 (dilución 1: 500; WH0009590M1, monoclonal de ratón, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Spondin1 (dilución 1: 250; AB40797; policlonal de conejo, Abcam, Cambridge, Reino Unido)); NT5E (dilución 1:50; AB115289; policlonal de conejo, Abcam, Cambridge, Reino Unido); y DCBLD2 (dilución 1: 100; AB115451; policlonal de conejo, Abcam, Cambridge, Reino Unido) todos los anticuerpos se incubaron durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos secundarios, seguido por el sistema de estreptavidina-rábano picante se incubaron durante 30 minutos cada una, mediante el uso de kit de tinción de peroxidasa de estreptavidina-biotina (LSAB + System- HRP; Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca). La inmunorreactividad se reveló mediante incubación en 3,3-diaminobencidina sustrato (DAB) durante 5 minutos. Posteriormente, las secciones se counterstained con hematoxilina, hidratada-de, y la cubierta con engobe. Los anticuerpos primarios se omitieron en los controles negativos.
Se utilizó un enfoque semicuantitativa para evaluar la inmunorreactividad teniendo en cuenta el número de células positivas y la distribución de la tinción de la tinción en el compartimiento subcelular (citosólica y /o de membrana). Para cada muestra, toda la pieza de tejido micro se examinó mediante microscopía óptica de 20 aumentos. El porcentaje de células de cáncer, identificado por inmunoreactividad para cada marcador, se estimó para todas las muestras en el TMA. áreas representativas (5 campo de gran aumento) que contienen la mayor proporción de las células cancerosas se usaron para el recuento de las células tumorales por sección. La fracción (porcentaje de células tumorales inmunorreactivas, en muestras por triplicado) expresada como el número de células positivas para campos (PCF), a continuación, se calculó.
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo a los principios de la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Ética del hospital "Fatebenefratelli" en Benevento y el hospital Legnago, Verona, Italia. Todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras y posterior análisis
Análisis estadístico:. Firma gen Buscador Algoritmo (NGAA)
Nuestro procedimiento de selección de genes emplea un método de envoltura eficiente [8] basan el agrupamiento no supervisado, con un esquema de perturbación generar varios genes de conjuntos con diferentes condiciones iniciales para comenzar la selección de genes. Las condiciones iniciales corresponden a las semillas de los genes que exhiben algunas propiedades tales como ser una buena hipótesis inicial. El algoritmo resultante se define
geneSignatureFinder gratis (NGAA) implementado en un paquete-R y disponible en CRAN (http://cran.r-project.org/web/packages/geneSignatureFinder/index.html) en una de código abierto para su descarga. NGAA, que es una generalización del descenso más inclinado modificado propuesto por Boutros et al. [6], se compone de cuatro pasos principales (Figura 1):
El
Buscador gen Firma Algoritmo
consta de 4 etapas separadas: (1) encontrar los genes de semillas candidato; (2) generar una firma a partir de cada gen de semillas; (3) podar las firmas de inferencia estadística; (4) integrar las firmas de clasificación de genes
. Paso 1:
Buscador de Semillas
El primer paso de nuestro algoritmo está dirigido a la selección de un conjunto de genes que puede ser una semillas de partida fiable para ampliar la firma. Se utilizó un conjunto de genes de acuerdo con dos condiciones principales: (a) una distribución bimodal de los niveles de expresión, la capacidad (B) para separar el conjunto de datos en dos grupos sobre la base de la prueba de análisis de supervivencia. En particular, para cada gen
i
considera la secuencia de g
i
= {
x
ij
,
i = 1 ...
,
M
}, donde
x
ij
es el nivel de expresión del gen
i en el
muestra de
j
. El Criterio de Información Bayesiano (BIC) [12] se utiliza para comprobar la hipótesis de bimodalidad de la secuencia de g
i
. La secuencia de g
i
está agrupado en dos subconjuntos S
1 y S
2 mediante el uso de un
k
algoritmo -median (
k
= 2) y la distancia entre las curvas de supervivencia de las muestras en S
1 y S
2 se calcula entonces. genes de semillas son aquellos que se manifiesta bimodalidad y la separación entre las curvas bajo un umbral de significación elegido (en todos nuestros experimentos 0.05) guía
Paso 2:.
