Extracto
Antecedentes
tumores
pulmón son la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo y paclitaxel ha demostrado ser útil para los pacientes con cáncer de pulmón, sin embargo, la resistencia adquirida es un problema importante. Para superar este problema, una opción prometedora es el uso de Constitutivo androstano Receptor (CAR) ligandos en combinación con agentes quimioterapéuticos contra las células cancerosas. Por lo tanto, deseamos dilucidar los efectos de ligandos CAR sobre la eficacia antineoplásica de paclitaxel en células de cáncer de pulmón.
Metodología /Principales conclusiones
Nuestros resultados de los ensayos de viabilidad celular exponiendo agonista coche o inverse- agonista de ratón y células de cáncer de pulmón humano modula el efecto antineoplásico de paclitaxel. Los agonistas CAR aumentado el efecto de Paclitaxel en 6 de las 7 líneas celulares de cáncer de pulmón, mientras que el agonista inverso no tuvo ningún efecto sobre la citotoxicidad paclitaxel. Curiosamente, el MCAR agonista TCPOBOP aumentó la expresión de dos genes supresores de tumores, a saber, WT1 y MGMT, que se aditiva mejoradas en las células tratadas con agonista de CAR en combinación con paclitaxel. Además,
in silico
análisis mostraron que tanto el paclitaxel y el agonista CAR TCPOBOP atracado en la estructura MCAR pero no el androstenol agonista inverso. Paclitaxel per se aumenta la expresión de CAR en las células cancerosas. Por último, analizamos la expresión de CAR en dos estudios independientes públicas de Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) de células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC). CAR se expresa en niveles variables en muestras de NSCLC y se observó ninguna asociación con la supervivencia global.
Conclusiones /Importancia
En conjunto, nuestros resultados demostraron que los agonistas CAR modulan la eficacia antineoplásica de paclitaxel en el ratón y líneas celulares de cáncer humano. Este efecto se relaciona probablemente con la mayor expresión de dos genes supresores de tumores, a saber. WT1 y MGMT. La mayor parte de los casos de NSCLC presente la expresión del gen CAR convirtiéndolo posible especular el uso de la modulación CAR por ligandos, junto con paclitaxel en el tratamiento de NSCLC
Visto:. Fukumasu H, Rochetti AL, Pires PRL, Silva ER, Mesquita LG, Strefezzi RF, et al. (2014) constitutiva del receptor androstano ligandos modulan la eficacia antitumoral de paclitaxel en la célula Las células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (6): e99484. doi: 10.1371 /journal.pone.0099484
Editor: Rubí Juan Anto, Centro de Biotecnología Rajiv Gandhi, India
Recibido: 6 Agosto, 2013; Aceptado: 15-may de 2014; Publicado: 24 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Fukumasu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias Fundación de apoyo a la Investigación del Estado de São Paulo (FAPESP) por el apoyo financiero (proceso de números:. 2008 /56584-2; 2009 /11081-6; 2010 /00535-3; 2010 /05650-5; 2011 /05690- 0. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción los tumores
pulmonares son la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, y son responsables de aproximadamente 1,2 millones de muertes por año [1]. en los últimos 30 años, varios avances en el tratamiento del cáncer de pulmón han surgido con el mejora de la inmunoterapia, radioterapia y quimioterapia, pero la ganancia en el tiempo de supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón continuará siendo modesto [2]. El tratamiento para el cáncer de pulmón depende del tipo histológico, la presencia de metástasis y estado funcional del paciente. Los métodos de tratamiento más comunes incluyen una combinación de cirugía (cuando los tumores son resecables), la radioterapia y la quimioterapia. Respecto a esto último, el uso de uno o más fármacos citotóxicos, al mismo tiempo, tales como taxanos, compuestos de platino y /o análogos de nucleósidos es la más común. Por lo general, la quimioterapia de primera línea para el cáncer no microcítico de pulmón avanzado de células (CPNM) emplea un protocolo con un taxano (paclitaxel o docetaxel) asociada con cisplatino o gemcitabina [3].
