Extracto
Antecedentes
El presente estudio se realizó para caracterizar el efecto de anti-metabolitos en la inducción de la señalización de CXCL8 y determinar si la señalización de CXCL8 constitutiva y /o inducida por fármacos en el cáncer de próstata metastásico (CaP) células modula su sensibilidad a esta clase de agente.
Métodos
La respuesta de las células de CaP metastásico a 5-fluorouracilo (5-FU), pemetrexed o Tomudex se determinó usando ensayos de recuento de células, citometría de flujo y análisis de escisión de PARP. PCR cuantitativa, se empleó ELISA e inmunotransferencias para determinar los efectos de las drogas o la administración CXCL8 sobre la expresión génica diana /proteína.
Resultados
La administración de 5-FU, pero no la secreción de CXCL8 potenciada pemetrexed y aumentó la expresión de genes CXCR1 y CXCR2 en células PC3 metastásicos. Consistente con esto, la inhibición de CXCL8 de señalización usando un antagonista de CXCR2, AZ10397767, el aumento de la citotoxicidad de 5-FU por 4 veces (P & lt; 0,001), y el aumento de la apoptosis inducida por 5-FU en las células PC3 (P & lt; 0,01). Por el contrario, mientras que la administración de AZ10397767 no tuvo efecto sobre la sensibilidad de pemetrexed, el antagonista de CXCR2 ejercido el mayor efecto en el aumento de la sensibilidad de las células PC3 a Tomudex, un inhibidor dirigido timidilato sintasa (TS). Experimentos posteriores confirmaron que la administración de CXCL8 humano recombinante aumento de la expresión de TS, una respuesta mediada en parte por el receptor CXCR2. Por otra parte, desmontables siRNA mediada del gen CXCL8 diana Bcl-2 aumentó la sensibilidad de las células PC3 a 5-FU.
Conclusiones
señalización CXCL8 proporciona una resistencia selectiva de las células de cáncer de próstata metastásico a antimetabolitos específicos mediante la promoción de una resistencia asociado a la diana, además de que sustenta una evasión de la apoptosis inducida por el tratamiento
Visto:. Wilson C, Maxwell PJ, Longley DB, Wilson RH, Johnston PG, Waugh DJJ (2012) constitutiva e inducida por el tratamiento CXCL8-señalización selectiva Modula la eficacia de la terapéutica anti-metabolitos en cáncer de próstata metastásico. PLoS ONE 7 (5): e36545. doi: 10.1371 /journal.pone.0036545
Editor: Kin Lau Mang, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: December 20, 2011; Aceptado: April 10, 2012; Publicado: 9 Mayo 2012
Derechos de Autor © 2012 Wilson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue con el apoyo de una beca de investigación sin restricciones de la Fundación del cáncer de Ulster (DJJW y PGJ) y un premio de doctorado estipendio (CW) del Departamento de Empleo y Capacitación, Irlanda del Norte. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el tratamiento del cáncer de próstata metastásico resistente a la castración avanzada (CRPC) sigue siendo una necesidad insatisfecha clínica significativa. La reciente aprobación de abiraterona acetato como tratamiento de segunda línea en CRPC es un avance importante, sin embargo, este agente que se dirige a la vía de síntesis de andrógenos sólo proporciona una mejora limitada en la supervivencia global y sólo los pacientes con un buen beneficio estado funcional de su prestación [1], [2]. Muchos pacientes no cumplirán el estado de rendimiento preferencial que es óptimo para la respuesta de abiraterona. Por otra parte, muchos tumores serán resistentes a la abiraterona en el tratamiento de segunda línea. En consecuencia, esto obliga a que los esfuerzos para ampliar el arsenal de agentes disponibles para los médicos que tratan CRPC no está relajado. Tales esfuerzos no deben limitarse exclusivamente al descubrimiento de nuevos agentes, pero deben explotar nuestro conocimiento constante de la biología de la enfermedad para definir mecanismos de resistencia e identificar nuevos agentes que pueden ser explotadas para mejorar la eficacia de los agentes de quimioterapia existentes.