Firma de propagación
dado un conjunto de
K
genes de semillas seleccionadas como el paso anterior, se expandieron un un pequeño distintivo genético a partir de semillas de cada gen. Una estrategia codicioso es adoptado por la selección de la próxima gen firma el gen de maximizar el aumento de la distancia entre las curvas de supervivencia de los dos conjuntos S
1 y S
2 obtenido por la agrupación del conjunto de datos de dos dimensiones (que contienen de la gen semilla y la próxima firma gen candidato). El algoritmo de continuar añadiendo genes para cada firma de esta manera hasta que no mejora adicional de la distancia entre las curvas de supervivencia se obtiene
Paso 3:.
Análisis de la firma y la poda
Un
índice de importancia
se calcula para cada gen de los
K
firmas, que es una medida de la cantidad de un solo gen contribuye a mejorar la distancia entre las curvas de supervivencia con respecto a la distancia sobre la base de todos los genes en una firma. Se define como 1 menos la relación de las distancias de las curvas de supervivencia obtenidas cuando el gen seleccionado se elimina de la firma (detalles en el archivo adjunto procedimiento NGAA complementarias). A continuación, cada firma se poda por los genes que no contribuyen significativamente a la separación de la dicotomía generada por la firma
Paso 4:.
Gene Clasificación
Desde el conjunto de genes en los
K
firmas, se pueden obtener diferentes puntajes para seleccionar genes candidatos que podrían estar asociadas con los grupos de pronóstico. Marcamos los genes sobre la base del número de firmas en que se producen y su índice medio importancia
Los Materiales & amp acompañan.; Métodos S1 (NGAA procedimiento complementario) contiene todos los detalles del algoritmo y los comandos para replicar todo el análisis con R utilizando el paquete NGAA.
Resultados
Firma gen Buscador Algoritmo (NGAA) revela muchas firmas asociadas con la adhesión celular y la organización matriz extracelular
Hemos aplicado la NGAA a un conjunto de datos de doscientos treinta y dos muestras de CRC y de semillas identificaron 16 genes que muestran una disminución significativa (
p
& lt; 0,05 después de la corrección) de separación univariado de las curvas de supervivencia entre los grupos de buen y mal pronóstico, y son bi-modal al mismo tiempo (alrededor de 1/3 de las sondas muestran bimodalidad). De cada una de las semillas-genes se han obtenido las firmas que se enumeran en la Tabla 1; las correspondientes curvas de supervivencia se ilustran en la Figura S1. En la mayoría de los casos, el
p-valor
no es computable dado que el
t
-valor está más allá de la precisión de la máquina. A pesar de que los subconjuntos de genes seleccionados pueden ser diferentes, las curvas de supervivencia a menudo parecen similares (Figura S1), por lo que hizo la diferencia entre la separación inducida por cada firma. Hemos calculado la distancia entre la agrupación obtenida por cada una de las 16 firmas y conseguir el dendrograma indica en la figura 2a: observamos que distintos firma genética con el tiempo puede generar dicotomías similares. Este dendrograma permite obtener una clasificación robusta de las muestras en dos grupos según el número de veces que una muestra dada cae en uno de los grupos. En particular, el
estable grupo de buen pronóstico
comprende muestras que en por lo menos el 80% de las dicotomías caída en el grupo de buen pronóstico, de forma análoga para el
pobre establo grupo de pronóstico
. Por lo tanto, 133 y 56 muestras fueron clasificadas en el grupo estable bien o mal pronóstico, respectivamente, mientras que el 43 permanecieron poco fiable clasifican y definen las muestras de incertidumbre. Las correspondientes curvas de supervivencia se presentan en la Figura 2b, log-rank test entre las tres curvas da un
p-valor
& lt; 10
-16. 1609 genes expresados diferencialmente (1,5 veces el cambio y corregidos
p-valor