Los cánceres suelen presentar como una población heterogénea de células malignas, con algunos que son sensibles a los medicamentos y algunas que son resistentes a los medicamentos. La quimioterapia citotóxica mata a las células sensibles a fármacos, pero no afecta a las células resistentes a los medicamentos que son generalmente en un estado latente [4]. A medida que el tumor empieza a crecer de nuevo, la quimioterapia a menudo falla debido a que las células tumorales restantes son principalmente resistente a los medicamentos [5]. Paclitaxel, un fármaco antineoplásico ampliamente utilizado para el cáncer de pulmón, es un agente de unión a tubulina que bloquea la progresión de la mitosis en última instancia conduce a la muerte celular por apoptosis [3]. Este taxano ha demostrado ser un fármaco útil para los pacientes con cáncer de pulmón; Sin embargo, al igual que con otros fármacos quimioterapéuticos, adquirida se observa con frecuencia la resistencia de las células cancerosas.
Por lo tanto, el aumento de la eficacia de paclitaxel es altamente deseable. Chen
et al
. [6] considera una opción prometedora que implica el uso de CAR (Constitutiva androstano Receptor, NR1I3) y PXR (receptor de pregnano-X, NR1I2) ligandos en combinación con agentes quimioterapéuticos que activan PXR y CAR para superar, o al menos atenúan resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células de cáncer. Curiosamente, el paclitaxel es un activador potente PXR e inductor de aclaramiento del fármaco mediado por P-gp [7]. Además, muchos medicamentos quimioterapéuticos se modulan o metabolizados por la enzima citocromo P450 CYP3A4 [8], un objetivo transcripcional conocido de PXR y CAR activado [9], [10].
CAR y PXR son receptores nucleares de esteroides conocido como xenosensors maestros [11] que son capaces de reconocer compuestos estructuralmente diversos [12]. Ambos receptores, cuando se activan por los ligandos, se translocan al núcleo e inducen la transcripción de varios genes implicados en el metabolismo de fármacos y la excreción, la glucosa y metabolismo de los lípidos y la regulación hormonal [13], [14]. Recientemente, la importancia de PXR en la patogénesis del cáncer y de tumores MDR ha sido un tema de debate, pero no se ha logrado un consenso sobre su papel específico hasta la fecha [15], [16]. Similar a PXR, el papel de CAR en el cáncer también es controvertido. En una mano, CAR se determinó que era esencial para la promoción de tumores de hígado por fenobarbital [17], [18], y por el otro coche de la mano ha demostrado ser una nueva diana terapéutica para el cerebro y tumores hematopoyéticos [19], [20 ]. Por lo tanto, nuestro objetivo fue determinar la importancia de la modulación selectiva CAR por ligandos y para determinar los efectos aguas abajo sobre la eficacia antineoplásica de uno de los fármacos quimioterapéuticos usados más comunes para el cáncer de pulmón.
Material y Métodos
Reactivos y líneas celulares
El paclitaxel, CITCO, TCPOBOP, androstenol y MTT se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Medios y reactivos para cultivo celular se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Trizol, cebadores, oligodT enzima Superscript II y la mezcla maestra de energía SYBR Green eran de Life Technologies (Grand Island, NY, EE.UU.). Otros reactivos fueron de grado analítico. Las líneas celulares utilizadas en este experimento fueron la línea celular de ratón E9 [21] y las líneas celulares humanas A549, H2023, H460, H2030, H1792 y H23 [22]. Todas estas líneas de células fueron un regalo del Dr. Lucy M. Anderson, del Laboratorio de Carcinogénesis comparativo en el Laboratorio de Frederick Nacional para la Investigación del Cáncer (Estados Unidos de América).
experimentos celulares con ratón y células de cáncer de pulmón humano líneas
línea celular de cáncer de pulmón de ratón E9 se originó a partir de la transformación espontánea de las células epiteliales de pulmón no neoplásicas inmortalizadas aisladas de ratones BALB /c ratón [23]. Estas células se cultivaron en CMRL 1066 medio (Invitrogen, New York, NY), suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Invitrogen), 200 mM de L-glutamina (Invitrogen) y cóctel de antibióticos (100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina; Invitrogen) en un incubador humidificado a 37 ° C y 7% de CO
2. líneas celulares de cáncer de pulmón humano se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen, New York, NY), con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen) más 2% de L-glutamina (Invitrogen) y 1% Pen-strep (Invitrogen) en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO
2.
Determinación de MCAR ligandos efectos sobre la viabilidad celular.