la quimioterapia convencional ha sido en gran medida ineficaz en el tratamiento de la CRPC; docetaxel sigue siendo el agente de quimioterapia único de haber obtenido la aprobación para CRPC, sobre la base de una mejora limitada en la supervivencia general [3]. El anti-metabolito 5-FU ha sido un pilar de la quimioterapia tumor sólido durante más de cinco décadas; al entrar en la célula, 5-FU se convierte en tres metabolitos activos, trifosfato de fluorouridina (FUTP), trifosfato de flurodeoxyuridine (FdUTP) y monofosfato flurodeoxyuridine (FdUMP), que son mis-incorporados en ARN, promover el daño del ADN, o contribuye a la inhibición de la enzima timidilato sintasa, respectivamente [4]. Recientes estudios de fase II de 5-FU y su análogo capecitabina por vía oral han demostrado que no son seguros en el tratamiento de segunda línea para CRPC metastático, con respuestas modestos observados cuando se administra en combinación con docetaxel u oxaliplatino [5], [6]. Aunque estos siguen siendo claramente respuestas subóptimas, la capacidad para apuntar rápidamente la proliferación de células de CaP mediante la inducción de un bloque de la fase S y, posteriormente, la apoptosis inducción sigue siendo un escenario terapéutico atractivo, especialmente en tumores que se han vuelto refractarios a la terapia anti-andrógenos.
células de cáncer de próstata están sujetos a una pronunciada autocrina de señalización de estímulo CXCL8, que aumenta con el estadio de la enfermedad y es máxima en la enfermedad resistente a la castración [7], [8]. La magnitud de la señalización de CXCL8 es potenciada por factores ambientales tales como la hipoxia [9] y las tensiones inducidas químicamente incluyendo la exposición a los agentes de quimioterapia [10], [11], que regulan al mismo tiempo la expresión del ligando y los receptores a través de la que media su biológica efectos, es decir, CXCR1 y CXCR2. CXCL8 promueve la progresión de castrar-resistencia a través de la activación independiente de ligando del receptor de andrógenos (AR) [12], [13] e induce la proliferación de células de cáncer de próstata metastásico [7], [14] (). Además, hemos demostrado que la señalización de CXCL8 inducida por el estrés atenúa la sensibilidad de las células de cáncer de próstata para someterse a apoptosis en respuesta a agentes que dañan el ADN [9], [10] inhibidores, dirigida-Hsp90 [15], agonistas del receptor de muerte (TRAIL) [11] y la terapéutica como bicalutimide (Casodex) [13] AR-dirigido
.
el objetivo de este estudio fue determinar la forma en la señalización de CXCL8 intrínseca y /o inducida por el tratamiento-modula la respuesta de las células a CRPC contra -metabolites.
Materiales y Métodos
química y Reactivos
Todos los productos químicos eran fuente de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario. 5-FU se obtuvo de Bridgewater quimioterapia Suite, Belfast City Hospital. El pemetrexed fue una especie de regalo del Dr. Dean Fennell (CCRCB, QUB, Belfast, Reino Unido). AZ10397767 fue proporcionado amablemente por el Dr. Simon T. Barry y el Dr. David Blakey (AstraZeneca, Alderley Park, Cheshire, Reino Unido).
se cultivaron como se ha descrito anteriormente Cell Cultura y
células cancerosas de próstata PC3 [10]. En posteriores experimentos que investigan la señalización de CXCL8, las células PC3 se incubaron en RPMI libre de suero 1640 por 16 h antes de la exposición a 3 nM recombinante humano (rh) -CXCL8 (Peprotech, Londres, Reino Unido).
Los agentes citotóxicos
5-FU y pemetrexed se almacenaron a 4 ° C hasta 10 mM de soluciones madre. Las diluciones en serie se prepararon en agua de inyección estéril y se añadieron fármacos directamente a las células para producir la concentración deseada del agente citotóxico. En el caso del tratamiento con 5-FU, las células se mantuvieron y se tratan en medio que contiene FCS dializado.
siRNA Transfections
siRNA transfections se llevaron a cabo como se describe anteriormente [11]. Las células (5 × 10
5) se lavaron dos veces en PBS estéril y después se incubaron con una mezcla de transfección que comprenden medio OptiMEM, oligofectamine (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), y el oligonucleótido específico (Bcl-2 200 nM; Dharmacon Inc) durante 48 horas a 37 ° C. Una secuencia no se incluyó la orientación en estos experimentos en la misma concentración que la secuencia de siRNA utilizado.