& lt; 0,05) entre los dos grupos de pronóstico estables genera el mapa de calor agrupación de la figura 2c. Las muestras se dividieron en dos grupos principales: el primero estaba constituido por 113 de los 133 (85%) de la forma estable clasificado como grupo de buen pronóstico; la segunda 55 de 56 (98%) del grupo de pronóstico pobre. Las correspondientes curvas de supervivencia se muestran en la Figura 2d, la prueba de log-rank entre las dos curvas da
p
= 6,6 · 10
-6. La silueta de la separación grupo también se informa en el archivo adjunto procedimiento NGAA complementario. Génica
Semilla
t-valor
log (
p-valor
)
Firma
PCSK5 (205560_at) 76.572 & lt; -16PCSK5, AKAP12, Npr3, AGPAT5, GMFB, C6orf141, 1569202_x_at, KCNH8FST (226847_at) 75.757 & lt; -16FST, AKAP12, ULBP2, SLC25A43, EI24, 1563467_at, CLDN8POSTN ( 214981_at) 74.023 & lt; -16POSTN, AKAP12, AGPAT5, ATL3, SLC44A2SUSD5 (214954_at) 71.842 & lt; -16AKAP12, 241867_at, ADAMTS5, APLP2, PITPNC1, 1556983_a_atKIAA1462 (231841_s_at) 67.624-15.654KIAA1462, DCBLD2, ADIPOQ, FAM217B, C17orf48DCBLD2 (230175_s_at ) 66.71-15.477DCBLD2, AKAP12, GUSBP11, CDR2L, MGC16703, METTL4NPR3 (219054_at) 66.457-15.477NPR3, DZIP1, 243820_at, 238109_at, 236795_at, DNAJC4, FOXA1, EMID2AKAP12 (227530_at) 65.522-15.256AKAP12, ISM1, C11orf9, 244026_at, ARHGAP9, NOL3, AP2A1PAPPA (201981_at) 65.024-15.109PAPPA, NT5E, DUSP7, 230711_at, CD96, ABI2ETV1 (221911_at) 61.631-14.386ETV1, LONRF3, NGEF, RAB2A, U2AF2, CPOKIAA1462 (213316_at) 60.733-14.184KIAA1462, AKAP12, UGGT2 , 231989_s_atSRGAP2P1 (1568955_at) 58.417-13.674SRGAP2P1, AKAP12, SNX16, NT5ELOC100132891 (228438_at) 58.037-13.589LOC100132891, DCBLD2, ADIPOQ, SLFN5DCBLD2 (224911_s_at) 50.106-11.837DCBLD2, ADCY7, EHD2CTGF (209101_at) 46.099-10.949CTGF, FERMT1, AKAP12 , CDK1EFHA2 (238458_at) 42.166-10.076EFHA2, ST18, ACACBTable 1. Las firmas desarrolladas a partir de semillas 16-genes.
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a. Dendrograma de las dicotomías generados por cada una de las 16 firmas NGAA (Tabla 1 y Figura S1); segundo. parcela de supervivencia de las 133 muestras de forma estable clasificadas en el grupo de buen pronóstico, 56 muestras en el grupo de mal pronóstico y 43 muestras de incertidumbre (log-rank test da
p Hotel & lt; 10
- 16); do. mapa de calor de DEGs entre los dos grupos estables, rojo indica los genes sobreexpresados (niveles de expresión más de la mediana) y el verde (genes underexpressed niveles de expresión en virtud de la mediana); re. muestras de las curvas de supervivencia en los dos grupos de mapa de calor como en c. (p
= 6,6 · 10
-6).
Para dilucidar los procesos biológicos y funciones asociadas con los estos dos grupos, hemos identificado 1394 probesets expresados diferencialmente correspondientes a 1024 genes diferentes (DEGs), 87% de ellas están incluidas en la lista de DEGs entre los grupos de pronóstico estable. La lista de DEGs enriqueció varias categorías de ontología de genes (GO). Nuestro procedimiento NGAA seleccionado, en relación con el grupo de mal pronóstico, un conjunto de muestras con características mesenquimales asociados con por genes implicados en la adhesión celular y la proliferación. En particular, GO análisis de los genes regulados hasta en los pobres grupo demostró que
adhesión celular
se enriqueció con 123 DEGs (
p Hotel & lt; 10
-28),
Matriz extracelular Organización
con 34 genes (
p Hotel & lt; 10
-15),
respuesta a heridas
con 95 DEGs (
p Hotel & lt; 10
-22),
respuesta inmunitaria
con 91 genes (
p Hotel & lt; 10
-14). Por otra parte, estos DEGs enriquecen los KEGG vías
interacción ECM-receptor gratis (
p Hotel & lt; 10
-10) y
de adhesión focal gratis (
p
& lt; 10
-8). Cuando se ha seleccionado el análisis Ingenuity Pathway, nuestra lista de DEGs produjo un conjunto de categorías enriquecido cuyas
p-valor
se informa en la Figura S2a. En particular, otras categorías relacionadas con el desarrollo de los tejidos y el cáncer fueron significativamente enriquecido; específicamente los relacionados con el cáncer colorrectal se enriquecieron a
p Hotel & lt; 10
-14
.