E9 células se sembraron a 2.000 /pocillo en placas de 96 pocillos (Corning, EE.UU. ) que contiene 100 l de medio suplementado como se describe. Después de 24 h, los medios se descargó y se cambió con nuevos medios añadido con diferentes concentraciones de agonista CAR (TCPOBOP) o agonista inverso CAR (androstenol) de 10
-4 M a 10 mM. Cuarenta y ocho horas más tarde, 11 l de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT - 5 mg /ml) se añadió a cada cristales bien y de formazan se produjeron más de una 2 h período de incubación. El medio se retiró de cada l así y 100 de HCl 0,4 N en alcohol isopropílico se añadieron para disolver los cristales. densidad óptica a 540 nm se midió en un Fluorstar Optima (BMG Labtech, Alemania).
Determinación de la concentración inhibitoria media máxima de paclitaxel (IC50).
células E9 se utilizaron con el mismo protocolo descrito anteriormente con concentraciones de 1 nM a 1600 nM de paclitaxel.
Evaluación de los efectos de los ligandos sobre la citotoxicidad MCAR paclitaxel.
células E9 se utilizaron con el mismo protocolo descrito anteriormente, donde los ligandos eran añadido simultáneamente con el IC50 de paclitaxel y la viabilidad celular se evaluó como se describe.
Determinación de los efectos de ligandos HCAR sobre la viabilidad celular, el cálculo de la CI50 de paclitaxel y experimentos de co-exposición.
Todos estos se llevaron a cabo experimentos usando líneas celulares de cáncer humano como se describe para las células cancerosas de ratón E9 con condiciones específicas para el cultivo celular como se ha descrito.
análisis
La expresión génica de MCAR
E9 células se sembraron a 3.10
5 células /placa en placas de T25 (Corning, USA) bajo las mismas condiciones descritas anteriormente con la adición de TCPOBOP (10 mM), Androstenol (10 mM), TCPOBOP (10 M) más paclitaxel (IC50), Androstenol (10 M) más paclitaxel (IC50) o DMSO solo para el control. ARN total fue extraído de cinco repeticiones de cada tratamiento y los controles con Trizol siguientes instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se cuantificaron (Biophotometer, Eppendorf, Alemania) y se observó la relación de 260/280. Sólo se utilizaron muestras que presentaban 1,7-2,0 y demostraron buena calidad (no degradado) después de que el análisis por electroforesis en un gel de agarosa (1,5%, solución salina tamponada con Tris). Por lo tanto, 1 g de ARN total se transcribió de forma inversa con cebadores oligodT y superíndice II en ADNc. Todos los cebadores se diseñaron con el software Primer-3 [24] y se llevaron a cabo en BLAST [25] para verificar la ausencia de alineamientos locales con el ADN y otras secuencias de transcripción de ARN de ratón. Potencia SYBR Green se utilizó para la PCR en tiempo real con cebadores para MCAR (NM_009803.5; F: 5'-GGGCCTCTTTGCTACAAGAT-3 '; R: 5'-AGGTTTTTATGGAAGTGGAGGA-3'). La limpieza de genes utilizado fue el 18 s RNA ribosomal (NR_003278.3; F: 5'-CCTGCGGCTTAATTTGACTC-3 '; R: 5'-CTGTCAATCCTGTCCGTGTC-3'). Las reacciones se llevaron a cabo en un ABI Prism 7500 termociclador (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.) con el reactivo de Mix Master Power verde SYBR y el análisis de datos de expresión génica relativa se realizó de acuerdo con el método Delta-Delta-CT [26 ].
array PCR RT
2 análisis de perfiles
El RT
2 Profiler ratón oncogenes y genes supresores de tumores matriz de PCR (PAMM-502Z, SABiosciences, EE.UU.), que contiene 84 genes que promueven la oncogénesis, además de limpieza genes y controles, se utilizó para analizar los efectos de TCPOBOP además de la expresión de genes relacionados con paclitaxel en células E9. Se sembraron las células y se trataron como se ha descrito anteriormente, el ARN total se extrajo con el kit RNeasy Mini (Qiagen, EE.UU.) y tres repeticiones por tratamiento donde agruparon para el análisis (experimento realizado por duplicado). Pooled ARN fue inverso-transcrito con el kit de primera cadena (SABiosciences), combinado con el /ROX PCR mezcla maestra de SYBR Green (SABiosciences), y se añadió a cada pocillo de la placa de RT2 Profiler PCR, que contiene el cebador de pre-dispensado de genes específicos conjuntos. La reacción se realizó en un ABI Prism 7500 termociclador. análisis de los datos se basó en el método de Ct, con normalización de cuatro genes de limpieza diferentes. Doblar los cambios de 2X (hacia arriba o hacia abajo-regulación) se consideraron para el análisis.