Cell Count Análisis
Las células (1 × 10
5 células /pocillo) se les permitió adherir durante la noche. Se reemplazó el medio con medio fresco RPMI 1640 y se trató con una gama de concentraciones de 5-FU o pemetrexed en ausencia o presencia de AZ10397767 (20 nM). Las células fueron incubadas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 ambiente durante 72 h, después se trataron con tripsina y se contaron usando un Coulter Z
TM Series recuento de partículas y analizador de tamaño (Beckman Coulter, Miami, FL) como descrito anteriormente [10]. El número de células se normalizaron a los valores de control y análisis estadísticos de los datos realizaron utilizando el software GraphPad Prism 3.0.
Citometría de Flujo
se evaluó el análisis del ciclo celular mediante yoduro de propidio tinción de las células como se describe anteriormente [ ,,,0],10].
inmunotransferencia
se prepararon lisados de células enteras, resuelven y se transfirieron como se describe anteriormente [7]. Las membranas se lavaron en solución salina tamponada con Tris /0,1% de Tween-20 (TBS-T) después se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en 5% de albúmina de suero bovino /TBS-T (BSA /TBS-T). Las membranas se probaron con anticuerpos primarios a Bcl2 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), TS (Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA) o PARP (eBiosciences Inc., San Diego, CA, EE.UU.). Las membranas se lavaron tres veces en TBS-T y luego se incubaron con una peroxidasa de rábano picante (HRP) itrio anticuerpo secundario (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK). Después de tres lavados en TBS-T se detectaron las bandas con un aumento de quimioluminiscencia (ECL plus reactivos, Amersham Biosciences). Las membranas se volvieron a sondar con anticuerpos GAPDH para garantizar la igualdad de carga (Biogénesis, Dorset, Reino Unido).
cuantitativa en tiempo real se cosechó PCR (qPCR)
ARN como se describe anteriormente [9]. Por PCR en tiempo real, 1 g de ARN total fue de oligo (dT) a transcripción inversa utilizando MMLV-RT (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. 50 ng de ADNc se mezcló con los cebadores (2 nM), agua estéril y mezcla maestra SYBR Green PCR (Roche Diagnostics, Sussex, Reino Unido). se informaron como anteriormente las secuencias de cebadores [9]. PCR en tiempo real se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos usando un instrumento luz LC480 ciclador (Roche Diagnostics). El ciclo umbral (C
P) se calculó para cada reacción por el sistema LC480. los niveles de expresión desconocidas se determinaron utilizando el método de la curva estándar relativa y normalizado contra el 18S.
ELISA
Se determinó la cantidad de CXCL8 secretada detectada en el medio de las células de cáncer de próstata utilizando un ensayo ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit Pelikine compacto CXCL8 ELISA, Beckman Coulter, High Wycombe, Reino Unido) como se describe anteriormente [9]. La concentración de CXCL8 en cada muestra se calculó por comparación con una curva estándar generada a partir de un vial de stock de CXCL8.
Resultados
5-FU potencia la señalización de quimioquinas en las células de CaP metastásico
La línea celular PC3 fue aislado originalmente a partir de una metástasis ósea del PAC y, por tanto, se considera que es un sistema modelo clínicamente relevante estudiar CaP avanzado [16]. Dado que estudios previos han demostrado agentes quimioterapéuticos inducen la síntesis de CXCL8, nuestros experimentos iniciales se centraron en la caracterización de los efectos de la administración de anti-metabolitos sobre la secreción de esta quimiocina. Además de usar 5-FU, nuestros experimentos iniciales también se realizaron utilizando pemetrexed, una de objetivos múltiples anti-folato que inhibe la timidilato sintasa (TS), dihidrofolato reductasa (DHFR), y glicinamida ribonucleótido formiltransferasa (GARFT), todas las enzimas implicadas en la
de novo
biosíntesis de timidina y purina nucleótidos [17]. Un ELISA específico se utilizó para cuantificar la secreción de CXCL8 a partir de células PC3 durante un transcurso de tiempo de 8 horas, la comparación de los controles coincidentes en el tiempo a partir del 5-FU-tratadas o células tratadas con pemetrexed. La administración de 5-FU promueve un aumento significativo en la secreción de CXCL8 a partir de células PC3 (P & lt; 0,05) (Figura 1A). Sin embargo, la administración de pemetrexed tuvo efectos insignificantes sobre la secreción de CXCL8 (Figura 1B). Para verificar nuestras observaciones, los experimentos se repitieron en la línea celular LNCaP de cáncer de próstata; adición de 1 M 5-FU también aumentó los niveles de CXCL8 secretadas de esta línea celular (Figura 1C)
.