Con el fin de comprender los principales reguladores implicados en la separación de los dos grupos de pronóstico, se realizó un análisis de enriquecimiento de los reguladores de aguas arriba. Curiosamente, el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFß1) fue hasta reguladas en el grupo de pronóstico pobre [13]. Por otra parte, la red de los 20 reguladores representados en la Figura S2b podría explicar el comportamiento de 177 de los genes seleccionados. Los reguladores superiores de la red también comprenden otros factores de crecimiento solubles tales como los miembros del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y las familias de factor de necrosis tumoral (TNF). Los genes seleccionados están involucrados principalmente en la señalización TGFß1, como 109 moléculas (
p Hotel & lt; 10
-51) son sus objetivos anotados en la base de conocimientos IPA. Mediada por el receptor de señalización en respuesta a estos ligandos desencadena la activación de moléculas efectoras intracelulares, tales como, los pequeños RAS familia GTPasa, los miembros de los factores de transcripción de la familia o de la tirosina-quinasa SRC incluyendo, SMAD, RUNX2, STAT3, NFkB, p53 y β- catenina. Estos efectores tienen un papel central en la progresión del CRC y la invasión metastásica promover la formación de un microambiente asociado al tumor.
TMA validación de los biomarcadores identificados por las firmas del conjunto
Para identificar biomarcadores asociados con robustos CRC pronóstico que puedan validarse en nuestras dos bibliotecas de tejidos, se utilizó la clasificación reportados en el tercer paso de la NGAA y los genes resultantes se muestran en la Tabla S1, donde
AKAP12, DCBLD2, NT5E
eran los más comunes genes seleccionados por el algoritmo en las diversas firmas. También se validó SPON1 que, de forma inesperada, que fue uno de los genes más expresados diferencialmente de los dos grupos; sin embargo, su papel en la CRC no se ha abordado todavía. Hemos examinado por inmunohistoquímica (IHC) el TMA de nuestra serie de 140 CRC y un subgrupo de 60 muestras de colon normales emparejados para determinar el potencial pronóstico de los genes seleccionados. patrón de expresión marcadores "se registró como porcentaje de células positivas: una tinción positiva por encima del 25% de las células tumorales se definió alta expresión. La figura 3a informa diapositivas de tejidos representativos de la TMA marcadas con anticuerpos contra AKAP12, DCBLD2, NTE5 y SPON1. Figura 3b informa el porcentaje de los detección entre el tumor y las muestras normales. En la Figura S3 más tinción de DCBLD2 y NT5E a una mayor resolución se ilustra.
a. "Las columnas de izquierda a derecha" indican un patrón de inmunotinción en muestras de colon normal y núcleos CRC negativos y positivos para cada marcador AKAP12, DCBLD2, NT5E, SPON1. Las flechas negras indican patrón de tinción inmunohistoquímica en las células de colon normales o malignas. Las flechas blancas indican la distribución de la inmunotinción en el compartimiento del estroma (endoteliales, células T reguladoras y macrófagos) característica del patrón de expresión NT5E. Aumento de 10X; segundo. Número de casos positivos detectados en la serie de validación TMA que comprende las muestras de tumor (TUM) y un subgrupo de la mucosa colónica normal correspondiente (NM). Las barras de error indican la desviación estándar de la media (
p
& lt; 0,05); do. Cuatro muestras representativas congelados CRC (T) y mucosa normal correspondiente (N) se identificaron en la misma cohorte de pacientes y se analizaron por inmunotransferencia. marcadores de peso molecular se indican en kilodaltons. β-tubulina se utilizó como control de carga para normalizar las intensidades de banda.