in silico
análisis de acoplamiento de ligandos MCAR y paclitaxel en la estructura MCAR
Análisis computacional se ha realizado mediante la estructura cristalina del receptor CAR co-cristalizado con androstenol (1XNX pdb) [27] y TCPOBOP (1XLS pdb) [28]. ligandos diana del receptor y de conexión se prepararon utilizando quimera [29]. La superficie molecular del objetivo se genera en función del desarrollo de algoritmos [30]. generación esfera se ha realizado mediante el algoritmo sphgen; las esferas se distribuyen con dock6 y seleccionados utilizando "spheres_selector". la generación de rejilla se logró utilizando rejilla, que se distribuye como un accesorio para DOCK [31]. Muelle flexible se utiliza para verificar las interacciones entre el receptor CAR objetivo y productos químicos [32]. Los resultados obtenidos por acoplamiento se visualizaron y se analizaron en Quimera versión 1.4.1 (build 30365).
Análisis cBioPortal de los conjuntos de datos del Atlas del Genoma del Cáncer
cBioPortal, una herramienta desarrollada por el Centro de Biología Cómputos Sloan Kettering en, fue visitada en http://www.cbioportal.org/public-portal/[33], [34]. Dos conjuntos de datos se utilizaron en este trabajo: "El adenocarcinoma de pulmón (TCGA, en prensa)", con 230 casos y el "Pulmón Carcinoma de células escamosas (TCGA, provisional)", con 489 casos en el momento del análisis, de marzo de 2014. Ambos estudios fueron utilizado para evaluar la presencia de mutaciones genéticas y alteraciones del número de copias (CNA) que ilustra el "oncoprints", alterado de expresión de ARNm y /o metilación del ADN y las curvas de supervivencia global dentro de estas alteraciones. Para determinar cuál de las muestras presentó expresión de genes alterados el Z-score se establece en 1,96.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar a menos que se indique lo contrario. GraphPad Prism 5 para Windows (GraphPad Software, EE.UU.) se utilizó para todos los análisis estadísticos realizados con pruebas no paramétricas como la U de Mann-Whitney y de Spearman. De dos vías ANOVA se utilizó para las comparaciones entre diferentes ligandos efectos sobre la viabilidad celular. La supervivencia global a partir de datos del TCGA se estimaron las curvas de Kaplan-Meier y los valores de p de rango logarítmico por la cBioPortal de Genómica del Cáncer [33], [34]. Se consideraron diferencias significativas cuando p. & lt; 0,05
Resultados
Los ligandos coche no son citotóxicos de ratón o células humanas de cáncer de pulmón
Inicialmente, se evaluaron los efectos citotóxicos de MCAR ligandos, incluyendo el agonista TCPOBOP y el androstenol agonista inverso, en las células de cáncer de pulmón E9 ratón. La exposición a TCPOBOP durante 48 h no tenía ningún efecto sobre la viabilidad celular E9 incluso a una alta concentración (Fig.1). Por otro lado, el androstenol agonista inverso indujo un aumento dependiente de la dosis en la proliferación celular, con más de 60% de células que el grupo control en la alta concentración (p & lt; 0,0001; Fig. 1). Estos resultados sugieren que el uso de agonistas MCAR en células de cáncer de ratón puede dar como resultado diferentes efectos sobre la viabilidad celular, incluso el aumento de la proliferación celular como se observa para androstenol.