(A) gráfico de barras que representa el nivel de secreción de CXCL8 después del tratamiento de células PC3 con 1 M 5- FU. Los valores mostrados se representan con relación a un control de tiempo de concordancia y representan la media ± S.E.M. de tres experimentos independientes. (B) Como en A, excepto que las células se trataron con 1 M pemetrexed. Las diferencias en la expresión de CXCL8 entre el control coincidentes en el tiempo y las muestras tratadas con el fármaco se analizaron mediante la prueba t de Student de dos colas; *, P & lt; 0,05. (C) Gráfico de barras que representa los niveles de secreción de CXCL8 después del tratamiento de las células LNCaP con 1 M 5-FU. Los valores mostrados se representan con relación a un control de tiempo de concordancia y representan la media ± S.E.M. de tres experimentos independientes.
Los efectos de 5-FU y la administración de pemetrexed partir de su expresión de los receptores de CXCL8 también se estudiaron mediante análisis de PCR cuantitativa. La administración de 5-FU había pronunciado y efectos sobre la expresión génica tanto de CXCR1 (Figura 2A, panel izquierdo) y CXCR2 (Figura 2B, panel izquierdo) sostenido, el aumento de los niveles de transcripción por factores de 8 y 15 veces, respectivamente. En contraste, la administración de pemetrexed tuvo un efecto transitorio y mínimo de la expresión de genes de cualquier receptor. Otros experimentos confirmaron que la administración de 5-FU también aumentó los niveles de transcripción CXCR1 y CXCR2 en células LNCaP (Figura 2A /B, paneles de la derecha), aunque la respuesta fue considerablemente más selectivo para CXCR2 en esta línea celular.
(A ) gráfico de barras que presenta el cambio dependiente del tiempo en los niveles de transcripción CXCR1 en células PC3 (panel izquierdo) y las células LNCaP (panel derecho) como se detecta por análisis de qPCR después del tratamiento con 1 mM 5-FU (barras negras) o 1 M pemetrexed (abierto bares - células PC3 solamente). La expresión se presenta como un factor de cambio en relación con los niveles de expresión de genes detectados en células no tratadas. (B) Como en A, excepto que los datos muestra el nivel de expresión génica detectada para CXCR2. Datos que se muestra es la media ± S.E.M. de cuatro experimentos independientes. Estadísticamente se determinaron diferencias significativas utilizando una prueba t de dos colas Estudiantes (*, p & lt; 0,05).
La inhibición de la señalización de CXCL8 potencia la eficacia de 5-FU en células de CaP metastásico
se emplearon ensayos de recuento de células para caracterizar la citotoxicidad relativa de 5-FU o pemetrexed en células PC3 y para determinar si la señalización de CXCL8 intrínseca inducida por drogas o afectó a la sensibilidad a estos agentes. La inhibición de la señalización de CXCL8 se efectuó utilizando un antagonista del receptor CXCR2 selectiva, AZ10397767. células PC3 sólo eran sensibles a 5-FU en concentraciones superiores a 1 mM (Figura 3A). La adición de AZ10397767, que se utiliza a una concentración final de 20 nM con el fin de ejercer su selectividad por el receptor CXCR2 aumentó la potencia de la citotoxicidad inducida por 5-FU en células PC3. análisis de regresión no lineal de los datos confirmó que la inhibición de la señalización de CXCR2 mejora la potencia de 5-FU por 3,8 veces, el aumento de la IC calculado
30 valor de 4,2 M a 1,1 M (n = 4). El análisis adicional de los datos determinó que la adición de AZ10397767 a 5-FU fue sinérgica por un valor RI calculada de 1,2, mientras que el análisis ANOVA confirmó una fuerte interacción sinérgica entre 5-FU y AZ10397767 (P & lt; 0,0001). Del mismo modo, la administración de AZ10397767 aumentó la sensibilidad de las células LNCaP a 5-FU. La represión de la señalización de CXCR2 no tuvo ningún efecto en el aumento de la respuesta máxima de la terapia de 5-FU en cualquier línea celular. En contraste, la administración del antagonista de CXCR2 no aumentó la potencia o la respuesta máxima de pemetrexed en las células PC3 (Figura S1). La potencia de pemetrexed en estos ensayos se calculó como 0,27 M.