En la mucosa colónica normal, AKAP12 inmunotinción fue siempre positiva, localizado en el citosol y se distribuye principalmente en el compartimento de cripta apical es decir, en más diferenciado Células. En las muestras de CRC, AKAP12 inmunorreactividad se mantuvo en el 55% y ausente en aproximadamente el 45% de los casos.
DCBLD2 siempre fue positiva en las células de colon normal y de manera uniforme localizada en las membranas plasmáticas baso-lateral. En las muestras de CRC, se detectó la inmunotinción en aproximadamente el 52% de los casos. En algunas secciones de tumor, DCBLD2 immunopositivity también se localizó en el compartimiento citosólico.
immunopositivity NT5E se encuentra principalmente en las células estromales (células T endoteliales o de regulación) de la mucosa colónica normal, mientras que fue débilmente positivo o negativo en las células del colon epiteliales. En línea con este hallazgo, NT5E immunopositivity marcó el estroma asociado al tumor y estaba ausente en las células malignas en aproximadamente 40% de las muestras tumorales. Curiosamente, en el 60% restante, NT5E tinción marcada también células epiteliales malignas, además de las del estroma.
inmunorreactividad SPON1 fue positiva sólo en aproximadamente el 20% de las muestras de colon normal. Sorprendentemente, SPON1 se detectó en aproximadamente el 70% de las muestras de CRC, con una membrana o localización citosólica. Positividad dentro de los tumores se correlacionó significativamente con el colágeno IV y la expresión de vimentina, lo que sugiere un papel de SPON1 en la reorganización y remodelación de la matriz extracelular del tumor (ECM) (datos no mostrados).
Análisis Western Blot El CRC primaria
para corroborar el perfil de expresión de IHC y tener más datos cuantitativos, veinte muestras de CRC seleccionados al azar y las mucosas normales emparejados de se analizaron mediante western blot la misma cohorte de pacientes, utilizando los mismos anticuerpos empleados en IHC. Este análisis también verificó la especificidad de los anticuerpos. Las bandas obtenidas se cuantificaron por densitometría después de la normalización de ß-tubulina la carga de proteínas. AKAP12 y DCBLD2 se detectaron con frecuencia en niveles inferiores de tumor (T) que emparejados tejidos normales (N). Por el contrario, NT5E y expresión SPON1 mostraron niveles significativamente más elevados en los tumores que los controles. Figura 3c informa de las bandas correspondientes a cuatro muestras representativas, la cuantificación de los cuales se informa en la Figura S4a. Aunque los datos a que se refiere sólo a los 20 casos, que confirmaron la especificidad de los resultados y reforzaron las diferencias entre las muestras normales y tumorales detectado por IHC en las TMA.
Los biomarcadores Perfiles de Expresión y parámetros clínico-patológicos
Se realizó una prueba de comparación múltiple de la evaluación de la frecuencia IHC expresión de cada biomarcador y los parámetros clínico-patológicas. No se encontró asociación entre el gen o AKAP12 SPON1 perfil de expresión y la edad del paciente, sexo, estadio tumoral, la diferenciación o la histología, la presencia de metástasis ganglionares y hepáticas. Por el contrario, la pérdida de DCBLD2 se correlacionó con etapas avanzadas de la enfermedad (
p = 0,021
). De hecho, el 37,4% de las muestras ensayadas bajo para la expresión DCBLD2 era más frecuentemente en estadio IV-tumores en comparación con 15% de los DCBLD2 los de alto expresan. De acuerdo con ello, incluso los casos asociados con metástasis a distancia tenían niveles significativamente más bajos de expresión DCBLD2 que aquellos sin metástasis hepáticas (
p = 5,71
· 10
-5). En particular, también tumores que expresan altos niveles de NT5E mostraron una susceptibilidad similar a los tumores metastásicos (
p
= 6,62 · 10
-4). La asociación entre biomarcadores y los parámetros clínico-patológicas en nuestra base de datos CRC se ilustra en la Tabla S2.