(A) La viabilidad celular después de 48 horas de diferentes concentraciones de la MCAR agonista TCPOBOP o el androstenol agonista inverso MCAR. TCPOBOP no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular, incluso a la concentración más alta. Por otro lado, androstenol aumenta el número de células de cáncer de E9 dependiente de la dosis (* p & lt; 0,05 - dos vías ANOVA seguido por prueba de comparación múltiple de Tukey para el efecto del tratamiento). (B) Efectos de MCAR ligandos sobre la eficacia antitumoral de paclitaxel (IC50). TCPOBOP incrementa la eficacia antitumoral de la de paclitaxel por viabilidad celular significativa disminución en 1-10 mu M en comparación con sólo las células tratados con paclitaxel (p & lt; 0,05 - dos vías ANOVA seguido por prueba de comparación múltiple de Tukey para el efecto del tratamiento). El androstenol suprime parcialmente la eficacia antitumoral de paclitaxel (p & lt; 0,05 - dos vías ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para el efecto del tratamiento). (C) La expresión de genes de MCAR en las células tratadas con ligandos solos, paclitaxel solo, o en combinación. Ligandos no alteró la expresión de genes MCAR. Tenga en cuenta que todos los grupos tratados con paclitaxel presentó un aumento de la expresión de genes MCAR en comparación con el grupo control (* p & lt; 0,05 - Una forma ANOVA).
A continuación, se llevaron a cabo experimentos similares en seis líneas celulares de cáncer de pulmón humano. Hemos probado si el agonista específico humana CAR, CITCO, y el androstenol agonista inverso, presentan efectos citotóxicos en estas líneas celulares. Ningún efecto fue observado para CITCO o Androstenol incluso a la concentración más alta probada (p & gt;. 0,05 para todas las líneas celulares, Fig S1).
Los agonistas CAR TCPOBOP y Citco mejorar la eficacia antineoplásica de paclitaxel en el ratón y humana células de cáncer de pulmón
Nuestra hipótesis es que la modulación CAR por sus ligandos podría alterar la eficacia antitumoral de paclitaxel, un agente antineoplásico comúnmente utilizados para la quimioterapia del cáncer de pulmón en seres humanos. En primer lugar, se determinó la concentración de paclitaxel que inhibía el 50% de la viabilidad celular para cada línea celular (IC50, Tabla 1). El uso de esta concentración, el próximo evaluó los efectos de los agonistas del coche en el efecto antitumoral de paclitaxel mediante la exposición de las células cancerosas a paclitaxel más diferentes concentraciones de un agonista coche o agonista inverso.
Cuando nosotros co células de cáncer de pulmón de ratón -exposed a diferentes concentraciones de TCPOBOP más paclitaxel en la concentración inhibidora (IC50), el agonista CAR mejorado paclitaxel eficacia antitumoral dependiente de la dosis, lo que reduce la viabilidad celular en casi un 40% cuando se compara con la de las células tratadas con paclitaxel solo (p & lt; 0.05; Fig. 1). Por otro lado, el androstenol agonista inverso reduce los efectos citotóxicos del paclitaxel en células E9 (P & lt; 0.05; Fig. 1). Estos resultados indican que la modulación específica de CAR por el TCPOBOP agonista mejora la eficacia antitumoral de paclitaxel en células de cáncer E9.
Se realizó este experimento en seis líneas celulares de cáncer de pulmón humano en el que el co-exposición de CAR humana ligandos se evaluó por su efecto sobre la citotoxicidad del paclitaxel. El agonista CAR CITCO mejora de forma significativa la eficacia de paclitaxel en cinco de las seis células de cáncer de pulmón humano ensayadas (p & lt; 0.05; Fig. 2). Por otro lado, el androstenol agonista inverso CAR dio lugar a diferencias significativas en todas las líneas celulares (p & gt; 0,05; Fig. 2). Estos resultados demuestran que los agonistas CAR mejorar el efecto antineoplásico de paclitaxel en la mayoría de líneas celulares de cáncer de pulmón (ratón y seres humanos), por lo que un enfoque interesante para una caracterización adicional.
La viabilidad celular después de 48-agonista Androstenol en combinación con paclitaxel. CITCO potencia la citotoxicidad paclitaxel significativamente en cinco de las seis líneas celulares (* P & lt; 0,05 - dos vías ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey para el efecto del tratamiento). Por otro lado, androstenol en combinación con paclitaxel no tiene ningún efecto en comparación con las células tratadas con paclitaxel.