gráficos (A) que ilustran los datos de ensayo de recuento de células, determinadas a partir del tratamiento de las células PC3 (panel izquierdo) o células LNCaP (panel derecho) con concentraciones crecientes de cualquiera de 5-FU, en ausencia o en presencia del antagonista del receptor CXCR2, AZ10397767. AZ10397767 se administró a una concentración final de 20 nM. Los recuentos de células se tomaron 72 horas después del tratamiento con el anti-metabolito. datos de recuento celular se analizó usando la función de regresión no lineal de GraphPad Prism, usando un sigmoidal de un sitio de curva de ecuación de ajuste. Los puntos de datos mostrados son la media ± S.E.M. valor de cuatro experimentos independientes. (B) Gráfico de barras que ilustra el efecto de la utilización de siRNA a desmontables CXCR1 y CXCR2 expresión sobre la citotoxicidad de 1 M 5-FU en PC3 (panel izquierdo) y las células LNCaP (panel derecho). Los puntos de datos mostrados son la media ± S.E.M. valor de cuatro experimentos independientes. (C) Gráfico de barras que presenta el nivel de células apoptóticas en PC3 tratado con fármaco (panel izquierdo) y LNCaP (panel derecho) poblaciones de células. Los datos muestran la población sub G0 /G1 de células determinado por citometría de flujo análisis después del tratamiento con concentraciones crecientes de 5-FU, en ausencia y en presencia del antagonista del receptor CXCR2, AZ10397767.
Como un adicional de la validación de los resultados obtenidos con el antagonista de CXCR2, que emplea un siRNA-estrategia para reprimir la expresión del receptor. A pesar de utilizar secuencias comerciales que afirman ser selectivo para CXCR1 o CXCR2 desmontables, posterior análisis de RT-PCR determina significativa baja regulación del receptor de reciprocidad en el PC3 y LNCaP células. Independientemente, la regulación por disminución de la expresión de CXCR1 y CXCR2 dio lugar a una mayor pérdida de la viabilidad celular PC3 y LNCaP en presencia de 1 mM 5-FU (Figura 3B).
Citometría de flujo análisis confirmó que la inhibición de CXCR2 señalización potenció la apoptosis inducida por 5-FU tanto en células LNCaP y PC3. En relación con las células de control sin tratar, un aumento en la concentración de 5-FU a partir de 1 mM a 10 mM dio como resultado un aumento de la acumulación de células en la fase S del ciclo celular (Figura S2) y la detección de un aumento del porcentaje de células en la fase sub G0 /G1 (Figura 3C). Además de AZ10397767 solo a las células PC3 produjo ningún efecto observable en cualquier fase del ciclo celular en el punto de tiempo de 72 h. Sin embargo cuando se combina con 1 M 5-FU, AZ10397767 disminuyó la acumulación de las células detenidas en la fase S del ciclo celular, mientras que al mismo tiempo aumentar el nivel de células apoptóticas observadas (p & lt; 0,0045). (Figura S2)
señalización de CXCL8 promueve una resistencia asociado a la diana en 5-FU
la timidilato sintasa (TS) expresión es un determinante clave de 5-FU sensibilidad [18], [19]. El aumento de la sensibilidad de las células a 5-FU después de la represión de la señalización de CXCL8 nos llevó a investigar si la señalización de CXCL8 regula la expresión de esta enzima en células de CaP. células PC3 y LNCaP células fueron estimuladas con cada uno de 3 nM recombinante humano CXCL8 (rh-CXCL8) para un máximo de 8 h. la expresión del gen TS se analizó inicialmente mediante PCR cuantitativa; que confirmó un aumento en exceso de 4 veces en ambas líneas celulares después de la estimulación con rh-CXCL8 (Figura 4A). La expresión de la enzima TS también se analizó mediante inmunotransferencia. La estimulación con rhCXCL8 en un corto tiempo de curso confirmó un aumento inmediato en la expresión de TS en las células PC3 (Figura 4B). Además, en consonancia con el aumento de los niveles de transcripción de ARNm, se observó una respuesta más tarde de la administración de CXCL8, donde se muestran TS niveles de expresión para aumentar en el tiempo señala a 8 h en células PC3 (Figura 4C, panel izquierdo) y las células LNCaP (Figura 4C, panel derecho).