Para explorar cuál de los genes seleccionados fue también un predictor independiente de supervivencia de los pacientes de nuestra serie de validación CRC, se clasificaron los tumores como baja o alta expresión de cada uno de los biomarcadores bajo investigación. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que la pérdida de AKAP12 se asocia marginalmente con una mala supervivencia global (OS) (
p = 0.0758
, Figura 4a). Cabe destacar que la baja expresión asociada a la membrana de DCBLD2 y la sobreexpresión de NT5E en las células tumorales se asocia fuertemente con la supervivencia más corta (
p = 5,97
· 10
-7and
p
= 1,01 · 10
-5, respectivamente, la figura 4c y 4d). No se encontró asociación significativa con el sistema operativo teniendo en cuenta sólo el immunopositivity NT5E en el tumor de estroma asociado (Figura S5). SPON1 sobre-expresión no se correlaciona con el pronóstico de los pacientes (datos no mostrados).
a. Las curvas de supervivencia en nuestra serie de validación CRC, categorizados como de alto (curva roja) y baja (curva verde) AKAP12, DCBLD2 y NT5E expresión.
p-valor
para la hipótesis nula de igualdad de las curvas de supervivencia de la población se proporciona mediante la prueba de log-rank en cada gráfico; segundo. curvas de supervivencia estimada combinación de la expresión (
alta
y
baja) de los 3 marcadores (AKAP12, DLBLC2, NTE5). curva roja representa la combinación
alta /alta
; la curva azul representa la combinación
alta /baja
; la curva de negro representa la combinación
baja /alta
; la curva verde representa la combinación
baja /baja
.
Por último, se evaluó si los tres marcadores predictivos (AKAP12, DCBLD2, NT5E) podrían ejercer efectos recíprocos y mejorar la precisión de pronóstico. Los casos se clasificaron en 4 grupos de acuerdo con sus niveles de expresión (Figura 4d, 4e, 4f). Cabe destacar que el 100% de los pacientes que muestra la combinación DCBLD2
alta /NT5E
baja estaban vivos a los 5 años después del diagnóstico. Por el contrario sólo el 30% de los pacientes cuyos tumores expresan la combinación DCBLD2
baja /NT5E
alta estaban vivos. Esta diferencia en la supervivencia fue independiente de la quimioterapia adyuvante o etapa de la enfermedad.
La expresión de biomarcadores seleccionados en líneas celulares de CRC
Para obtener un mejor conocimiento de los genes candidatos, se evaluó su perfil de expresión de proteínas en seis líneas representativas humanos CRC derivadas de células (Figura S3 B). se detectó proteína AKAP12 sólo en las células HCT116 y DLD1 de acuerdo con estudios anteriores [14]. DCBLD2 se expresó en niveles muy bajos en la mayoría de las líneas celulares, mientras que NT5E fue altamente expresado en HT29 y HCT116 en comparación con las otras líneas celulares. Finalmente SPON1 se detectó en la mayoría de las líneas celulares, con los más altos niveles en DLD1.
Cross-talk entre el TNF-α y la señalización de PPAR regula NT5E y DCBLD2
El
In in vivo
resultados sugieren que NT5E y DCBLD2 están implicados en la invasión tumoral y la metástasis probablemente a través de un mecanismo inmunosupresor inducida por tumor. Por lo tanto, nos centramos nuestra atención en TNF-α, una citoquina que regula una red de señalización implicados en enfermedades inflamatorias y la tumorigénesis [15]. Ingenuity Pathway Analysis se preguntó para resaltar los efectos del TNF-α y citocinas que interactúan. NFkB emergió como el eje principal de la red de reguladores de aguas arriba de los DEGS seleccionados y, a su vez, como un modulador crucial de genes implicados en la respuesta inflamatoria e inmune (Figura S6a) [16]. Sobre la base de estas observaciones, se realizaron búsquedas de elementos que actúan en cis reguladoras de ADN en
NT5E
y
DCBLD2
promotores (Figura S6B) y identificado varios elementos del sitio-como NFkB putativo. Para comprobar si
NT5E
, y posiblemente
DCBLD2
, podría ser regulada por la cascada inflamatoria, las células tratadas con LPS HEK 293T, un potente inductor de NFkB pro-inflamatorias, y obtuvieron un tiempo significativo inducción dependiente de
NT5E
; Del mismo modo, la expresión ectópica de p65 /NFKB de RelA subunidad causó una inducción significativa mejorado aún más por el tratamiento LPS. Por el contrario, la transfección de los súper supresor de I? B? S32 /36 abolió por completo el efecto estimulante de LPS en
NT5E
(Figuras S6c y S6D). segundo. segundo. a. segundo. do.