El paclitaxel aumenta la expresión MCAR
Seguidamente, evaluó wheter paclitaxel expresión alterada de genes MCAR. Con este fin, expusimos E9 células a los siguientes tratamientos diferentes: 10 M de TCPOBOP, 10 M de androstenol, la IC50 de paclitaxel, o una combinación de éstos. Nuestros resultados mostraron que un solo tratamiento con TCPOBOP o androstenol no tuvo ningún efecto sobre la expresión mRNA MCAR (Fig. 1). Sin embargo, cuando las células fueron tratadas con paclitaxel solo o en combinación con TCPOBOP o androstenol, un aumento en la expresión MCAR fue visto independiente del ligando (p = 0,0102; Fig. 1).
TCPOBOP y paclitaxel alteran supresor de tumor y los niveles de expresión de oncogenes
Otros experimentos se llevaron a cabo sólo con la línea celular de cáncer de pulmón de ratón E9. Se evaluaron los efectos de TCPOBOP y paclitaxel en el perfil de expresión génica de 84 oncogenes y genes supresores de tumores. Inicialmente, cinco genes se cortaron-off de análisis debido a que presentan CT valores superiores a 35 y /o se ha detectado la presencia de más de un producto PCR. De los 79 genes restantes, el tratamiento paclitaxel alterada la expresión de 10 genes, con cambios veces de más de 2 (Tabla 2). De acuerdo con las agrupaciones de genes funcionales a partir de la matriz Rt2 Profiler PCR, paclitaxel mayoría de genes regulados hasta-eran genes supresores de tumores, genes relacionados con la apoptosis, oncogenes o genes que las propiedades actuales de los oncogenes y genes supresores de tumor (Tabla 2).
la exposición de las células al ligando E9 CAR ratón TCPOBOP aumentó la expresión de los genes supresores tumorales dos: MGMT y WT1 (Tabla 2). Curiosamente, cuando se evaluó la expresión de genes de las células tratadas con TCPOBOP más paclitaxel (con la misma concentración que aumenta la citotoxicidad paclitaxel), la expresión de estos dos genes se mejoró aún más que cuando se administraron solamente paclitaxel o TCPOBOP, lo que sugiere un efecto aditivo sobre la la expresión génica de estos genes. Además, la combinación de TCPOBOP más paclitaxel dio lugar a la regulación a la baja de dos oncogenes, ZHX2 y ESR1 (Tabla 2). Por otra parte, parece que la exposición combinada de las células E9 a TCPOBOP y paclitaxel aumentó la expresión de genes firma paclitaxel inducida (Tabla 2). Tomados en conjunto, estos resultados están de acuerdo con las propiedades de los moduladores descritos anteriormente y explicar de la TCPOBOP agonista MCAR sobre el efecto antitumoral de paclitaxel en células de cáncer de pulmón de ratón.
En silico análisis muestra que el paclitaxel y TCPOBOP encajar en la estructura MCAR
Alineación de 1XLS y la estructura 1XNX mostró que el posicionamiento de la TCPOBOP agonista y el androstenol agonista inverso en la estructura MCAR son distintas (Fig. 3). El acoplamiento de TCPOBOP se realizó como un control, y se mostró una buena superposición de TCPOBOP en la estructura cristalina de 1XLS (Fig. 3). El soporte para el uso de la estructura 1XLS reveló que el androstenol agonista inverso no podía unirse a la posición de la TCPOBOP agonista; androstenol mostró una rejilla de energía positiva (51,82) que es desfavorable para unirse en el interior del receptor. La red de energía de TCPOBOP y paclitaxel son respectivamente -49,34 -125,53 y. Por otra parte, de acoplamiento con la estructura 1XNX para guiar la mejor energía a la interacción receptor-ligando señaló a un posible segundo sitio en el receptor CAR para TCPOBOP de unión (Fig. 3) con una red de energía favorable (-32,01), similar a la obtenida para el androstenol (-40,44). El paclitaxel también mostró la energía más favorable y cerró los valores de unión de bind en ambas estructuras en las que se utilizaron TCPOBOP o androstenol como ligando guía de acoplamiento (Tabla 3), lo que indica que el paclitaxel podría ser también un ligando MCAR.