(a) gráfico de barras que presenta el cambio dependiente del tiempo en los niveles de transcripción de TS en las células PC3 (panel izquierdo) y las células LNCaP (panel derecho) como se detecta por análisis de qPCR después del tratamiento con 3 rhCXCL8 nM. La expresión se presenta como un factor de cambio en relación con los niveles de expresión de genes detectados en células no tratadas. (B) inmunotransferencia que demuestra el efecto de la administración de 3 nM rhCXCL8 sobre el nivel de expresión de TS en las células PC3, detecta hasta 1 h después de la estimulación de las células. (C) inmunotransferencia que ilustra el nivel de expresión de TS detectado en las células PC3 (panel izquierdo) y las células LNCaP (panel derecho) de hasta 8 h después de la estimulación de las células con rhCXCL8. La igualdad de carga de proteína en cada una de las transferencias representativas mostradas en (B) y (C) se confirmó por la re-sondeo de las membranas para detectar la expresión de GAPDH. Estadísticamente se determinaron diferencias significativas utilizando una prueba t de dos colas Estudiantes (***, p & lt; 0,001).
A continuación examinó la forma en la inhibición de la señalización afectada CXCR2 expresión de TS. La adición de AZ10397767 a las células PC3 atenuó el aumento CXCL8 inducida en TS niveles de transcripción de genes (Figura 5A) y la reducción de los aumentos CXCL8-promovido en la proteína TS (Figura 5B). Dada la asociación de CXCL8 y CXCR2 a la regulación de la expresión de TS, se analizó el efecto de CXCL8 señalización sobre la eficacia de TOMUDEX (TDR), un inhibidor potente y TS-Directed terapéutico. células PC3 eran marcadamente insensibles a TDX incluso a altas concentraciones del fármaco. Sin embargo, como se observa con 5-FU, la potencia de TDX se incrementó notablemente por la co-administración del antagonista de CXCR2 AZ10397767 (Figura 5C, panel izquierdo). análisis de regresión no lineal de los datos de recuento de células confirmó que la potencia (IC30) de TDX se incrementó en 37 veces, de 1,1 M a 30 nM en presencia de AZ10397767. La interacción entre AZ10397767 y TDX era fuertemente sinérgica, determinó a través de dos métodos de análisis estadístico (RI = 1,4, ANOVA P & lt; 0,0001). Nuestros datos también demuestran que la respuesta máxima a TDR se incrementa ligeramente en la presencia del antagonista de CXCR2. En contraste, las células LNCaP fueron mucho más sensibles a TDX solo, y en consecuencia, la sensibilidad no se podría mejorar aún más mediante la adición del antagonista de CXCR2 (Figura 5C, panel derecho).
(A) Gráfico de barras que ilustra la efecto del inhibidor de CXCR2 en aumento CXCL8-promovido en los niveles de transcripción de TS en las células PC3 como se detectó por análisis de qPCR. El inhibidor se añadió durante la noche y las células estimuladas con 3 nM rhCXCL8 por 8 h. (B) Un inmunoblot representativo que ilustra el impacto de la AZ10397767 inhibidor de CXCR2 en la expresión de TS en condiciones no estimuladas y estimuladas con CXCL8. AZ10397767 se añadió durante la noche y las células estimuladas con 3 nM rhCXCL8 por 8 h. (C) Gráfico que ilustra los datos del ensayo de recuento de células, determinadas a partir del tratamiento de las células PC3 (panel izquierdo) y las células LNCaP (panel derecho) con concentraciones crecientes de Tomudex, en ausencia o en presencia del antagonista del receptor CXCR2, AZ10397767. Los recuentos de células se tomaron 72 horas después del tratamiento con el anti-metabolito. datos de recuento celular se analizó usando la función de regresión no lineal de GraphPad Prism, usando un sigmoidal de un sitio de curva de ecuación de ajuste. AZ10397767 se administró a una concentración final de 20 nM en todos los experimentos. Los puntos de datos mostrados son la media ± S.E.M. valor de tres experimentos independientes; * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01
La inhibición de Bcl-2, un objetivo CXCL8-transcripcional aguas abajo sensibiliza a las células de CaP a 5-FU
señalización de CXCL8
aumenta la expresión de varios anti-apoptótica genes incluyendo Bcl-2 [10]. Una estrategia interferentes pequeños ARN (ARNsi) se empleó para inhibir la expresión de Bcl-2. La inmunotransferencia confirmó un alto nivel de expresión endógena Bcl-2 en células PC3. La transfección de las células con una concentración final de un oligonucleótido-dirigida de Bcl-2 50 nM (Bcl-2-T) redujo pero no eliminó Bcl-2 expresión en las poblaciones de células no tratadas o tratadas con 5-FU. Curiosamente, se demostró que la exposición a la misma 5-FU para aumentar la Bcl-2 expresión en células PC3 (Figura 6A). Abajo de la regulación Bcl-2 solo tuvo un impacto marcado en la promoción de la apoptosis en células PC3 (aumentando a 8,5% y P & lt;. 0.001 en relación con control mezclado (SC) Mientras 1 M 5-FU tuvieron un impacto limitado en la inducción de la apoptosis, el tratamiento combinado con 1 M 5-FU y las Bcl-2 siRNA-oligonucleótidos aumento de la proporción de células apoptóticas a un valor medio de 10,7%, (P & lt; 0,01 con respecto a 5-FU tratamiento solo). (Figura 6B) el aumento de los niveles de apoptosis inducida por la baja regulación de Bcl-2 en ausencia y presencia de 5-FU se confirmó por la detección de un aumento de PARP división en experimentos de inmunotransferencia (Figura 6C) guía.