A , D-Androstenol; B, E-Paclitaxel; C, F-TCPOBOP; G y H * androstenol y superposición TCPOBOP: vista de la superficie G y H vista de alambre de ligandos. Tenga en cuenta que el paclitaxel atracado en ambas estructuras MCAR.
caracterización CAR humano en muestras de cáncer de pulmón de células no pequeñas de dos estudios independientes
Nos caracteriza el estado de hCAR en NLSLC a partir de dos estudios con datos disponibles al público a través de TCGA. En el estudio de adenocarcinoma, de 230 muestras, el 17,8% de los casos (41/230) presentaron alteraciones genéticas de hCAR, incluyendo el número de copia alteraciones (CNA), mutaciones o la expresión de genes alterados (Fig. 4). Estas alteraciones no se asociaron con la supervivencia global (OS, p = 0,40, Fig. S2). La mayoría de las muestras de este estudio presentó con un aumento de la metilación hCAR según el análisis HM450 (Fig. 4). Corroborar estos datos, sólo el 8% de los casos (19/230) presentaron la regulación positiva de hCAR ARNm.
alteraciones y frecuencia de hCAR en el estudio de adenocarcinoma de pulmón disponible de TCGA genéticos (A). (B) Los mismos datos del estudio de carcinoma de células escamosas de pulmón disponible en TCGA. (C) metilación del ADN vs expresión génica de hCAR partir de muestras de adenocarcinoma de pulmón de TCGA. (D) la metilación del ADN frente a la expresión de genes de hCAR de pulmón escamosas muestras de carcinoma de célula de TCGA. Ambos conjuntos de datos presentan altamente metilación del ADN y niveles variables de expresión de ARNm de NR1I3
A continuación, se utilizó la información de otro estudio del TCGA sobre el carcinoma de células escamosas de pulmón (LSCC, TCGA, datos provisionales -. 04/26 /2014). La frecuencia de las alteraciones HCAR incluyendo mutaciones, CNA o expresión de genes alterados (Fig. 4), fue 8,2% (40/489), que no se asoció con OS (p = 0,81, Fig. S1). Al igual que en el estudio adenocarcinoma, la mayoría de las muestras presentó con un aumento de la metilación del ADN de hCAR (Fig. 4). Esto puede explicar por qué sólo 7,4% de todos los casos presentados con la regulación positiva de hCAR mRNA (36/489).
Basándose en los resultados de ambos estudios, es posible que la mayoría de las muestras de adenocarcinoma de pulmón y LSCC los pacientes no presentan alteraciones en la expresión hCAR en relación con el tejido emparejado, no canceroso, lo que podría explicarse por los altos niveles de metilación que se encuentra en ambos estudios.
Discusión
el cáncer de pulmón sigue ser un problema importante para los sistemas de atención de la salud en todo el mundo, como la mayoría de los casos se trata de pacientes con la función compuesta de pulmón, metástasis, resistencia a múltiples fármacos y malos resultados. La supervivencia de los pacientes con cáncer de pulmón después de la detección del tumor suele ser inferior al 5% a los cinco años [35]. Recientemente, la evidencia ha comenzado a mostrar que automóvil podría tener un papel en la terapia del cáncer [19], [20]. Aquí demostramos que la modulación CAR específica por los agonistas, pero no por agonistas inversos, el aumento de la eficacia antitumoral de paclitaxel tanto en las células de cáncer de pulmón murino y humanos. Este efecto fue acompañado por la potenciación de una expresión genética paclitaxel inducida cuando se utiliza una combinación de paclitaxel y TCPOBOP. Además, una sola exposición de las células cancerosas a TCPOBOP aumentó la expresión de dos genes supresores de tumores (WT1 y MGMT), que podría corroborar la eficacia mejorada de paclitaxel en líneas celulares de cáncer. tratamiento con paclitaxel aumentó la expresión de genes CAR y atracó en la estructura molecular del CAR
in silico
. Por último, analizamos el perfil de hCAR en dos estudios TCGA y señaló que CAR podría ser un objetivo interesante para los pacientes con CPNM que reciben tratamiento con paclitaxel desde hCAR se expresa en muestras tumorales y no tiene asociación con el sistema operativo.
Chen
et al.
ligandos CAR hace poco considerada como una opción prometedora para la quimioterapia combinada, con el objetivo de superar la MDR en células de cáncer [6]. Nuestros resultados apoyan esta proposición ya que los ligandos CAR no causaron efectos citotóxicos de por sí en las células cancerosas; Sin embargo, cuando se utilizaron los agonistas coche en combinación con paclitaxel, un efecto modulador interesante surgió. Este efecto citotóxico mejorada también se observó en cinco de los seis diferentes líneas celulares de cáncer humano desde CITCO, el agonista hCAR, mostró un efecto similar en eficacia paclitaxel. Por lo tanto, apoyamos la hipótesis de Chen
et al.
Que la modulación coche podría de hecho ser importante para la quimioterapia del cáncer [6].
El papel exacto de la CAR en la carcinogénesis y la terapia del cáncer sigue siendo una asunto de debate. Por un lado, el coche es esencial para la promoción de tumores de hígado por fenobarbital en ratones [18] y se regula la tumorigénesis en respuesta al estrés xenobióticos [36]. En el otro lado, Wang et al. CAR se describe como una nueva diana terapéutica que facilita la ciclofosfamida (CPA) de tratamiento basado de tumores malignos hematopoyéticos [20], y donde llegaron a la conclusión de que la activación CAR facilita la quimioterapia basada en CPA promoviendo selectivamente su bioactivación. En otro estudio, se demostró CITCO para apuntar células madre tumor cerebral, la inhibición de su crecimiento y expansión [19]. Ambos documentos sugieren el uso de agonistas de coche para el tratamiento de enfermedades malignas de la sangre y los cánceres de cerebro, respectivamente.
Como se dijo anteriormente, el paclitaxel induce la apoptosis en células proliferantes. Aquí, el paclitaxel induce la muerte celular en todas las líneas de ratón y de células de cáncer humano, con valores de IC50 únicos para cada uno de ellos. Incluso después de considerar que estas células presentan diferencias en su resistencia a paclitaxel (≈3600x), los agonistas CAR mejorarse la eficacia de paclitaxel en casi todas las líneas celulares de cáncer (6/7). Por otro lado, la Androstenol agonista inverso no dio lugar a ningún efecto sobre la citotoxicidad del paclitaxel en la mayoría de las células, y se atenúa el citotóxico de paclitaxel en una línea celular. Estos resultados llevan a la conclusión de que deben considerarse únicamente como agonistas del coche para mejorar el tratamiento del cáncer de NSCLC.
Los efectos de los agonistas coche en la eficacia antitumoral de paclitaxel fueron similares en ambos ratón y células humanas. Por lo tanto, centrado nuestros experimentos en el modelo de ratón por dos razones: tenemos más experiencia con este modelo [37], [38] y todas las técnicas utilizadas en el modelo de ratón eran de rutina en el laboratorio. Además, el uso de líneas celulares de cáncer epitelial de pulmón de ratón se ha establecido durante más de 30 años y ha presentado resultados similares a los obtenidos con líneas celulares humanas [23]. Por lo tanto, también hemos demostrado en este
in vitro
modelo de ratón en el que la expresión génica de paclitaxel aumenta coche en la IC50, independientemente de su asociación con ligandos CAR. Uno podría esperar que los ligandos MCAR deben modular la expresión génica MCAR, pero nuestros resultados no mostraron este efecto. activación del coche por ligandos específicos no siempre alteró la expresión de genes coche o los niveles de proteína, pero todavía puede dar lugar a un aumento de su actividad transcripcional.
La expresión de CAR en las células cancerosas de ratones tratados con ligandos coche solo, paclitaxel solo , o una combinación de ambos, reveló que el paclitaxel aumentó la expresión génica de CAR independiente de su asociación con TCPOBOP o androstenol. En consecuencia Coincidiendo con este resultado,
in silico
análisis de acoplamiento de TCPOBOP, Androstenol y paclitaxel en la estructura de la proteína CAR demostró que el paclitaxel cabe en el bolsillo de unión a ligando de receptor de MCAR, lo que podría aumentar la expresión del coche por la retroalimentación positiva. Ningún efecto sobre la expresión génica CAR se observó después de la exposición CAR ligandos, un hecho que corrobora con la ausencia de citotoxicidad por estos ligandos
.
Otro resultado interesante apoyar el efecto modulador de los agonistas CAR sobre la eficacia del paclitaxel fue la potenciación de la de paclitaxel firma la expresión de genes, aumentando la expresión de algunos genes supresores de tumores y la disminución de la expresión de dos oncogenes. Curiosamente, el tratamiento con TCPOBOP solo también indujo la expresión de los genes supresores tumorales dos MGMT y WT1. MGMT promotor de la metilación es un factor pronóstico más fuerte que la edad, estadio y el grado tumoral para los gliomas [39].