(a) por inmunotransferencia que presenta el nivel de expresión la proteína anti-apoptótica de Bcl-2 en células PC3 transfectadas con un oligonucleótido no focalización (Sc) o un oligonucleótido de gen-dirigida (Bcl2-T). Todos los oligonucleótidos se usaron a una concentración final de 50 nM. la expresión de Bcl-2 se presenta en la ausencia o presencia de 1 mM 5-FU. (B) gráfico de barras que presenta la población de células apoptóticas determinado por citometría de flujo análisis en células PC3 transfectadas con un oligonucleótido no focalización (Sc) o un oligonucleótido de gen-dirigida (Bcl2 -T) a una concentración final de 50 nM, en ausencia o presencia de 1 mM 5-FU. Las diferencias estadísticamente significativas en los niveles de apoptosis se determinó mediante la realización de análisis de la prueba t de Student de dos colas; *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01. (C) inmunotransferencia presentar el producto de expresión y la escisión de PARP en células PC3 transfectadas con un oligonucleótido no focalización (Sc) o un oligonucleótido de gen-dirigida (Bcl2-T), que se utiliza a una concentración final de 50 nM, en ausencia o presencia de 1 mM 5-FU. La igualdad de carga de proteínas en inmunotransferencias se muestran en (A) y (C) fue confirmada por volver a sondear las membranas para la expresión de GAPDH.
Discusión
CRPC es actualmente una enfermedad incurable. A pesar de la aparición de una nueva generación de inhibidores de la vía de señalización de andrógenos (por ejemplo abiraterona acetato y MDV3100) para su uso en pacientes CRPC contribuyan a mejorar los resultados para muchos pacientes, es evidente que será necesario un uso más informado de los agentes quimioterapéuticos convencionales mejorar los resultados clínicos de pacientes en los que estos nuevos medicamentos no son adecuados. 5-FU y su capecitabina analógica por vía oral se ha informado de que es seguro como tratamiento de segunda línea para metastásico CaP resistente a la castración, con respuestas modestos observados cuando se administra en combinación con docetaxel u oxaliplatino en pequeños ensayos fase II [5], [6 ]. El aumento de la respuesta a la quimioterapia de segunda línea es de suma importancia para prolongar la supervivencia global y la vida de calidad de los pacientes con enfermedad avanzada.
En este estudio hemos demostrado la importancia de la señalización de CXCL8 en el apuntalamiento de una novela modo de resistencia asociado a la diana que disminuye la sensibilidad de las células de CaP metastásico a 5-FU. expresión CXCL8 se eleva de forma nativa en metastásico o CRPC sobre el tejido normal o benigno de próstata [7], [8], [20]. Por otra parte, hemos confirmado que la exposición a 5-FU potencia este nivel de la señalización de CXCL8 mediante la inducción de la secreción de CXCL8 simultáneamente y hasta la regulación de la expresión génica CXCR1 y CXCR2 en células de cáncer de próstata metastásico. Es importante destacar que, la inhibición de la señalización de CXCL8 intrínseca e inducida por fármaco usando una pequeña molécula antagonista del receptor de CXCR2 resultó en un incremento estadísticamente significativo en la sensibilidad de las células CRPC a 5-FU. Mientras que exclusivamente se ha estudiado el papel de CXCL8 en la modulación de esta respuesta, nuestras observaciones utilizando el inhibidor de CXCR2 indican que los aumentos inducidos por el estrés en las quimiocinas CXC adicionales que también activan el receptor CXCR2 incluyendo CXCL1 y CXCL5 probablemente también contribuir a la resistencia terapéutica.
la expresión elevada de TS es un marcador biológico bien establecido de la disminución de 5-FU eficacia en tumores [18], [19]. La administración de 5-FU o CXCL8 solo ha demostrado aumentar los niveles de genes y proteínas TS. La estimulación con CXCL8 fue mostrado para promover dos fases de regulación. Se observó un rápido aumento en la expresión de TS en respuesta a la administración CXCL8, de acuerdo con nuestros estudios anteriores que caracterizan el papel de esta quimiocina en la regulación de la traducción de proteínas [14]. Esto fue seguido por un aumento de aparición tardía en la expresión de proteínas, de acuerdo con el aumento de CXCL8-promovido en la transcripción del gen de TS. La administración de un antagonista de CXCR2 se demostró para atenuar el aumento CXCL8 inducida en genes y expresión de proteínas los niveles de TS. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la señalización de CXCL8 se manifiesta una resistencia asociado a la diana a 5-FU en las células CRPC mediante el aumento de la expresión de TS. Esta conclusión se ve apoyada por nuestra observación de que la administración de un antagonista CXCR2 tuvo un profundo efecto en la sensibilización de las células PC3 a un inhibidor de TS-dirigidos directa, TOMUDEX.
Además, proponemos que la señalización de CXCL8 puede contribuir, además, una resistencia celular a 5-FU mediante el aumento de expresión de la proteína anti-apoptótica. Citometría de flujo y ensayos de escisión PARP demostraron que la acción protectora de la señalización de CXCL8 fue mediada por las células permitiendo de evadir la apoptosis inducida por quimioterapia. Hemos demostrado previamente que CXCL8 puede regular por incremento la expresión de anti-apoptótica en células de CaP, incluyendo la expresión de Bcl-2, y que la co-administración de AZ10397767 puede regular a la baja la expresión inducida por la quimioterapia de esta proteína [10], [11] . Proporcionamos evidencia adicional de que la supresión de la Bcl-2 puede aumentar el nivel de la apoptosis en 5 tratados con-FU células. Por lo tanto, la señalización de CXCL8 también puede contribuir a la resistencia de las células CRPC a 5-FU, facilitando un aumento en la expresión de inhibidores críticos de apoptosis.
Nuestro estudio revela un efecto muy distinto y específico del fármaco anti -metabolites en la señalización de CXCL8. Mientras que el 5-FU inhibe la actividad de TS, pemetrexed es un inhibidor de objetivos múltiples con efectos sobre tres enzimas dependientes del folato en los timidina y purina vías de síntesis de nucleótidos; TS, la dihidrofolato reductasa (DHFR), y glicinamida ribonucleótido formiltransferasa (GARFT) [17]. Mientras que 5-FU potenció la secreción de CXCL8 y el aumento de la expresión del receptor CXCL8 en células PC3, pemetrexed tuvo efectos insignificantes sobre la expresión de CXCL8 o sus receptores. Por lo tanto, nuestras observaciones de que el antagonista de CXCR2 no tuvo ningún efecto sobre la sensibilidad de las células a pemetrexed puede relacionarse a la ausencia de un aumento de pemetrexed inducida en la señalización de CXCL8 y /o refleja que la señalización de CXCL8 no puede regular el espectro más amplio de objetivos cuya actividad es modulada por pemetrexed. Aunque las células PC3 eran sensibles y respondieron favorablemente al tratamiento con pemetrexed, los estudios de fase II en pacientes no han logrado proporcionar el estímulo para el uso de este agente como una segunda línea de quimioterapia para metastásico CRPC, lo que sugiere que otros mecanismos de resistencia correspondientes a este medicamento están en juego en este ajuste de la enfermedad [21], [22].
señalización de CXCL8 es una señal importante pro-inflamatoria en varios tumores sólidos incluyendo cáncer de mama y colorrectal [23], [24], enfermedades en las que el 5-FU es Actualmente utilizado o recomendado como estándar de atención para la enfermedad metastásica.